大鼠胰腺干细胞转分化成胰岛细胞的研究

目的 本研究将大鼠胰腺干细胞诱导分化成胰岛细胞,为胰岛移植的临床应用提供可替代资源。方法 大鼠胰腺干细胞经体外培养,免疫组化鉴定CK-19,无血清培养基培养,使其转分化成胰岛,双硫棕染色鉴定。对诱导后胰岛细胞行葡萄糖刺激试验,用RIA法测其胰岛素、C肽的分泌功能并与天然胰岛相比较。结果 胰腺干细胞在体外大量增生,免疫组化显示CK-19阳性,诱导4周后得到胰岛样细胞团,双硫棕染色阳性。检测上清,诱导的胰岛在高糖刺激下胰岛素的分泌量为低糖的5倍;在葡萄糖低浓度（3.8mM）和高浓度（16.5mM）时,诱导的胰岛胰岛素分泌量分别约为天然胰岛的1/28和1/35,C肽分泌量分别为天然胰岛的1/29和1/22。结论 大鼠胰腺干细胞在体外可有效扩增,可转分化为胰岛团,该胰岛团随葡萄糖浓度的高低调节胰岛素。     

共微囊血红蛋白对大鼠胰岛细胞功能的影响

目的：探讨共微囊血红蛋白(Hb)对大鼠胰岛细胞功能的影响。方法：用琼脂糖微囊包被大鼠胰岛或共同包被Hb体外培养，硝普钠(SNP)作为一氧化氮(NO)供体，放射免疫法检测培养液中胰岛素含量，比较共微囊化(含Hb)、单纯微囊化、未微囊化胰岛细胞胰岛素分泌功能。结果：无SNP培养液中，3种胰岛细胞之间胰岛素分泌量差异无显著性；含SNP培养液中，单纯微囊化、未微囊化胰岛细胞胰岛素分泌受到明显抑制；共微囊化胰岛细胞胰岛素分泌功能良好。结论：共微囊血红蛋白可拮抗NO对微囊内胰岛的损害，有利于维持胰岛的功能。     

CCK8对高脂血症大鼠胰岛细胞生长及胰岛素分泌的影响

目的:观察八肽胆囊收缩素(octa-peptide cholecystokinin , CCK8)对高脂血症模型大鼠体外培养的胰岛细胞的生长及胰岛素分泌的影响.方法:SD大鼠饲以高甘油三脂、高胆固醇膳食,建造成实验性高脂血症模型,采用酶消化、密度离心等方法分离、培养胰岛细胞,并随机分为对照组和实验组,实验组分别加入终浓度为10-7～10-9mmol/L的 CCK8处理细胞24、48 h,对照组加入等量培养基.MTT法检测胰岛细胞增殖情况;放射免疫测定法检测不同条件下胰岛细胞的胰岛素分泌量.结果:与对照组比较,经不同浓度CCK8处理24、48 h后,胰岛细胞的增殖及胰岛素分泌量均显著提高(差异具有显著性),且具有剂量及时间依赖性.结论:CCK-8能显著增强高脂血症模型大鼠胰岛细胞增殖及胰岛素的分泌,提示CCK8对于脂毒性影响下的胰岛细胞具有保护作用.     

神经生长因子对胰淀素所致大鼠胰岛细胞功能障碍的保护作用

目的:评价神经生长因子(NGF)对高浓度胰淀素所致大鼠胰岛细胞活力和胰岛素分泌功能损伤的修复作用.方法:以不同浓度胰淀素(1、5、10 μmol/L)孵育原代培养的大鼠胰岛β细胞,制备功能减退的细胞模型,再以不同浓度的NGF(50、100、200 μg/L)孵育高浓度胰淀素(10 μmol/L)作用过的胰岛细胞,分别设立空白对照组,比较各组细胞对四甲基偶氮唑盐(MTY)还原能力和胰岛素的分泌能力.结果:高浓度胰淀素(10 μmol/L)作用后胰岛细胞对MTF还原能力以及基础糖(5 mmol/L)和高糖状态(16.7 mmol/L)下胰岛素分泌量的影响与对照组相比均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01),细胞模型制备成功.用不同浓度NGF孵育24h后,随着NGF剂量的增加,此受损胰岛细胞胰岛素分泌量(即24 h胰岛素分泌量)、高糖(16.7 mmo/L)刺激下胰岛素分泌量均明显增加,受损胰岛细胞对MTT还原能力亦逐步增强.结论:NGF可减轻高浓度胰淀素对胰岛细胞活力的抑制作用,并促进胰岛B细胞分泌功能的恢复.     

