TD-PCR技术用于肠道病毒71的检测

目的评价降落聚合酶链反应（touchdown PCR,TD—PCR）检测肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）的效能和敏感性。方法根据touchdown原理设计TD-PCR程序,试验选择PCR最佳反应条件,分别与普通PCR及TD—PCR、普通Taq酶与热启动酶扩增效果进行比较．并利用10倍稀释法检验TD—PCR方法的灵敏度。琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物,纯化后DNA产物测序验证该方法的特异性。结果TD—PCR的扩增片段条带清晰．检测效果明显优于普通PCR,使用普通Taq酶的TD—PCR比使用热启动酶有更优的性价比,测序证实了此组片段的特异性．cDNA的最低检测浓度为1．031μg／mL。结论成功建立TD—PCR检测EV71的方法,使用普通Taq酶获得理想的检测结果,为快速检测手足口病的病原体提供了可靠的手段。     

梅州市2010-2011年手足口病病原学流行特征分析

目的 了解梅州市手足口病病原学流行情况,为手足口病控制和治疗提供科学依据.方法 对2010-2011年梅州市手足口病哨点病原学监测医院的手足口病病例采集粪便标本,提取标本中的核酸,采用实时荧光定量PCR方法扩增病毒的特异性片段,检测总肠道病毒、EV71和CoxA16核酸.结果 255份手足口病临床诊断病例的粪便标本中,总肠道病毒、EV71和CoxA 16病毒核酸检出率分别为72.55％、40.39％和11.37％,其中EV71和CoxA16核酸检出率差异有统计学意义(x2=55.97,P＜0.01).发病以5-7月高发,占48.65％,有较明显的季节性分布.男性总肠道病毒核酸检出率高于女性(x2=10.24,P＜0.01),但不同性别间的EV71和CoxA16病毒核酸检出率差异均无统计学意义(x2=0.01、0.69,均P＞0.05).结论 EV71是梅州市2010-2011年手足口病的主要病原体.今后应加强手足口病流行特征和病原谱的动态研究,以进一步掌握手足口病流行规律.     

深圳市坪山新区2010年手足口病疫情的病原学检测分析

目的 了解深圳市坪山新区手足口病(hand-food-mouth disease,HFMD)疫情的病原学情况,为疫情的控制和病例的治疗提供科学依据.方法 对手足口病病例采集粪便或咽拭子标本,提取标本中的核酸,采用实时荧光定量PCR方法扩增病毒的特异性片断,检测EV71和CA16核酸.结果 在19起手足口病疫情56例病例中,共采集31例病人标本.其中18起由EV71引起,另1起由CoxA16引起,构成比分别为94.74%和5.26%;3例重症病例(其中1例死亡)EV71阳性;EV71和CoxA16采样阳性率分别为38.71%(12/31)和6.45%(2/31),两者间差异有显著性;EV71和CoxA16核酸均阴性者占54.84%(17/31);不同性别间EV71和CoxA16感染率无显著性差异;疫情主要集中在4、5、6月份;3-6岁幼托儿童为主.结论 EV71是2010年深圳市坪山新区手足口病疫情以及重症病例的主要病原体.     

龙门县2009年手足口病病原基线调查

目的：了解惠州市龙门县2009年引起手足口病的病原体分型,为保护不同人群特别是高危人群的健康提供科学理论依据。方法：采用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）方法,采集临床诊断为手足口病患者的咽拭子、肛拭子、疱疹液及粪便等标本进行肠道总病毒、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型核酸检测;运用描述性流行病学研究方法分析龙门县手足口病流行病学特征。结果：从46例手足口病患者中共采集90份标本,经Real-timePCR检测,84份肠道总病毒阳性,阳性率为93.33%;5份为肠道病毒71型（EV71）阳性,阳性率为5.56%;68份为柯萨奇病毒A16型（CoxA16）阳性,阳性率为75.56%;CoxA16和EV71两者阳性率之比为13.6：1。结论：从该组手足口病患儿检测到的病原体以CoxA16感染为主,其次是EV71,开展手足口病流行病学和病原学研究,为制定更好的预防控制措施提供实验依据。     

