缺氧诱导因子-1α在胰腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨缺氧诱导因子(HIF-1α)在胰腺癌组织中的表达及其临床意义。方法应用SABC免疫组化技术检测HIF-1α蛋白在49例胰腺癌组织和10例正常胰腺组织中的表达情况。结果HIF-1α蛋白在49例胰腺癌组织中的阳性表达率为79.6%(39/49),而在10例正常胰腺组织中均未见表达,两者间差异有高度统计学意义(P<0.01)。HIF-1α蛋白阳性表达率与胰腺癌的大小、临床分期和淋巴结转移相关(均P<0.01),而与胰腺癌的部位、病理分级无关(P>0.05)。结论HIF-1α的高表达在胰腺癌的发生发展和浸润转移过程中起着重要作用。     

胰腺癌组织中胰腺星状细胞的活化和基质金属蛋白酶2的表达

目的:检测胰腺癌组织中胰腺星状细胞(PSC)活化的标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和结蛋白(desmin)及基质金属蛋白酶2(MMP2)的表达.方法:应用免疫组织化学染色法分别检测40例胰腺癌、10例正常胰腺组织中α-SMA、desmin及MMP2的表达.结果:胰腺癌组织中α-SMA的阳性表达率为67.5%,desmin的阳性表达率为55.0%,均高于正常胰腺组织(20.0%和30.0%).胰腺癌组织中MMP2的阳性表达率为55%,高于正常胰腺组织(15%).胰腺癌组织中MMP2的阳性表达率与淋巴结转移和向周围组织器官浸润有关(P＜0.01).PSC活化(α-SMA与desmin均为阳性)与淋巴结转移有关.α-SMA与desmin的共表达与MMP2的表达相关(P＜0.05).结论:胰腺癌组织中存在PSC的活化,PSC的活化及MMP2的表达的上调可能参与胰腺癌的浸润转移.     

KiSS-1基因及其蛋白在人胰腺癌组织中表达及其与侵袭和转移的关系

目的研究胰腺癌组织中KiSS-1表达及其与侵袭和转移的关系.方法应用RT-PCR和western blot法检测KiSS-1mRNA及其蛋白肽metastin在37例胰腺癌及27例转移灶和9例正常胰腺组织中的表达情况.结果在胰腺癌组织中KiSS-1基因及其蛋白表达水平显著低于正常胰腺组织(P＜0.01,P＜0.01).KiSS-1mRNA及其蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤大小及组织学分级无关,与临床分期、有无转移和神经侵犯密切相关.在Ⅲ、Ⅳ期胰腺癌组织中KiSS-1基因及蛋白的表达分别为(0.135±0.121)和(9.23±2.74)μg/100μg总蛋白,明显低于Ⅰ、Ⅱ期(P＜0.05,P＜0.05).KiSS-1基因及其蛋白在无转移、有转移的胰腺癌原发灶和转移灶组织中表达水平呈降低趋势,转移灶中的表达水平最低.有神经侵犯的胰腺癌原发灶KiSS-1基因及蛋白表达显著低于无神经侵犯的胰腺癌原发灶(P＜0.01,P＜0.01),其表达与有无神经侵犯相关系数分别为Kendall τ-b=0.597(P=0.003)和Kendall τ-b=0.438(P=0.007).结论KiSS-1基因转录和表达降低与胰腺癌侵袭和转移密切相关,可能参与胰腺癌转移的调控.     

胰腺癌组织中基质金属蛋白酶MMP9的表达及其临床意义

目的 探讨基质金属蛋白酶MMP9在胰腺癌组织中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组织化学技术检测MMP9在11例正常胰腺组织和88例胰腺癌组织中的表达.结果 免疫组织化学结果显示胰腺癌组织中MMP9的表达显著高于正常组织(P＜0.01).MMP9的表达和胰腺癌的临床TNM分期、淋巴结转移均成正相关(均P＜0.01),与生存时间成负相关(P＜0.01),而与肿瘤部位和病理分级均无关(均P＞0.05).经COX回归分析显示MMP9表达与胰腺癌预后成负相关(P＜0.01).结论 MMP9在胰腺癌的发生、发展和转移中扮演着重要角色,在治疗过程中对其进行检测有助于对胰腺癌患者的预后进行评估.     

