大鼠Clara细胞分泌蛋白CC16基因的克隆和原核表达及纯化

目的 克隆大鼠Clara细胞分泌蛋白(CC16)基因,原核表达并纯化重组的CC16蛋白,为进一步研究CC16蛋白的功能及对炎症性气道疾病的治疗作用奠定基础.方法 制备大鼠肺组织总RNA,根据大鼠CC16基因全长编码序列(GenBank登录号:NM_013051)的开放阅读框设计引物并进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli DH5α),阳性菌落经PCR和双酶切鉴定并测序.将重组质粒pET30a(+)-rCC16转化至E coli Rosetta(DE3)并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,重组融合蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和纯化.分别以抗His标签抗体和山羊抗CC16抗体进行免疫印迹(Western blotting)分析并鉴定重组蛋白.结果 RT-PCR扩增产物约为290 bp.菌落PCR、双酶切及测序结果显示,重组质粒pET30a(+)-rCC16构建成功.SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约16 kDa的可溶性重组蛋白.Western blotting结果表明,诱导表达的蛋白质为带His标签的重组融合蛋白,且能被山羊抗CC16抗体识别.结论 成功构建基因重组体pET30a(+)-rCC16,并制备出可溶性大鼠重组CC16蛋白.     

人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及原核表达

目的 构建人可溶性肿瘤坏死因子受体1基因的重组质粒，进行原核表达。方法 以Hela细胞的总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及原核表达载体pMAL-c2x重组质粒亚克隆，经异丙基-B-D半乳糖苷酶(IPTG)诱导重组质粒菌表达sTNFR1，以淀粉树脂亲和层析法纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对重组蛋白进行分析。结果经核苷酸序列测序和sDS—PAGE法鉴定，成功构建了人sTNFR1重组质粒基因工程菌，并表达和纯化了sTNFR-MBP融合蛋白。结论成功地构建了人sTNFR1重组质粒克隆，表达并纯化了sTNFR1-MBP融合蛋白。     

风疹病毒E1基因的克隆及原核表达

目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。     

EB病毒LMP1-CTAR2结构域的原核表达及蛋白质纯化

目的:构建LMP1-CTAR2原核表达载体,纯化LMP1羧基端活化区2(CTAR2)蛋白。方法:通过RT-PCR技术从B95-8细胞中扩增EBVLMP1 CTAR2 cDNA,克隆至PGEM-T载体后测序。运用亚克隆技术构建PGEX-6P-3-CTAR2重组表达载体。用SDS-PAGE与western blot对表达产物进行鉴定,利用Sepharose 4B亲和层析柱对表达产物进行分离和纯化。结果:PCR扩增出225 bp的基因片段,测序结果与已知的LMP1 CTAR2序列吻合。成功构建PGEX-6P-3-CTAR2原核表达载体,western blot分析表明表达产物能与抗LMP1单克隆抗体特异结合。成功分离出Mr约37000的PGEX-6P-3-CTAR2融合蛋白,纯化出Mr约15000的LMP1 CTAR2蛋白。结论:成功获得EBV LMP1 CTAR2蛋白,可用于噬菌体筛库和CTAR2致瘤机制研究。     

白藜芦醇上调阿尔茨海默病模型大鼠海马组织N-甲基-D-天冬氨酸受体1及蛋白激酶C基因和蛋白的表达

目的探讨白藜芦醇对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)模型大鼠海马组织N-甲基-D-天冬氨酸受体1(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR1)及蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)基因和蛋白表达的影响。方法将60只Wistar雌性大鼠随机分为6组,分别为:假手术对照组,AD模型对照组,白藜芦醇低、中、高剂量(20、40和80 mg/kg)干预组,0.8 mg/kg戊酸雌二醇阳性对照组。采用去卵巢合并腹腔注射100 mg/kg D-半乳糖制备AD大鼠模型,同时白藜芦醇灌胃干预12周。干预后用实时荧光定量PCR检测大鼠海马组织NMDAR1和PKC基因的表达,用Western Blot检测NMDAR1总蛋白、磷酸化蛋白和PKC蛋白的表达。结果与假手术组相比,模型组NMDAR1及PKC基因和蛋白的表达明显下调(P<0.05);与模型组相比,白藜芦醇各剂量组NMDAR1和PKC基因的表达显著上调(P<0.05),以80 mg/kg组最为明显(P<0.01),对NMDAR1基因上调程度与戊酸雌二醇相当,40和80 mg/kg干预组p-NMDAR1/NMDAR1比值明显增加(P<0.05或P<0.01),PKC蛋白表达明显上调(P<0.05或P<0.01),与戊酸雌二醇效果相当。结论白藜芦醇上调NMDAR1及PKC基因的表达并且促进NMDAR1蛋白磷酸化和PKC蛋白的表达,可能是其改善AD模型大鼠记忆的机制之一。     