广西746例疑似肠道病毒感染病例病原学监测分析

目的了解广西肠道病毒的感染情况,为制定预防和控制肠道病毒感染策略提供依据。方法采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,对广西746例疑似肠道病毒感染者咽拭子、疱疹液和粪便标本共1062份进行肠道病毒、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）核酸检测。结果共检出485份肠道病毒核酸阳性,阳性率为45.67％,其中EV71核酸阳性187份,阳性率为17.61％,40份为CoxA16核酸阳性标本,阳性率为3.77％。结论1062份标本中EV71核酸的阳性率高于CoxA16;粪便和疱疹液标本的阳性检出率高于咽拭子标本的阳性检出率;CoxA16和EV71是引起儿童手足口病的主要病原体,要加强对CoxA16和EV71的的鉴别诊断。     

环介导等温扩增法快速检测手足口病病原体

目的:建立逆转录(RT)-环介导等温扩增方法(LAMP),以快速检测手足口病最重要的两种病原体:肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CA16)。方法:收集手足口病患儿咽拭子标本93份,针对EV71和CA16病毒的VP1基因特异性序列8个区域各设计6条LAMP引物,分别于63℃(EV71)、65℃(CA16A)扩增1 h,日光下观察结果,与实时荧光定量PCR比较检测特异性和敏感性。结果:EV71、CA16的LAMP最低检测限均为500拷贝/管,与对照病毒无交叉反应。93份标本中,RT-PCR方法检测显示EV71阳性44例,CA16阳性36例;RT-LAMP方法检测显示EV71阳性46例,CA16阳性36例,两种方法间比较差异均无统计学意义(P0.05)。结论:应用RT-LAMP检测手足口病病原体EV71、CA16快速、灵敏、经济、特异性高,适合在基层医疗机构推广应用。     

双重实时荧光PCR在手足口病快速检测中的应用

目的 探讨双重实时荧光PCR 技术检测手足口病肠道病毒的应用效果.方法 用单一实时荧光PCR先检测标本中的肠道病毒通用病毒核酸,肠道病毒通用病毒核酸阳性再分别用双重实时荧光PCR及单一实时荧光PCR检测CoxA16型和EV71型特异性核酸,比较两种方法检测结果.结果 240份标本中肠道病毒通用型核酸阳性157份,双重实时荧光PCR法CoxA16阳性111份,EV71阳性1份,其他肠道病毒45份,单一实时荧光PCR法CoxA16阳性109份,EV71阳性1份,CoxA16+EV71阳性2份,其他肠道病毒45份.EV71和其他肠道病毒符合率为100%.结论 双重实时荧光PCR 检测技术可以准确检测手足口病肠道病毒,且特异性强、灵敏度高,又可以快速得到检测结果,是一种快速检测手足口病病毒的方法.     

2009-2011年广州市手足口病病原学分析

目的了解2009-2011年广州市手足口病病例标本中病原学分类情况。方法采集临床诊断为手足口病患者的粪便、咽拭子及肛拭子标本,用荧光定量PCR法同时检测总肠道病毒、CoxA16和EV71。结果广州市手足口病的流行每年有1个高峰和1个次高峰。第1个高峰4～8月的病原体为CoxA16、EV71和其他肠道病毒同时存在,次高峰为11月～次年1月,病原体主要为CoxA16。结论 CoxA16、EV71和其他肠道病毒为广州市近年手足口病的主要病原。     

福州地区2010年手足口病病原监测分析

目的了解2010年福州市手足口病的病原体型别及分布特征,为制订预防控制措施提供科学依据。方法采集974份手足口临床诊断病例的咽拭子、肛拭子(粪便)等样本,应用实时荧光RT-PCR法检测EV71和CoxA16病毒核酸。结果共检测974份标本,其中EV71阳性434份,占标本总数的44.56%;CA16阳性123份,占标本总数的12.63%。手足口病发病4月呈现上升,6月达发病高峰,9月又达一小高峰。仓山区、晋安区病例较多。结论手足口病在福州市分布广,引起福州市2010年手足口病的主要病原体为EV71。     