体外培养人脐带血间充质干细胞向胰岛细胞分化及对糖尿病治疗的实验研究

目的研究人脐带血间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能及其移植后对糖尿病大鼠的治疗效果。方法体外分离培养HUCB-MSCs,在胰岛细胞培养条件下经药物定向诱导其分化;免疫组化对诱导细胞进行胰岛β细胞标记鉴定;双硫腙染色鉴定锌离子表达及检测胰岛样细胞的移植效果。结果 HUCB-MSCs经诱导后,免疫细胞化学染色显示表达人胰岛素;双硫腙染色呈棕红色;移植后2周,胰岛样细胞组血糖浓度明显降低。结论 HUCB-MSCs在体外诱导培养条件下,具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能,这种细胞可能为Ⅰ型糖尿病提供一条新的治疗途径。     

京尼平苷对高糖高脂诱导的胰岛β细胞胰岛素分泌的影响

目的研究京尼平苷对高糖高脂诱导的胰岛β细胞胰岛素分泌的影响。方法用高糖高脂孵育大鼠胰岛β细胞(INS-1)及原代大鼠胰岛,同时用京尼平苷干预,用放射免疫法检测胰岛素分泌量。结果京尼平苷增加高糖高脂孵育后INS-1细胞的数量;京尼平苷促进高糖高脂孵育后INS-1细胞的胰岛素分泌;京尼平苷改善高糖高脂孵育后原代大鼠胰岛的胰岛素分泌,且通过胰高糖素样肽-1(GLP-1)受体发挥作用。结论京尼平苷通过GLP-1受体调节高糖高脂诱导后胰岛β细胞的胰岛素分泌。     

体外诱导人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化

目的 通过体外培养将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.方法 将体外培养的人脐带间充质干细胞分为诱导组和对照组.诱导组先后予以1 mmol·L-12-巯基乙醇培养2 d,10 μg·L-1表皮生长因子、10 μg·L-1碱性成纤维细胞生长因子及2% B27培养7 d,之后添加20 mmol·L-1尼克酰胺及艾塞那肽培养7 d.对照组不添加诱导剂,继续换液培养.通过观察细胞形态变化、RT-PCR体外扩增两组细胞的胰腺-十二指肠同源框-1（PDX-1）基因、放射免疫法测定两组细胞胰岛素分泌量三种方法来鉴定胰岛素分泌细胞.结果 （1）通过形态学观察,诱导组细胞类似胰岛样细胞,对照组细胞则无明显改变;（2）应用RT-PCR方法,诱导组细胞可扩增出PDX-1基因,而对照组则没有.（3）诱导组细胞培养上清液可检测出胰岛素分泌,7 d时胰岛素浓度为（6.32±0.18）mIU·L-1,21 d时增至（34.57±4.54）mIU·L-1,而对照组则未测出.结论成功在体外微环境下将人脐带间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞.     

胰高血糖素样肽1和Extentin-4体外诱生人骨髓间充质干细胞分化为分泌胰岛素细胞

目的 探讨并优化人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）向分泌胰岛素细胞（IPCs）定向分化的条件,为糖尿病替代疗法寻找新出路.方法 hBMSCs复苏培养后,联合应用胰高血糖素样肽1（GLP-1）、Ex-tentin-4等细胞因子通过三步诱导方案进行体外向IPCs诱导分化.应用反转录-聚合酶链反应检测与β细胞发育和功能相关的基因表达;免疫细胞化学、双硫腙染色证实IPCs的生成;电化学发光法检测细胞胰岛素的分泌量.结果 诱导分化18d后,镜下观察到胰岛样细胞团的生成,双硫腙及免疫细胞化学染色胰岛素均呈现阳性反应;诱导分化的细胞在第18天则可以观察到胰十二指肠同源盒基因1、胰岛素的高表达;诱导分化的细胞接受葡萄糖刺激后能够分泌胰岛素,且胰岛素的分泌量随葡萄糖浓度的提高而增加,高糖胰岛素分泌量[（188.7±1.5）mU/L]与低糖胰岛素分泌量[（60.1±0.9）mU/L]相比,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 体外联合应用GLP-l、Extentin-4、尼克酰胺等细胞因子采用三阶段诱导方案可以大大提高胰岛素细胞诱导分化率,并能促进IPCs的成熟和胰岛素的释放.     