胰腺癌P53蛋白的表达与肿瘤生物学行为及预后的关系

目的:探讨胰腺癌组织P53蛋白的过度表达与肿瘤生物学行为及预后的关系.方法:应用单克隆抗P53抗体对28例胰腺癌组织石蜡标本进行免疫组织化学染色.结果:P53蛋白阳性物质位于肿瘤细胞核内,28例胰腺癌病例中有16例P53表达阳性(57.1%),与正常胰腺和癌旁组织比较,差异有显著性(P＜0.05),且阳性率随分化程度的降低而升高(P＜0.05),淋巴结转移阳性组表达率高于淋巴结转移阴性组(P＜0.05),与术后存活情况有关(P＜0.05).结论:p53基因的异常表达在胰腺癌的发展过程中起重要作用,对胰腺癌病人的预后判断有一定意义.     

HIF-1α和CXCR4在肾透明细胞癌中的表达

目的 探讨低氧诱导因子-1α(HIF-1α)及趋化因子受体(CXCR4)在肾透明细胞癌(CCRCC)中的表达及临床意义.方法 应用免疫组织化学SP法从蛋白水平检测了48例CCRCC和20例远离肾癌的正常组织HIF-1α和CXCR4的表达,并分析其与临床病理分级、分期及淋巴转移的关系.结果 HIF-1α和CXCR4在CCRCC组织的阳性表达率分别为58.3%、77.0%,正常肾组织中HIF-1α及CXCR4蛋白表达阴性,差异有统计学意义(P＜0.01).HIF-1α和CXCR4与不同临床分期、病理分级及淋巴转移有关(P＜0.05),与性别、年龄、肿瘤大小无关(P＞0.05).HIF-1α与CXCR4在CCRCC中的表达呈正相关(P＜0.05).结论 HIF-1α和CXCR4在CCRCC中的高表达可能对CCRCC的发生、发展起促进作用.     

结直肠腺瘤及癌组织中缺氧诱导因子-1α的表达

目的:探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达与结直肠癌发生发展的关系.方法:用免疫组化SABC法检测27例结直肠正常黏膜、13例腺瘤和61例癌组织中HIF-1α的表达,并探讨HIF-1α与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤浸润等的关系.结果:正常结直肠黏膜组织中HIF-1α无表达;腺瘤组织中阳性表达率为15.4%(2/13),且均为弱阳性表达,2组HIF-1α阳性表达率差异无统计学意义(P＞0.05).癌组织中HIF-1α阳性表达率为65.6%(40/61),其中弱阳性、阳性及强阳性表达率分别为27.9%、19.7%、18.0%,癌组织中阳性表达率显著高于正常粘膜和腺瘤组织(P＜0.01).HIF-1α表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移(P＜0.05)和Dukes 分期密切相关(rs=0.554,P＜0.01),而与患者年龄、性别及肿瘤部位、大小、组织病理学类型无关(P＞0.05).结论:HIF-1α过表达可能是结直肠癌发生的晚期事件,与结直肠癌的浸润、转移密切相关.     

甲基化CpG结合域蛋白1和VIMENTIN在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 探讨甲基化CpG结合域蛋白1(MBD1)和VIMENTIN蛋白在胰腺癌组织中的表达情况及其与胰腺癌临床病理特征的关系.方法 采用免疫组织化学方法检测40例经手术切除的胰腺癌组织和10例良性肿瘤患者的正常胰腺组织中MBDI和VIMENTIN蛋白的表达.结果 在40例胰腺癌标本中有28例(70.0%)MBD1呈阳性表达,16例(40.0%)VIMENTIN蛋白呈阳性表达,显著高于正常胰腺组织标本的1例(1/10)和0例(P值均<0.05).MBD1与VIMENTIN蛋白的阳性表达呈正相关(r=0.423,P=0.012).在有淋巴结转移的胰腺癌中的MBD1表达阳性率显著高于无淋巴结转移的胰腺癌(P=0.023).在病理分化较差和有淋巴结转移的胰腺癌中的VIMENTIN表达阳性率显著高于病理分化较好及无淋巴结转移的胰腺癌(P值分别=0.027、0.003).结论 胰腺癌组织中存在MBD1和VIMENTIN的过表达,并与病理分级和淋巴结转移有关,MBD1可能通过调控甲基化过程,干预VIMENTIN的表达,在胰腺癌的发生、发展中起到重要作用.     