2009年海南省手足口病样本病原学检测结果分析

目的明确引起海南省2009年手足口病（Hand-foot-mouth disease,HFMD）暴发流行的主要病毒型别,为手足口病病例诊断和制定防控措施提供病原学依据。方法依据卫生部发布的《手足口病预防控制指南》（2009年版）附件1,提取手足口病临床诊断病例各种样本中的病毒核酸,用肠道病毒通用引物、肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxA16）特异性引物进行逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光-聚合酶链式反应（real-time PCR）。核酸检测阳性的原始样本接种人横纹肌肉瘤细胞（RD细胞）进行肠道病毒分离培养。结果海南省2009年各市县采集的1 085份手足口病样本中EV71、CoxA16和其它肠道病毒核酸阳性率分别为23.13%、1.57%和9.59%,不同类型病例的肠道病毒核酸阳性率分别为死亡病例55.56%（10/18）,重症病例36.07%（145/402）,普通病例32.63%（217/665）。不同类型样本肠道病毒核酸检测阳性率不同,肛拭子和粪便阳性率达到49.62%,疱疹液检测阳性率为43.84%,鼻咽拭子的检测阳性率为22.89%。结论引起海南省2009年手足口病暴发流行的主要病原是EV71,其次为CoxA16。应继续加强手足口病的病原学监测,掌握病毒型别变化趋势,更好地为手足口病防控工作提供技术支持。     

改良的降落PCR扩增中国地鼠目的基因

目的优化PCR程序，尝试用降落PCR扩增中国地鼠目的基因。方法设计了4对引物，用普通PCR和改良的降落PCR扩增中国地鼠COX1、COX2、NADH5、NADH6部分基因。结果普通PCR只有1对引物扩增出特异性条带，而降落PCR4对引物都扩增出特异性条带，并与中国地鼠目的基因大小一致。结论降落PCR省略了常规PCR中摸索最适退火温度的过程，对中国地鼠一些Tm值相近的基因可以使用降落PCR温度程序扩增，是一种行之有效的PCR方法。     

降落PCR扩增人类常染色体STR D15S128

目的优化PCR程序,尝试用降落PCR扩增人类常染色体STRD15S128。方法用普通PCR和降落PCR扩增人类常染色体STRD15S128。结果普通PCR扩增产物有非特异带,降落PCR无非特异带。结论降落PCR简化了普通PCR中摸索最适退火温度的过程,可以一步找到人类常染色体STRD15S128的退火温度,是一种高效率的PCR方法。     

PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究

目的探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法（PCR-RFLP）检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法在PCR实验中,运用降落PCR（touchdown PCR,TD-PCR）方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8μmol/L、0.6μmol/L、0.4μmol/L和0.32μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5μL、10μL、15μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 （1）降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;（2）引物浓度为0.4μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;（3）10μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;（4）在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD-PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20μL的体系中加10μL产物和10 U内切酶,37℃消化4 h.     

Whole CanA Gene Amplification of Helicobacter pylori and Its Fingerprinting by Restriction Fragment Length Polymorphism

To set up a method of amplification for the whole CagA gene of Helicobacter pylori and its fingerprinting by restriction fragment length polymorphism(RFLP),nested PCR was employed in combination with TD-PCR to amplify the gene and EcoRI and Hind Ⅲ were used to generate the RFLP fingerprinting.Target DNA fragments from 13 of 20 samples were successfully amplified and the relevant RFLP fingerprintings were obtained.It is concluded that the method can be used to amplify the whole CagA gene and CagA gene has apparent diversity of RFLP profile.     