重组大鼠溶菌酶C端多肽的原核表达与纯化

目的 应用基因重组技术,构建pET30a（＋）与LY70的原核表达重组质粒.方法 采用PCR方法扩增LY70基因,经Nde I和Not I双酶切后插入相同酶切pET30a（＋）载体,转化DH5α感受态细胞并进行阳性克隆筛选,用限制性内切酶酶切和核酸序列检测方法鉴定重组质粒DNA,将其转入宿主菌Ecoli Rosetta （DE3）,用IPTG对重组质粒进行诱导表达,SDS-PAGE及Western blot方法鉴定表达蛋白的分子质量及特异性,表达产物经Ni＋-NTA琼脂糖柱层析纯化.结果 成功构建了重组表达载体pET30a（＋）与LY70,并优化表达,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在.结论 原核细胞可以高效表达溶菌酶的C端多肽而不影响原核表达系统,不失为一种制备溶菌酶功能性多肽的有效手段.     

弓形虫微线体蛋白1部分基因的克隆、测序及表达

目的 构建弓形虫ZS2株pWR450-1－微线体蛋白1（MIC1）原核表达重组质粒,对MICI基因进行序列测定,并在不同大肠杆菌中表达。方法 用PCR技术从弓形虫ZS2株的基因组DNA中扩增编码MICI的基因片段,酶切,连接,重组入pWR450-1表达载体,再经含氨苄培养基筛选、酶切、PCR鉴定,进行序列测序后转化大肠杆菌TG－1、JM109（DE3）和DH5α。在不同菌体浓度及不同剂量异丙基－β－D－硫代半乳糖诱导下,用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定MIC1融合蛋白的表达。结果 从ZS2株基因组DNA中扩增出特异的MIC1基因片段,克隆后获得pWR450-1/MIC1重组质粒,测序结果表明,MIC1这部分基因与弓形虫RH株相应基因序列完全一致,高度保守。该基因可在不同大肠杆菌中表达相对分子质量约70000的融合蛋白。结论 构建了弓形虫ZS2株pW450-1-MCI1重组质粒,为研究MIC1的结构与功能奠定了基础。     

附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的原核表达及纯化

目的 构建人附睾蛋白酶抑制剂Eppin蛋白的重组质粒pET28a(+)-Eppin,并研究该质粒在原核细胞中的表达及纯化.方法 本研究以人睾丸组织cDNA为模板获得人Eppin基因片段,将其插入pET28a(+)载体His6-Tag上游,构建重组质粒pET28a(+)-Eppin,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IP...     

屋尘螨变应原Der p 1基因的克隆和原核表达

目的克隆和分析屋尘螨主要变应原Der p 1,并实现原核表达。方法分离屋尘螨总RNA,根据Gen Bank已公布的Der p 1核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增Der p 1编码基因,克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a( ),将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)并用IPTG诱导表达,并对表达产物进行免疫印迹鉴定。结果成功构建了表达质粒pET-28a( )-Der f 1,Western blotting显示原核表达获得成功。序列分析表明所获得的Der p 1编码基因与参考序列同源性达99.9%,推测其编码氨基酸222个。屋尘螨和粉尘螨1类变应原氨基酸序列相似率为60%,而粉尘螨与梅氏嗜霉螨1类变应原相似率为85%,分子进化分析亦提示粉尘螨和梅氏嗜霉螨亲缘关系较近。推测所获rDer p 1二级结构中,α螺旋占33.78%,延伸链占21.62%,随机线圈占44.59%。结论尘螨变应原Der p 1原核表达获得成功,为进一步生产重组变应原奠定了基础。序列分析表明粉尘螨和梅氏嗜霉螨的亲缘关系可能更近,而与屋尘螨关系稍远,此与现行的形态学分类系统并不符合。     

弓形虫微线体蛋白8胞质尾蛋白的表达及纯化

目的 制备弓形虫微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8t)蛋白片段.方法 以弓形虫基因组为模板,PCR扩增MIC8t基因片段,构建MIC8t/pGEX-4T-1原核表达系统;IPTG诱导表达GST-MIC8t融合蛋白;亲和层析纯化融合蛋白.结果 构建了MIC8t原核表达系统,表达并纯化了GST-MIC8t融合蛋白.结论 在体外制备并纯化了GST-MIC8t融合蛋白,为后续研究MIC8t的功能奠定了基础.     