蛋白免疫印迹法检测胃癌组织Cyr61和HIF-1α 蛋白的表达及其临床意义

目的 侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为之一,也是导致死亡率增加的主要原因,而肿瘤细胞发生转移的机制一直是研究的热点.研究旨在检测富含半胱氨酸61(Cyr61)蛋白和低氧诱导因子-1α(HIF-1 α)蛋白在胃癌组织中的表达水平,探讨两者与胃癌侵袭转移的关系.方法 将标本分成3组,分别为49例胃癌组、49例配对的癌旁组(距癌2 cm)和49例配对的正常组(距癌5 cm以上),用免疫组织化学和蛋白免疫印迹(Western b1ot)方法检测Cyr61和HIF-1 α的蛋白表达水平,并分析两者与胃癌的临床病理特征的关系.结果 免疫组织化学检测显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中表达,HIF-1 d在胃癌细胞的胞浆/胞核中表达.进一步用Western blot检测结果显示,胃癌中Cyr61蛋白的表达水平(0.2767±0.02200)高于癌旁组织(0.2145±0.02209)和正常组织(o.1055±0.02082),癌旁组织高于正常组织(均P＜0.01);胃癌中HIF-1α蛋白的表达水平(0.2663±0.02682)高于癌旁组织(0.2120±0.04087)和正常组织(0.1008±0.03867)(均P＜0.01),癌旁组织高于正常组织(P＜0.01).Cyr61和HIF-1α蛋白表达的增强与肿瘤的分化程度、淋巴转移及TNM分期相关(均P＜0.05).SPERMAN等级相关分析证明了Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白的表达呈明显正相关(r=0.411,P＜0.05).结论 Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中呈高表达,可能与胃癌的侵袭转移有关.联合检测Cyr61蛋白和HIF-1 α蛋白对指导胃癌临床及判断预后有重要价值.     

肿瘤转移相关基因1与抑制基因KISS-1在胰腺癌中的表达及意义

目的研究肿瘤转移相关基因1（metastasis associated 1,MTA1）与抑制基因KISS-1在胰腺癌中的表达,探讨其与病理指标的关系。方法应用免疫组化Envision二步法在36例胰腺癌组织、10例癌旁胰腺组织中检测MTA1与KISS-1蛋白的表达情况。结果 MTA1在胰腺癌组织中的阳性表达率为77.8%（28/36）,显著高于癌旁胰腺组织中的表达[20.0%（2/10）]（P〈0.01）;KISS-1在胰腺癌组织中的阳性表达率为38.9%（14/36）,明显低于癌旁胰腺组织的90.0%（9/10）（P〈0.01）。二者的表达均与患者年龄、性别及肿瘤部位无关（P〉0.05）,而与癌组织的分化程度、淋巴结转移及临床分期有关（P〈0.05）。胰腺癌组织中MTA1与KISS-1的表达呈负相关（r=-0.533,P〈0.01）。结论MTA1和KISS-1与胰腺癌的发生、侵袭以及转移有关,其有望成为胰腺癌诊治的重要生物学指标。     

胰腺癌组织中P21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表达

目的:检测原发性胰腺导管腺癌组织中P21ras、转化生长因子-α(TGF-α)及表皮生长因子受体(EGFR)蛋白的表达情况.方法:应用免疫组织化学SP法检测30例原发性胰腺导管腺癌和10例正常胰腺组织中P21ras、TGF-α及EGFR蛋白的表达情况.结果:原发性胰腺导管腺癌组织中P21ras、TGF-α及EGFR的阳性表达率分别为63.3%(19/30)、80.0%(24/30)和70.0%(21/30),均高于正常胰腺组织的1/10、2/10和0(P分别为0.008、0.001和<0.001);P21ras的表达与胰腺癌的病理分级(P=0.042)、临床分期(P=0.007)及淋巴结转移(P=0.023)关系密切,而TGF-α及EGFR的表达与上述指标无明显相关性(P>0.05);胰腺癌组织中TGF-α与EGFR的表达密切关联(rP=0.607.P<0.001).结论:胰腺癌组织中F21ras蛋白表达是一早期而普遍的事件,检测P21ras蛋白有助于胰腺癌的早期诊断,TGF-α与EGFR能够形成自分泌环,参与胰腺癌的发生.     