中国株乙型肝炎病毒全基因组克隆的制备与鉴定

目的：扩增全长HBV DNA基因组，建立中国株HBV感染性克隆，阐述HBV基因组变异对其不同基因生物学特性影响。方法：TD－PCR和XL－PCR技术一次扩增HBV全长基因组，克隆，PCR、酶切和测序鉴定，结果：通过PCR、酶切，测序鉴定和真核细胞转染分析，获得全长HBV基因组克隆。结论：获得了HBV全基因组克隆，在真核细胞中可以表达HBsAg，为建立HBV感染性克隆奠定物质基础。     

PCR-STR和PCR-SSCP方法对苯丙酮尿症基因诊断的意义

①目的 探讨苯丙酮尿症的基因诊断方法。②方法 采用聚合酶链反应－短串联重复序列（PCR－STR）连锁分析技术和聚合酶链反应－单链构象多态（PCR－SSCP）分析技术,对5个苯丙酮尿症家系中17个成员的苯丙氨酸羟化酶基因突变进行分析。③结果 用PCR－STR法能准确进行基因诊断的家系3个,50％能排除诊断的家系3个;用PCR－SSCP法检出3例已知突变。④结论 联合应用PCR－STR和PCR－SSCP技术可以提高苯丙酮尿症的基因诊断率。     

用RT-PCR对mRNA进行定量分析

编码蛋白质的mRNA通过反转录酶的作用，将mR－NA反转录成cDNA，再通过PCR扩增，DNA产物得到指数形式的增加．在一定循环数内，PCR产物的量与其模板cD－NA，也就是相应mRNA的浓度有关．PCR产物电泳后掺入溴化乙锭，可通过扫描荧光强度来确定PCR产物的量．通过优化实验条件，可计算出所检测的mRNA的相对含量．     

伤寒杆菌聚合酶链反应检测方法

目的 探讨聚合酶链反应快速检出血培养物中的伤寒杆菌。用于伤寒杆菌菌血症的诊断．方法 根据伤寒杆菌鞭毛抗原基因ＤＮＡ核苷序列设计特异性革酸引物,应用聚合酶链反应技术快速检出血培养物中的伤寒杆菌。结果 对伤寒杆菌和７株非伤寒要直菌,同时进行ＰＣＲ增,结果只有伤寒杆菌出现４５８ｂｐ的牧场划性扩增区带,其他７株非伤寒 杆菌均未出现４５８ｂｐ的扩增菌悬液进行扩增,结果表明,在１００个菌细胞时即可扩增出明显的     

多发性骨髓瘤中人类疱疹病毒8型的定量分析及其相关基因的表达

目的 确定多发性骨髓瘤（MM）骨髓活检标本中是否存在人类疱疹病毒8型（HHV8）感染,病毒负荷量的差异与临床表现之间的关系。方法 实时荧光定量PCR确定骨髓活检标本中的HHV8病毒的负荷量,采用筑巢式PCR扩增患者外周血、骨髓穿刺和骨髓活检标本中HHV8 KS330233Bam片段,用逆转录－PCR方法了解HHV8病毒的致病基因病毒源白细胞介素－6（vIL-6)和病毒源干扰素调节因子－1（vIRF-1)的表达情况。结果 多数MM患者的骨髓活检标本可检出HHV8,荧光定量PCR发现阳性率为69．6％（16／23）;筑巢式PCR时的阳性率为82．6％（19／23）,骨髓穿刺和外周血标本的阳性率分别为4％（1／25）和0。临床分析表明病毒的检出可能与化疗有关。vIRF-1在骨髓活检标本中表达率很高,为83．3％（10／12）, vIL-6的表达率为0。结论 多发性骨髓瘤和HHV8感染有关,高表达的vIRF－1在多发性骨髓瘤发病的过程中可能起一定的作用。     

聚合酶链反应对耐甲氧西林葡萄球菌的监测

为了解同济医院临床各科室分离的金黄色葡萄球菌对甲氧西林类抗生素耐药性的状况，收集同济医院临床各科室1999年分离的金黄色葡萄球菌84株，通过设计的引物，利用扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA基因，用地高辛标记的特异性探针与PCR扩增产物杂交。84株金黄色葡萄球菌中获得8株扩增产物为阳性的菌株，用这些阳性产物与地高辛标记的探针进行Southern blot分析，杂交结果与PCR结果一致，故同济医院1999年金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药率为8．8％。将聚合酶链反应技术用于检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）其敏感性、特异性较高且重复性好，准确率比实验室常用纸片法更高，为指导临床应用抗生素提供了一个切实可行的方法。