弓形虫SAG1重组蛋白的制备及血清学检测应用

目的:以重组弓形虫表面抗原SAG1对上海市徐汇区人群进行弓形虫抗体血清阳性率分析。方法:重组质粒pET-19b-SAG1在大肠杆菌BL21star(DE3)pLysS中诱导表达,经Ni2+亲和层析法纯化目的蛋白后,用ELISA鉴定其抗原特异性。以SAG1重组蛋白为抗原用ELISA方法检测上海市徐汇区人群血清(266份)弓形虫IgG抗体,并与国外试剂盒进行比较。结果:SAG1重组蛋白以包涵体形式存在,产量为0.98 mg/100 ml培养基,纯度达95%以上,并具有较好的抗原特异性。以该重组抗原对上海市徐汇区人群弓形虫血清抗体进行IgG-ELISA检测,显示阳性率为9.4%(25/266)。结论:成功表达提纯了具有较高抗原特异性的SAG1重组蛋白。本次调查上海市徐汇区人群的弓形虫血清抗体阳性率为9.4%,建议加强血清学监测,便于及时采取有效干预措施。     

刚地弓形虫HSP70真核表达质粒构建及评价

目的 构建刚地弓形虫热休克蛋白70(TgHSP70)真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T细胞内获得表达,为制备基因疫苗奠定基础。方法 扩增TgHSP70基因,双酶切后与真核表达质粒p3×Flag-CMW-14连接,经酶切、PCR及测序鉴定;脂质体法将重组体转染HEK 293T细胞中,TgHSP70的表达产物通过RT-PCR和western blot在基因和蛋白2个水平鉴定。结果 PCR扩增获得约495 bp的HSP70基因片段,p3×Flag-CMW-14-TgHSP70重组质粒构建成功,经双酶切、PCR及测序鉴定,重组质粒基因序列完全正确;将p3×Flag-CMW-14-TgHSP70转染到HEK 293T细胞中,经RT-PCR检测获得预期大小目的基因条带,Western-blot检测表达产物大小约19 kDa。结论 成功构建了真核表达重组质粒p3×Flag-CMW-14-TgHSP70,并在HEK 293T正确表达。     

空肠弯曲菌peb1A基因的克隆表达及免疫性鉴定

目的:克隆空肠弯曲菌peb1A基因,构建其原核表达载体;鉴定重组表达产物的免疫原性。方法:PCR扩增空肠弯曲菌peb1A基因,构建pET-28a(+)-peb1A表达载体。转化E.coliBL21(DE3)后诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。采用Ni-NTA亲和层析法收集表达的目的重组蛋白PEB1。采用CJ全菌抗体的Western blot鉴定rPEB1免疫反应性,双向免疫扩散试验鉴定rPEB1免疫家兔的抗血清效价。结果:所克隆的基因与报道的核苷酸序列同源性为99.9%,转化E.coliBL21(DE3)后,表达产物最高表达量占全菌总蛋白的33%左右,纯化后获得纯度为96%的重组蛋白。Western blot证实rPEB1能与CJ全菌抗体发生特异性免疫结合反应。兔抗rPEB1血清的双向免疫扩散效价为1:16。结论:成功地构建了高效表达载体pET-28a(+)-peb1A,并获得rPEB1,所表达的rPEB1具有良好的免疫原性和免疫反应性,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

粉尘螨变应原第1组分原核表达质粒pCold-TF-Der f 1构建及鉴定

目的建立粉尘螨变应原第1组分全长基因原核表达质粒pColdTFDer f 1。方法以质粒pET-28a(+)Der f 1为模板扩增目的基因Der f 1,克隆至pColdTF DNA载体,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达并用SDSPAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)和蛋白印迹法(Western blotting,WB)验证产物。结果 PCR扩增获得Der f 1编码全长基因,成功构建表达质粒pColdTFDer f 1,SDSPAGE和WB验证表明该质粒在大肠埃希菌中正常表达,且基本为可溶性表达。结论成功建立尘螨变应原原核表达质粒pColdTFDer f 1,并成功实现其原核表达,为进一步生产基因工程变应原提供基础依据。     