胰腺癌组织中硫酸软骨素蛋白多糖4的表达及其临床意义

目的 探讨硫酸软骨素蛋白多糖4(chondroitin sulfate proteoglycan 4,CSPG4)在胰腺癌(pancreatic carcinoma)中的表达及其临床意义.方法 收集2007年6月至2010年6月西南医院肝胆外科的胰腺导管腺癌及正常胰腺组织(距肿瘤边缘＞2 cm)标本各160例,其中男性124例,女性36例;年龄33～75(56.98±10.75)岁.应用免疫组织化学染色法检测其中CSPG4的表达,分析CSPG4的表达与临床病理参数的相关性;采用Kaplan-Meier法分析胰腺癌中CSPG4的表达与患者预后的关系,Cox回归模型分析胰腺癌患者预后的影响因素.结果 胰腺导管腺癌组织中CSPG4的阳性表达率显著高于正常胰腺组织(46.25％ vs 10.00％,P＜0.01).胰腺癌中CSPG4的表达与有无淋巴结转移或血管侵犯、肿瘤T分期、TNM分期显著相关(P＜0.01).胰腺癌中CSPG4阳性表达患者术后总生存率显著低于阴性表达者(P＜0.01).CSPG4的表达是影响胰腺癌患者预后的独立危险因素之一(P＜0.01).结论 CSPG4在胰腺导管腺癌中异常高表达,其表达水平是评估患者预后的独立预测指标,提示CSPG4可能成为胰腺癌治疗的一个新靶点.     

Artemin、GFRα3在胰腺癌中的表达及其与胰腺癌神经浸润转移的相关性

目的 探讨artemin、GFRα3在胰腺癌中表达的意义及其与胰腺癌神经浸润转移的相关性.方法 应用免疫组化链酶菌抗生素蛋白-过氧化物酶法和RT-PCR检测胰腺癌组织、癌旁组织和正常胰腺组织中artemin、GFRα3的表达,观察artemin、GFRα3 的阳性表达率与胰腺癌神经浸润转移之间的相关性.结果 胰腺癌组织中artemin和GFRα3阳性表达率分别为72.09%和67.44%,均显著高于癌旁组织中表达水平(18.19%,22.73%).Artemin、GFRα3在有神经浸润的胰腺癌组织中阳性表达率均明显高于无神经浸润癌组织(χ2=11.11,11.78, P<0.01),胰腺癌组织artemin mRNA 表达量(0.741±0.014)明显高于正常组织(0.101±0.031) (P<0.05),有神经浸润癌组织artemin mRNA 表达量(0.843±0.012)明显高于无神经浸润癌组织(0.512±0.017)(P<0.05).结论 Artemin、GFRα3的表达在胰腺癌神经浸润转移过程中起着重要作用,可能为反应胰腺癌生物学行为的重要指标.     

