丙型肝炎病毒核心蛋白基因的表达载体构建及在酵母中的表达

目的：为探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心（core）蛋白的功能，在真核生物酵母细胞中表达HCV核心蛋白基因。方法：用多聚酶链反应（PCR）的方法在HCV全长质粒pBRTM／HCV为膜板扩增HCV核心蛋白基因，克隆到pGEM－T载体中，双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HCV核心蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了HCV核心蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量22000ku左右。结论：HCV核心蛋白在酵母中表达成功。     

转醛醇酶在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达及其亚型的分离和鉴定

目的：研究转醛醇酶在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达并分离鉴定其亚型，方法：应用SDS－聚丙烯酰胺胶电泳（SDS－PAGE）、蛋白免疫印迹（Western bloting)对转醛醇酶在不同发育阶段小鼠睾丸中的表达进行半定量分析，同时利用双向电泳免疫印变技术分离，鉴定转醛醇酶的亚型。结果：（1）转醛醇酶在生后1周小鼠睾丸中表达量平均比成年高47．8％（P＜0．005）。（2）双向电泳Wester blotting示小鼠睾丸转醛醇酶共有10余个亚型，生后1周小鼠睾丸中a8亚型表达量极低，而在成年小鼠睾丸中a8亚型高表达。结论：（1）生后1周小鼠生长发育快，合成代谢旺盛，转醛醇酶基因绝对表达量高。（2）a8亚型可能与生殖功能（精子发生、睾酮生成）密切相关。     

Annexin32的酵母表达及免疫原性分析

目的：在毕赤酵母中表达Annexin32并研究其功能。方法：用G418法快速筛选出的9个高拷贝转化子，经平板培养法（MD和MM）及PCR鉴定表型后，分别在BMMY、BMM、MM3种培养基中以甲醇诱导表达，培养上清行SDS－PAGE和Western印迹鉴定，用（NH4）2SO4＋PI法沉淀，过FPLC－Superdex75分子筛纯化蛋白并以此免疫小鼠。结果：有两个表型为Mut^a的高拷贝转化菌表达量较高，以BMMY为优，表达产物有两条带，相对分子质量分别约为3.8万和4万，占分泌总蛋白的80％以上，产物浓度为200－350mg/L。Western印迹证实两条表达产物均具有天然Annexin32分子的免疫原性。动物实验证明，酵母表达的Annexin32的免疫原性明显高于原核表达者。结论：在毕赤酵母中成功表达了Annexin32，为进一步研究打下了基础。     

酸枣仁与缅枣仁的蛋白质分析

目的：初步探讨酸枣仁与缅枣仁的蛋白质差异。方法：用凯氏定氮法测定蛋白质的含量；用酸水解法测定蛋白质的氨基酸组成；用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）和毛细管区带电泳（CZE）分析蛋白质的组分。结果：酸枣仁与缅枣仁的蛋白质含量分别为36．13％和41．58％；除缅枣仁蛋白质的缬氨酸和蛋氨酸明显高于酸枣仁外，蛋白质的其他氨基酸的组成差别不明显；SDS－PAGE图谱明显不同的是，酸枣仁有相对分子质量为39800的蛋白质，缅枣仁为50100的蛋白质；CZE图谱的区别是，酸枣仁为3．1min的峰，缅枣仁含有一个迁移时间为4．8min的峰。结论：缅枣仁的蛋白质含量较酸枣仁略高，且缬氨酸和蛋氨酸的含量明显高于酸枣仁。两种枣仁的SDS－PAGE和CAE图谱均有明显的差异存在。     

抗癌胚抗原微型抗体基因是在昆虫细胞中的表达

目的 获得生物活性更高的癌胚抗原（CEA）微型抗体用于放免显像。方法 将抗癌胚抗微型抗体基因插入昆虫杆状病毒供体质粒pFastBacHTb中,经大肠杆菌DH10Bac体内转座,产生重组杆状病毒BacHT-VH－L,将其转染粉纹夜蛾（Tn-5Bl-4）细胞,经扩增后在细胞内进行表达。结果 SDS－PAGE分析结果表明、在Tn-5Bl-4细胞中表达产生一条特异性蛋白质,其分子量为26kb左右;以Western blot分析表明,该特异条带即为VH－L蛋白。RIA表明重组杆状病毒表达产生的VH－L蛋白能特异性的结合CEA,较大肠杆菌表达物活性更高。结论 昆虫细胞表达可制备生物活性更高的癌胚抗原微型抗体。     