华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因的分子表达、蛋白纯化与定性

目的 选取一个华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因进行克隆表达、纯化,并鉴定该重组蛋白的分子特性及潜在的诊断应用价值.方法 根据Genbank中华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶基因顺序(L 47982)设计引物,从华支睾吸虫成虫cDNA扩增特异性片段,与pTrcHis表达载体连接,重组质粒在大肠埃希菌DH5α中表达,使用亲合层析柱纯化重组蛋白.分别使用SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定重组蛋白的一般分子特性和抗原活性,以免疫组化染色法探讨该抗原在成虫组织内的分布.结果 重组质粒在大肠埃希菌中成功表达,亲合层析获得高纯度的磷酸甘油酸激酶融合蛋白(rCsPGK),分子量约4.7×104.Western blot显示该重组抗原与华支睾吸虫感染阳性血清有较好的结合反应.ELISA结果 显示,rCsPGK用于检测特异性抗体在数值上可区分阴阳性血清,受检阳性与混合阴性血清A值之比(P/N)为1.22～1.86,明显低于使用全虫粗抗原的P/N值(4.24～8.21).免疫组化显示,针对rCsPGK的抗体与成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵有明显的染色反应.结论 该研究用pTrcHis原核表达系统成功克隆和表达了华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶融合蛋白.使用亲合层析能获得高纯度、具有潜在诊断应用价值的rCsPGK抗原,但用于检测特异性抗体的敏感性低于全虫粗抗原.免疫组化表明,华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶可能主要分布在成虫体壁的上皮组织、卵黄腺及卵巢内虫卵等组织内.     

HIV-1核心抗原p24基因的表达、纯化及抗原性分析

目的在原核系统中表达全长HIV-1 p24抗原,并对其抗原性进行鉴定。方法利用PCR技术从HIV-1全基因质粒(BH-10)中扩增p24抗原基因,通过酶切消化后连接到表达载体pET22b上,用此连接产物转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导,表达p24抗原。运用双酶切技术、SDS-PAGE电泳检测插入基因片段的正确性,并用W estern B lot(WB)及ELISA法对表达产物的抗原性进行检测。结果PCR产物和构建的重组质粒pET22b-p24经双酶切插入的外源基因片段均为690 bp,与预期p24抗原全基因片段大小一致。纯化蛋白SDS-PAGE电泳,可见1条相对分子量约26×103的外源表达蛋白带,与预期大小一致,未见杂蛋白带。WB结果显示重组蛋白与HIV-1阳性血清呈特异性反应,与健康人血清没有反应。ELISA检测p24抗原灵敏度为93.94%(62/66),特异性为93.33%(28/30)。结论构建了HIV-1 p24表达载体pET22b-p24,并在原核细胞中高效表达,其表达产物具有良好的抗原性,为研制HIV抗体确认试剂奠定了良好的基础。     

Production and Evaluation of Toxoplasma gondii Recombinant Surface Antigen 1 (SAG1) for Serodiagnosis of Acute and Chronic Toxoplasma Infection in Human Sera

Background

The assays currently available for the detection of specific anti-Toxoplasma antibodies may vary in their abilities to detect serum immunoglobulins, due to the Lack of a purified standardized antigen. The aim of this study was evaluation the recombinant Toxoplasma gondii SAG1 antigen for the serodiagnosis of acute and chronic toxoplasmosis.

Methods

This study describes an ELISA using recombinant SAG1 for detection of IgM and IgG antibodies against Toxoplasma gondii in human sera. Genomic DNA of T. gondii (RH Strain) was isolated and PCR reaction was performed. Recovered DNA was cloned into PTZ57R cloning vector. The recombinant plasmid was detected by restriction analysis. The SAG1 gene was subcloned in the pET- 28a expression vector. Protein production was then induced with 1 mM isopropyl-D – thiogalactopyranoside (IPTG). A total of 204 sera were tested using a commercial IgG and IgM ELISA kit (Trinity, USA) as gold standard prior to testing them with the recombinant antigen.

Results

Tested sera were divided into the following groups:(a) The 74 T. gondii IgG positive (b) 70 T.gondii IgM positive (c) 60 sera who had no serological evidence of toxoplasmosis as negative sera.To determine the specificity of the test, we used other parasitic diseases including echinococusis (N=5), malaria (N=14), leishmaniasis (N=7),fasciolasis (N=4), sterengyloidiasis (N=1). Sensitivity and specificity of the generated recombinant IgG ELISA in comparison with commercial ELISA (Com ELISA) were 93% and 95%, and the sensitivity and specificity of the generated recombinant IgM ELISA were 87% and 95% respectively.

Conclusion

The results acquired here show that this antigen is useful for diagnostic purposes and could be replaced by lysed, whole cell antigens for diagnosis of chronic toxoplasmosis.     

结核杆菌H37Rv株重组PstS1蛋白的表达纯化及其免疫反应性分析

目的:表达、纯化结核杆菌H37Rv株重组Psts1(简称rPstS1)蛋白,为结核病血清学诊断价值研究及亚单位疫苗研制提供物质基础.方法:重组质粒pET15b-Pstsl转化大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3)plysE,IPTG诱导rPstSI蛋白表达.经SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定后,优化表达...