低氧诱导因子-1α表达与胰腺癌增殖和凋亡的关系

①目的　研究胰腺癌组织中低氧诱导因子 1α(HIF 1α)的表达与胰腺癌增殖和凋亡的关系。②方法应用免疫组织化学方法 ,检测 4 7例胰腺癌和 1 0例正常胰腺组织中HIF 1α、增殖细胞核抗原 (PCNA)及Bcl 2蛋白的表达。③结果　 4 7例胰腺癌组织HIF 1α表达阳性率为 5 5 .3% ,1 0例正常胰腺组织均呈阴性表达。HIF 1α阳性表达率在有周围脏器浸润的胰腺癌组织中为 6 6 .7% ,无浸润者为 35 .3% ,二者间有显著性差异 (χ2 =4 .32 ,P <0 .0 5 ) ;伴淋巴结和远隔脏器转移的胰腺癌组织HIF 1α阳性表达率为 72 .0 % ,高于无转移者的 36 .4 % ,其差异有显著意义 (χ2 =6 .0 1 ,P <0 .0 1 )。HIF 1α阳性表达率与胰腺癌的大小、组织学分级和 1年生存率无关 (χ2 =2 .0 7～ 2 .5 2 ,P >0 .0 5 )。在 4 7例胰腺癌组织中高增殖活性 2 8例、低增殖活性 1 9例。 1 0例正常胰腺的腺胞均呈低增殖状态。胰腺癌细胞增殖程度与胰腺癌淋巴结或远处脏器转移及病人术后生存时间均密切相关 (χ2 =5 .98、6 .1 9,P <0 .0 5 ) ;而与胰腺癌的大小、分化程度和浸润无关 (χ2 =2 .0 1～ 3.74 ,P >0 .0 5 )。 1 0例正常胰腺癌组织Bcl 2蛋白均呈阳性表达 ,4 7例胰腺癌组织中Bcl 2蛋白的阳性表达率为 2 9.8%。Bcl 2蛋白表达与胰腺癌的大小、     

低氧诱导因子1α、乙酰肝素酶在宫颈鳞癌转移中的作用

目的 探讨低氧诱导因子1α(HIF-1α)和乙酰肝素酶(HPA)在宫颈鳞癌转移过程中的作用和意义.方法 应用S-P免疫组化方法检测宫颈鳞癌和正常宫颈组织中HIF-1α及HPA蛋白的表达.结果 HIF-1α及HPA蛋白在宫颈鳞癌中的阳性表达率显著高于正常宫颈组织(P<0.05),并随宫颈鳞癌-临床分期的进展阳性表达率呈上升趋势;淋巴结转移阳性组宫颈鳞癌中HIF-1α及HPA蛋白阳性表达率显著高于淋巴结转移阴性组(P<0.05). HIF-1α及HPA蛋白在宫颈鳞癌中的阳性表达正相关(r=0.596.P<0.05),结论 HIF-1α及HPA蛋白的阳性表达与宫颈鳞癌的浸润及转移有关,二者在宫颈鳞癌的发生发展过程中可能存在一定协同作用.     

结缔组织生长因子、血管内皮生长因子、缺氧诱导因子-1α在胰腺癌中的表达及临床意义

目的：检测胰腺癌中CTGF、VEGF、HIF-1α的表达情况,探讨三者在胰腺癌缺氧微环境中对胰腺癌发生、发展的作用。方法：采用免疫组化Envision二步法对46例胰腺癌组织和10例癌旁胰腺组织中CTGF、VEGF、HIF-1α的表达进行检测。结果：CTGF、VEGF和HIF-1α在胰腺癌组织中均高表达,阳性率分别为45.7%、71.7%、76.1%,显著高于三者在癌旁胰腺组织的表达（0）（P〈0.01）。CTGF在胰腺癌组织中的表达水平与性别、肿瘤部位无关,与年龄、临床分期、病理分级、淋巴结转移情况有关（P〈0.05）。VEGF和HIF-1α在胰腺癌组织中的表达水平只与临床分期有关（P〈0.05）,与其他肿瘤生物学行为无关。CTGF与VEGF、HIF-1α,VEGF与HIF-1α之间的Spearman相关系数分别为r=0.575、r=0.483、r=0.082,即三者两两间均存在正相关关系（均P〈0.01）。结论：胰腺癌组织中CTGF、VEGF、HIF-1α的表达与在癌旁胰腺组织中的表达有显著差异,三者对胰腺癌在肿瘤缺氧微环境下的发生、发展有重要作用。     