一氧化氮对大鼠胰岛细胞胰岛素分泌的影响

目的：研究一氧化氮(NO)对胰岛细胞分泌胰岛素的影响及其机制。方法：①采用经胰管注射胶原酶技术分离大鼠胰岛，葡聚糖(Ficoll)不连续密度梯度方法离心纯化胰岛；②用硝普钠(SNP)作为NO供体，硫酸亚铁(FeS04)作为NO抑制剂，放射免疫法检测胰岛细胞胰岛素分泌量。结果：NO明显抑制胰岛细胞胰岛素基础分泌和葡萄糖刺激的胰岛素释放，FeSO4能阻断这种作用(P值均＜0．05)。结论：NO能明显抑制大鼠胰岛细胞的分泌功能，这可能是体内胰岛细胞损害的因子之一。     

接骨木多糖对大鼠胰岛细胞增殖及胰岛素分泌的影响

目的探讨接骨木多糖对体外培养大鼠胰岛β细胞株INS-1E细胞增殖和胰岛素分泌的影响。方法采用CCK-8方法检测接骨木多糖对大鼠胰岛细胞活性影响以及对四氧嘧啶损伤后细胞活性的影响;采用ELISA法检测接骨木多糖联合四氧嘧啶对大鼠胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响。结果接骨木多糖可以明显促进大鼠胰岛细胞增殖(P<0.05),并降低四氧嘧啶诱导的大鼠胰岛细胞损伤(P<0.05)、增加胰岛素分泌(P<0.05)。结论接骨木多糖对四氧嘧啶诱导的大鼠胰岛细胞损伤具有保护作用。     

罗格列酮对高糖诱导的β细胞胰岛素分泌功能的影响

目的 探讨罗格列酮对高糖诱导的β细胞胰岛素分泌功能及胰腺十二指肠同源盒因子-1(PDX-1)mRNA表达的影响.方法 应用正常浓度葡萄糖、正常浓度葡萄糖 罗格列酮、高浓度葡萄糖、高浓度葡萄糖 罗格列酮培养RIN-m细胞(大鼠胰岛细胞瘤细胞系).采用放射免疫的方法检测胰岛素水平,RT-PCR方法检测PDX-1及胰岛素mRNA表达水平.结果 (1)长期高糖培养引起RIN-m细胞胰岛素分泌水平降低(P<0.01).长期高糖作用使RIN-m细胞PDX-1及胰岛素mRNA的表达水平显著下降(P<0.01).(2)罗格列酮早期干预可以增加高糖环境下RIN-m细胞胰岛索分泌水平(P<0.01).罗格列酮早期干预可以显著上调高糖环境下RIN-m细胞PDX-1及胰岛素mRNA的表达水平(P<0.01).结论 罗格列酮可以通过上调PDX-1和胰岛素基因表达,延缓高糖环境下的β细胞胰岛素合成和分泌功能的下降.     

1-磷酸鞘氨醇促进胰岛素分泌及可能机制研究

目的研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌效应及其分子机制,探索糖尿病治疗药物的作用靶点。方法使用胶原酶P消化SD大鼠胰腺,Histopaque 1077梯度离心获得胰岛,Dispase II消化得到胰岛细胞。不同浓度S1P(0~20μmol·L~(-1))干预,观察低糖(2.8 mmol·L~(-1))和高糖(16.7 mmol·L~(-1))条件下胰岛素分泌的变化。膜片钳技术记录β细胞电压依赖性钾通道电流(Kv电流),观察S1P干预后Kv电流的变化。钙成像技术记录β细胞内Ca~(2+)浓度,观察不同浓度S1P(0~20μmol·L~(-1))干预后细胞内的Ca2+浓度变化。结果与低糖组相比,高糖组明显刺激了胰岛素的分泌(P<0.01)。低糖条件下,S1P没有改变胰岛素分泌量(P>0.05)。高糖条件下,S1P浓度依赖性增加了胰岛素分泌量(P<0.01)。与对照组相比,S1P明显抑制了β细胞Kv电流(P<0.01)。高糖条件下,S1P浓度依赖性升高了胰岛细胞内Ca~(2+)浓度(P<0.01)。结论 S1P可能通过抑制β细胞Kv电流、升高细胞内Ca2+浓度,最终促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。     