重组变形链球菌V+蛋白的表达和纯化

目的：探讨变形链球菌表面蛋白可变区（V＋）基因在大肠杆菌中高效诱导表达及其表达产物的进一步纯化。方法：将V＋基因以C端融合6个组氨酸的形式在E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。His6融合表达产物经金属离子（Ni^2 )融体亲和层析分离纯化，SDS－PAGE电泳和Western blot印迹分析表达产物。结果：SDS－PAGE分析确定有与His6融合表达产物（His6-rV )理论相对分子质量一致的诱导表达条带，其表达量占全菌蛋白的20％左右，表达产物以可溶形式存在。进一步纯化目的蛋白，纯度可达90％。Western blot实验表明表达产物具有良好的抗原性。结论：His6融合表达载体可以高效地表达和纯化重组V＋蛋白。     

人白细胞介素-18在大肠杆菌中的高效表达

目的 在大肠杆菌中实现人IL－18成熟蛋白（mhIL-18）的高效表达。方法 采用RT－PCR由人肝脏Kupffer细胞中扩增mhIL-18基因，构建非融合型原核表达质粒petTT/mhIL-18，转化至大肠杆菌DH5α，用IPTG诱导热处理重组蛋白表达，超声裂解细胞提取包涵体，采用SDS－PAGE及Western blot分析重组蛋白的表达，包涵体蛋白经8mol/L尿素溶解，透析复性，ELISA检测重组蛋白诱导人外周血单个核细胞（PBMC）产生IFN－γ的能力。结果 所扩增的mhIL-18基因与GenBank公布的序列一到，经IPTG诱导，mhIL-18在大肠杆菌中的表达量占菌体蛋白的40％以上，，在细胞中以包涵体形式存在，复性的重组蛋白具有诱生IFN-γ的能力。结论 mhIL-18可在大肠杆菌中高效表达。     

膀胱癌相关蛋白对宫颈癌细胞的影响及其在细胞周期信号传导网络中的作用

目的：探讨膀胱癌相关蛋白（ BLCAP）发挥抑癌功能的分子机制及其在细胞周期信号传导网络中的作用和地位。方法应用分子克隆技术,构建BLCAP真核表达重组质粒pEF－BLCAP－3×Flag,原核表达重组质粒pGEX－KG－BLCAP和pET－32a－BLCAP。应用瞬时转染、RT－PCR和Western blot检测BLCAP的过表达引起的相关信号分子在mRNA和蛋白水平的表达差异。应用免疫共沉淀和免疫印迹技术检测和确定能与BLCAP相互作用的蛋白分子。采用大肠杆菌体外表达系统,诱导表达并纯化回收BLCAP融合蛋白,并做SDS－PAGE和Western blot分离、鉴定,大量制备留存备用。结果构建带有Flag标签的真核表达重组质粒pEF－BLCAP－3× Flag,带有GST标签的原核表达重组质粒pGEX－KG－BLCAP及带有His标签的原核表达重组质粒pET－32a－BLCAP,并经PCR、双酶切和测序鉴定,确定其插入序列和开放读码框均正确无误。 RT－PCR结果显示在转染BLCAP基因的细胞中,BLCAP的mRNA水平高表达的同时,抑癌基因Rb1的mRNA水平也显著提高。 Western blot结果证实,BLCAP过表达时,RB1蛋白的水平也明显增高,但磷酸化RB蛋白的表达水平无明显差异。免疫共沉淀和免疫印迹结果证实,在生理水平,BLCAP能够与RB1结合,同时也能与磷酸化的RB结合。利用大肠杆菌表达系统大量表达和纯化回收BLCAP融合蛋白,经SDS－PAGE和Western blot检测确为我们所需的目的蛋白。结论 BLCAP很可能通过与细胞周期调控蛋白RB1的作用而使得细胞无法通过G1／S checkpoint,从而发挥其抑制细胞生长和诱导凋亡的功能。     

蜜蜂毒中蜂毒素的分离纯化方法及含量测定

目的：从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素（melittin),建立以SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS－PAGE）及HPLC进行蜂毒素定性定量分析的方法。方法：用Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75三步层析法从蜜蜂毒中分离纯化蜂毒素,以SDS－PAGE定性,以HPLC进行含量测定。结果：样品经SDS－PAGE测定为单一条带,相对分子质量约3000。HPLC含量测定,平均回收率为95．97％,相对标准差（RSD）为1．07％。结论：以上述分离纯化法可制得高纯度的蜂毒素,检测方法准确、可靠、简单。     