血管内皮生长因子、缺氧诱导因子-1α在胃癌中的表达及其对预后影响的研究

目的 研究血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在胃癌组织中的表达和临床病理特征的关系,探讨它们在胃癌增殖、浸润、转移中的作用及对胃癌患者预后的影响.方法 收集135例来自复旦大学附属中山医院1999年12月-2005年12月手术的胃癌病例,采用组织芯片和免疫组化法检测胃癌标本VEGF、HIF-1α表达情况,分析其与临床病理特征的关系及两者之间的相关性.用K-M生存分析及Cox回归单因素、多因素比较分析影响胃癌患者预后因素.结果 胃癌组织VEGF、HIF-1α阳性表达均明显高于癌旁组织,差异有显著性(P＜0.01),胃癌组织VEGF阳性表达与肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移相关(P＜0.05).胃癌组织HIF-1α阳性表达与肿瘤浸润深度显著相关(P＜0.01).胃癌组织中VEGF、HIF-1α的表达呈正相关(P＜0.01),单因素分析结果显示胃癌的肿瘤部位、Borrmann分型、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期、VEGF阳性表达、HIF-1α阳性表达等影响因素与预后相关(P＜0.05),多因素分析TNM分期、淋巴结转移、HIF-1α阳性表达为影响胃癌患者生存的独立预后因素(P＜0.05).结论 HIF-1α在胃癌中是肿瘤耐受缺氧的中心环节,VEGF和HIF-1α的阳性表达可作为判断肿瘤具有高度侵袭转移潜能和预后不良的重要指标.     

HIF-1α蛋白在乳腺癌发生、发展不同阶段的表达及意义

目的:本研究通过观察HIF-1α正常乳腺组织及乳腺癌组织中的蛋白表达,探讨HIF-1α在乳腺癌发生、发展中的作用.方法:采用免疫组织化学SP法检测正常乳腺组织(20例)、乳腺囊性增生组织(20例) 、乳腺不典型增生组织(20例)及乳腺癌组织(60例)中HIF-1α蛋白的表达,并分析其和乳腺癌临床病理特征的关系.结果:HIF-1α蛋白在正常乳腺组织无阳性表达,在乳腺囊性增生组织、乳腺不典型增生组织及乳腺癌组织中的阳性率分别为5%, 30%, 61.67%,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05);低分化组癌组织中HIF-1α蛋白的表达率高于高、中分化组,差异有统计学意义(P＜0.05);并且随着分期越高,其阳性表达率越高,差异有统计学意义(P＜0.05);淋巴结转移组中的HIF-1α表达明显高于无转移(P＜0.05);HIF-1α蛋白表与患者5 a生存率有关(P＜0.05).结论:HIF-1α蛋白在乳腺癌发生、发展不同阶段的表达呈进行性上升的趋势,过度表达提示预后不良.     

缺氧诱导因子2在胰腺癌中的表达及其临床意义

目的 研究胰腺癌组织中缺氧诱导因子2(HIF-2α)的表达及其与血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD)的关系,分析胰腺癌中HIF-2α表达促进肿瘤血管生成的作用及与临床病理特征之间的关系.方法 应用免疫组化SP法检测60例胰腺癌及相应正常胰腺组织中HIF-2α、VEGF蛋白的表达和分布,计数MVD,分析其间的相关性及其与肿瘤临床病理特征之间的关系.结果 HIF-2α和VEGF在胰腺癌组织中的表达均明显高于正常胰腺组织,胰腺癌组织中MVD值明显高于正常胰腺组织,差异均有统计学意义(P<0.05).HIF-2α的表达与VEGF的表达及MVD值成正相关(P<0.05),HIF-2α与VEGF的表达与胰腺癌TNM分期、肿瘤大小有关.结论 胰腺癌组织中HIF-2α呈过量表达,并与VEGF及MVD显著相关;它可能通过上调VEGF表达促进胰腺癌血管生成,进而影响胰腺癌的发生、发展.     

食管癌组织中缺氧诱导因子-1α蛋白的表达

目的:检测食管癌组织中缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的表达.方法:采用免疫组化方法检测100例食管癌及其癌旁正常组织中HIF-1α的表达.结果:食管癌组织中HIF-1α蛋白的阳性表达率明显高于正常黏膜(90%vs58%,P＜0.05),深层浸润组高于浅层浸润组(P＜0.05),与食管癌分化程度及淋巴结转移无关.结论:HIF-1α的高表达可能与微环境缺氧有关,亦可能与食管癌的癌变及浸润有关.