环孢霉素A对胰岛β细胞功能的影响

目的探讨环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)对胰岛β细胞(NIT-1细胞)胰岛素分泌及细胞凋亡的影响。方法实验室培养NIT-1细胞,用0.5,2.5,5.0,10μmol.L-1CsA作用细胞72 h,检测其对细胞胰岛素分泌及凋亡的影响。结果与对照组相比,CsA能明显抑制NIT-1细胞胰岛素分泌(P<0.01),对细胞的凋亡具有明显促进作用(P<0.01)。结论CsA对NIT-1细胞的功能具有抑制作用并能促进细胞的凋亡。     

番石榴酸对INS-1胰岛β细胞增殖、胰岛素合成与分泌的促进作用及其机制分析

目的考察番石榴酸(guavenoic acid,GA)对INS-1胰岛β细胞增殖、细胞内胰岛素含量及分泌功能的影响,并探讨其可能的作用机制。方法培养INS-1胰岛β细胞,给予GA(0.3、1、3、10、30 nmol·L-1),并设空白对照组、溶媒对照组(0.1%DMSO)、分泌模型组及阳性药组(150 nmol·L-1格列苯脲含1‰DMSO),药物作用48 h。应用MTT法检测药物对INS-1的影响。使用酸醇提取液提取细胞中胰岛素,用放射免疫法检测药物对I细胞增殖NS-1细胞内胰岛素含量的影响。分别用5.6、16.7 mmol·L-1葡萄糖干预细胞1 h建立基础胰岛素分泌模型(BIS)、高糖刺激胰岛素分泌模型(GSIS),用放射免疫法测定药物对INS-1细胞胰岛素分泌的影响,结果以总蛋白量校正。荧光定量PCR法检测药物对INS-1细胞内胰岛素基因、PDX-1、MafA mRNA表达的影响。结果与溶媒对照组比较,GA能明显地促进INS-1胰岛细胞的增殖(P<0.01)并能明显增加INS-1细胞内胰岛素含量(P<0.01),0.3³0 nmol·L-1GA对BIS及GSIS均有明显促进作用(P<0.05或P<0.01),0.330 nmol·L-1GA对BIS及GSIS均有明显促进作用(P<0.05或P<0.01),0.3³0 nmol·L-1GA明显地上调Insulin mRNA的相对表达(P<0.01)。3、30 nmol·L-1GA明显地上调PDX-1 mRNA的相对表达(P<0.01)。3、30 nmol·L-1GA能明显地上调MafA mRNA的相对表达(P<0.01)。结论 GA能促进INS-1胰岛β细胞增殖;增加细胞内胰岛素含量与分泌量,可能与其上调Insulin、PDX-1、MafA基因表达有关。     

牛膝-杜仲药对促进RIN细胞胰岛素分泌作用的研究

目的 探索牛膝-杜仲药对促进RIN细胞胰岛素分泌的作用,并筛选出最佳炮制品组合.方法 以RJN-m5F细胞作为体外研究模型,以胰岛素分泌量为指标,研究牛膝-杜仲药对的促泌活性,并确定牛膝-杜仲药对的最佳炮制品组合.结果 与空白组相比,不同炮制品组合的牛膝-杜仲药对均具有促进RIN-m5F细胞胰岛素分泌的显著性作用(P＜0.05),且酒牛膝-盐杜仲促进RIN-m5F细胞胰岛素分泌作用最强,其分泌量为40.27mU·L-1,与空白组比较增加率为27.28％,有极显著性差异(P＜0.01).结论 不同炮制品组合的牛膝-杜仲药对均具有促进RIN-m5F细胞胰岛素分泌的显著性作用,其中酒牛膝-盐杜仲药对为最佳炮制品组合.     