非放射性Western印迹技术改进的研究

应用不同蛋白质复性剂、封闭剂和标记物的对比方法以探讨Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术的改进。结果表明：①经ｙ（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）＝０．３％，５ｍｉｎ和ＳＢＢ ２０ｍｉｎ的蛋白质复性处理后，可使第一免疫血清稀释度１：１００改为１：１０００使用；②应用ｙ（Ｔｗｅｅｎ ２０）＝０．０５％作为封闭液效果最好；③金标法及酶标法都可用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹技术，酶标法主要清晰，而金标法灵敏度高。     

hEOLA1抗体的制备及肿瘤组织中EOLAl的表达检测

目的 制备抗EOLA1多克隆抗体并检测其在肿瘤组织中的表达.方法 采用原核表达获得EOLA1蛋白,纯化后作为抗原免疫大白兔,获得兔抗人EOLA1(hEOLA1)多抗血清.进行免疫组化检测人多肿瘤芯片上EOLA1的表达.结果 制备了高滴度的hEOLA1多克隆抗体,免疫组化显示EOLA1蛋白在肺癌、结肠癌、胃癌和肝癌仅表达于肿瘤问质.肿瘤细胞本身未见表达,而在胶质瘤和乳腺癌则早广泛表达.结论 EOLA1可能在胶质瘤和乳腺癌的发生、发展方面起着重要作用.     

6,8-二-三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素抑制酪蛋白激酶诱导人卵巢癌CoC1细胞凋亡

目的:研究6,8-二-三氟甲基-7-乙酰氧基白杨素(9dFMAChR))抑制体外培养人卵巢癌细胞系CoC1细胞增殖和诱导凋亡作用及机制。方法:体外培养CoC1细胞,MTT比色法测定dFMAChR对CoC1细胞增殖活性的影响;AO/EB染色法荧光显微镜观察dFMAChR诱导CoC1凋亡细胞的形态学改变;DNA凝胶电泳确证dFMAChR诱导CoC1细胞凋亡作用;Western blotting法分析dFMAChR对CoC1细胞酪蛋白激酶CK2α蛋白表达和活性的影响。结果:MTT比色法结果显示,dFMAChR有效抑制CoC1细胞增殖活性,呈剂量依赖性;其IC50值为11.8μM。AO/EB染色荧光显微镜观察dFMAChR处理后,部分CoC1细胞呈现典型凋亡细胞形态特征;dFMAChR(10.0μM)处理CoC1细胞48 h,琼脂糖凝胶电泳出现“梯形”DNA条带。Western blotting分析结果表明:dFMAChR下调酪蛋白激酶CK2α表达,呈浓度和时间依赖性。结论:dFMAChR具有抑制人卵巢癌CoC1细胞增殖和诱导细胞凋亡作用;作用机制与其抑制酪蛋白激酶CK2α表达有关。     

蛋白质组学筛选抑癌基因CCDC19在鼻咽癌中的调控蛋白

目的本研究利用蛋白质组学筛选抑癌候选基因CCDC19在鼻咽癌中可能调控蛋白。方法提取CCDC19稳定高表达的鼻咽癌3D8和对照鼻咽癌C6细胞蛋白,并采用双向凝胶电泳(2D-PAGE)技术进行有效分离,图像扫描后获得高分辨率的2D-PAGE图谱。选用差异蛋白质组学技术筛选差异蛋白位点,然后用肽质量指纹谱(peptide mass fingerprinting,PMF)和数据库检索技术给予鉴定。荧光定量PCR和Western blot验证差异基因表达水平。结果质谱分析显示,FASN、CTSD和PGK1在CCDC19过表达的3D8细胞中表达下调,分别为-3.28、-1.64和-6.97倍。荧光定量PCR在mRNA水平验证了FASN、CTSD和PGK1以及Western blot在蛋白水平验证CTSD蛋白在3D8细胞中表达下调。结论 FASN、CTSD和PGK1可能是CCDC19在鼻咽癌中调控的靶基因。     

Proteomic analysis identifies translationally controlled tumor protein as a mediator of phosphatase of regenerating liver-3-promoted proliferation, migration and invasion in human colon cancer cells

Background  Considerable evidence suggests that phosphatase of regenerating liver-3 (PRL-3) plays multiple roles in cancer metastasis; however, the molecular mechanisms remain largely unknown. The aim of this study was to identify proteins associated with PRL-3-promoted colon cancer metastasis, by comparative proteomic analysis.

Methods  Proteomes of human colon cancer LoVo cells transfected with PRL-3 gene (LoVo-PRL-3) or empty vector PAcGFP-C3 (LoVo-control) were compared using 2D gel electrophoresis. Proteins that varied significantly in concentration were selected and identified using mass spectrometry. Expression of translationally controlled tumor protein (TCTP) mRNA and protein in LoVo-PRL-3 and LoVo-control cells was detected by real-time PCR and Western blotting. Small interfering RNA (siRNA) targeting TCTP was used for silencing TCTP expression in LoVo-PRL-3 cells. Functional significance of TCTP in PRL-3-promoted colon cancer cell proliferation, migration and invasion was investigated by Cell Counting Kit-8 assay and transwell chamber.

Results  Seventeen proteins displaying significant and reproducible differences between LoVo-PRL-3 and LoVo-control cells were identified. Ten proteins were upregulated and seven were downregulated in LoVo-PRL-3 cells when compared with LoVo-control cells. Eight identified proteins are associated with distinct steps of tumor metastasis: ubiquitin-like protein ISG15, interleukin-18, TCTP, serpin B5, annexin A3, macrophage-capping protein, ATP-dependent RNA helicase DDX3X, and cathepsin D. Real-time PCR and Western blotting results showed that both TCTP mRNA and protein were significantly increased in LoVo-PRL-3 cells compared to LoVo-control cells. Transfection with TCTP siRNA significantly reduced the expression of both mRNA and protein levels of TCTP in LoVo-PRL-3 cells. Knockdown of TCTP by siRNA inhibited PRL-3-promoted proliferation, migration and invasion of LoVo-PRL-3 cells.

Conclusion  Our results imply that TCTP might be a mediator of PRL-3-promoted proliferation, migration and invasion of human colon cancer cells.

     

蛋白印迹技术的优化

蛋白印迹是细胞和分子生物学研究中重要的一种实验技术。利用蛋白印迹技术可以检测细胞或组织裂解液中的特异性蛋白,特别是微量蛋白的检测,并进行定性及定量的分析。自1979年科学家发明了将蛋白质通过凝胶电泳移植到生物膜后,蛋白印迹技术得到了极大的发展,目前科学界有各种形式的印迹方法。我们就如何优化蛋白印迹提高成功率做一介绍。     

雷帕霉素靶蛋白信号通路介导转化生长因子-β2诱导的后发性白内障的分子机制研究

目的：探讨雷帕霉素靶蛋白（ mammalian target of rapamycin , mTOR）信号通路与转化生长因子（ transforming growth factor ,TGF）-β2诱导的晶状体上皮细胞间质化的相关机制。方法显微镜观察TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞的表型变化,Western blot进一步验证TGF-β2诱导的HLEB-3上皮间质转化模型。 MTT检测TGF-β2诱导上皮间质化后以及雷帕霉素对细胞增殖的影响。 Western blot在分子水平检测上皮间质化和mTOR信号通路之间的机制关联。结果加入TGF-β2诱导处理24 h后,用显微镜观察HLEB-3的细胞形态由椭圆形变为星形或纺锤形,细胞连接减少。 Western blot检测发现TGF-β2诱导后的HLEB-3中上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达水平明显降低,而间质细胞标记蛋白α-SMA的表达水平显著降低,差异有统计学意义（P＜0．05）。 MTT检测发现雷帕霉素预处理可以抑制TGF-β2对上皮细胞增殖的促进作用。 Western blot显示当用雷帕霉素抑制mTOR信号通路的激活后,可以逆转TGF-β2对α-SMA的表达的上调作用,促进上皮细胞标志蛋白E-cadherin的表达。结论 mTOR信号通路介导TGF-β2诱导的上皮细胞间质化作用,促进后发性白内障的发生。     