2型糖尿病胰岛素分泌第一时相缺陷的研究进展

2型糖尿病(DM)是一种异质性疾病，特点是胰岛β细胞分泌胰岛素(Ins)功能减退及Ins在靶细胞作用的缺陷。Ins分泌功能减退主要表现为血糖升高时Ins分泌迟缓、分泌高峰滞后及分泌量不足。Ins对靶细胞作用的缺陷可导致靶细胞对自身分泌的Ins不敏感，此时，即使胰岛β细胞能分泌足量的Ins，也不能使物质代谢归于正常，这就是胰岛素     

游离脂肪酸对胰岛BTC3细胞增殖及胰岛素分泌的影响

目的：观察游离脂肪酸（FFAs）慢性作用对胰岛BTC3细胞增殖及胰岛素分泌的影响。方法：将不同浓度油酸作用于培养的胰岛BTC3细胞,用MTT法分析细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,放免法检测基础和葡萄糖刺激的胰岛素分泌量（GSIS）。结果：与对照组相比,油酸作用后胰岛BTC3细胞MTF值明显低于对照组（P〈0．01）,并且有剂量依赖性和时间依赖性。流式细胞仪分析显示油酸作用使BTC3细胞G1期细胞比例增加（P〈0．05）,S期细胞比例明显减少（P〈0．01）。油酸作用后基础（2．8mmol/L葡萄糖）胰岛素分泌量明显增加,GSIS（16．7mmol/L葡萄糖）明显减少（均P〈0．01）,并且均有剂量依赖性和时间依赖性。结论：油酸能够抑制胰岛BTC3细胞的增殖及GSIS,并且有剂量和时间依赖性。     

刺五加叶皂甙对Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素分泌影响的形态学研究

目的：研究刺五加叶皂甙(ASS)对Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素分泌影响及胰腺的形态学改变。方法：应用放射免疫学方法对正常组和模型组大鼠，在给予ASS后其空腹及口服葡萄糖后血浆中胰岛素变化测定；HE染色法观察正常组和模型组胰腺的形态学改变。结果：ASS可增强Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素分泌．对正常大鼠无影响；在模型组可见胰岛数量减少，胰岛细胞稀疏,排列不规则。结论：ASS可以促进Ⅱ型糖尿病大鼠胰岛素分秘，对胰岛B细胞具有保护作用。     

环孢霉素A对胰岛β细胞功能的影响

目的探讨环孢霉素A(cyclosporine A,CsA)对胰岛β细胞(NIT-1细胞)胰岛素分泌及细胞凋亡的影响。方法实验室培养NIT-1细胞,用0.5,2.5,5.0,10μmol·L^-1CsA作用细胞72 h,检测其对细胞胰岛素分泌及凋亡的影响。结果与对照组相比,CsA能明显抑制NIT-1细胞胰岛素分泌(P<<0.01),对细胞的凋亡具有明显促进作用(P<<0.01)。结论CsA对NIT-1细胞的功能具有抑制作用并能促进细胞的凋亡。     

高尿酸对胰岛β细胞生存与功能的影响

目的 探讨高尿酸对胰岛β细胞生存及功能的影响.方法 采用免疫荧光染色方法检测正常小鼠(A组)和高尿酸小鼠(B组)胰岛形态及胰岛素水平变化.采用CCK-8方法观察尿酸浓度为0 mg/dl(C组)、5 mg/dl(D组)和15 mg/dl(E组)大鼠胰岛细胞系INS-1细胞活力.采用ELISA法检测尿酸浓度为0 mg/dl(F组)、15 mg/dl(G组)小鼠分离的胰岛胰岛素分泌量及储藏量变化.结果 与A组比较,B组小鼠胰岛面积明显缩小,胰岛素水平降低(P＜0.05).与C组比较,D组、E组INS-1细胞活力呈剂量依赖性显著降低(P＜0.05).与F组比较,G组细胞胰岛素的分泌水平和储存水平均显著降低(P＜0.05和P＜0.01).结论 尿酸对胰岛β细胞有直接损伤作用.