敲低Fascin抑制宫颈癌细胞增殖及裸鼠的成瘤能力

目的研究敲低Fascin对宫颈癌细胞增殖及裸鼠成瘤能力的影响。方法Fascin siRNA慢病毒（干扰组）和阴性对照慢病 毒（阴性组）感染宫颈癌CaSki细胞,用qRT-PCR和Western blot方法检测Fascin mRNA以及蛋白表达水平评价干扰效果。MTT 方法测定Fascin 敲低对CaSki细胞增殖能力的影响。取对照组、阴性组、干扰组CaSki细胞接种至裸鼠皮下,建立裸鼠移植瘤模 型,测定移植瘤生长体积和质量,Western blot方法检测移植瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）、survivin、细胞周期依赖性蛋白 激酶4（CDK4）、p21 蛋白水平。结果Fascin siRNA慢病毒感染后的CaSki 细胞中Fascin mRNA和蛋白水平低于没有感染的 CaSki细胞（P<0.05）。阴性对照慢病毒感染对CaSki细胞中Fascin mRNA和蛋白水平没有影响。敲低Fascin后的CaSki细胞增 殖能力明显降低（P<0.05）。干扰组CaSki接种的裸鼠移植瘤体积和质量也降低,移植瘤组织中PCNA、survivin、CDK4蛋白水平 降低,p21蛋白水平升高。阴性组CaSki细胞接种对细胞增殖、裸鼠成瘤能力及移植瘤中PCNA、survivin、CDK4、p21蛋白水平 没有影响。结论敲低Fascin 能够抑制宫颈癌细胞生长和裸鼠成瘤能力。     

小鼠HuR真核表达载体构建及对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响

目的 构建小鼠同源的人抗原R (HuR)基因真核表达载体,观察HuR过表达对Lewis肺癌(LLC)细胞增殖和侵袭的影响.方法 从LLC细胞中抽提总RNA,RT-PCR扩增HuR cDNA,基因工程方法将PCR片断克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点.重组质粒经EcoRI和SmaI双酶切鉴定和测序后,使用LipofectamineTM2000转染LLC细胞.Western blotting检测HuR在细胞中的表达.MTT和Transwell系统分别检测细胞增殖和侵袭能力.结果 经酶切、测序鉴定,小鼠HuR基因正确插入到pEGFP-N1的多克隆位点,获得pEGFP-HuR;Western blotting显示转染组与未转染组比较,HuR蛋白表达、LLC细胞增殖能力和侵袭能力均显著增强.结论 HuR过表达可提高肿瘤细胞的增殖和侵袭能力.     

维甲酸诱导基因G抑制肿瘤细胞增殖的分子机制研究

目的探讨维甲酸诱导基因G（RIG—G）抑制肿瘤细胞增殖的分子机制。方法应用转染实验、Western印迹法、免疫共沉淀和免疫荧光共定位等技术验证RIG—G蛋白与JAB1蛋白之间的相互作用,并研究RIG—G蛋白对JAB1蛋白功能的影响。结果RIG—G蛋白可以与JAB1蛋白发生相互作用,并影响JAB1蛋白在细胞内的定位和分布。实验发现,在NIH3T3细胞中单独转染JAB1时,JAB1蛋白在细胞核和细胞质内呈弥散分布,而当与RIG—G共同转染后,JAB1蛋白在细胞核内的含量明显减少,而改变为主要在胞质内分布,并与RIG—G蛋白发生部分共定位。此外,RIG—G蛋白还具有抑制JAB1对细胞周期抑制因子p27的辅助降解功能。结论RIG—G可以通过和JAB1的相互作用,使后者部分滞留在细胞质内,从而影响JAB1发挥正常功能,干扰其对p27的辅助降解,维持细胞内p27的稳定性,促进细胞退出增殖周期,抑制细胞增殖。     

马齿苋醇提取物对结肠癌细胞及其干细胞体外增殖作用的机理研究

目的探讨马齿苋醇提取物对结肠癌细胞及其干细胞体外增殖能力的影响及其作用机制。方法对结肠癌干细胞进行无血清培养,CCK-8法测定不同浓度马齿苋醇提取物对结肠癌HT-29细胞及HT-29干细胞的生长抑制情况,流式细胞仪检测其对HT-29细胞及其干细胞的凋亡情况及对细胞周期的影响。RT-PCR法以及Western blot分析马齿苋醇提取物对HT-29细胞及其干细胞Notch、Wnt双信号通路中Notch1、Notch2及β-catenin基因及蛋白表达的影响。结果马齿苋醇提取物对HT-29细胞及HT-29干细胞增殖有抑制作用,其作用时间、剂量与细胞增殖抑制率呈正相关,且对HT-29细胞增殖的抑制作用及凋亡率的影响较HT-29干细胞显著(P0.05)。马齿苋醇提取物可下调HT-29细胞及其干细胞Notch1、β-catenin基因表达,并下调Notch1、Notch2及β-catenin蛋白表达(P0.05)。结论马齿苋醇提取物可以通过下调Notch-1、Notch-2、β-catenin蛋白的表达发挥体外抑制结肠癌细胞及其干细胞增殖的作用。