结核分枝杆菌异烟肼耐药相关分泌蛋白海藻糖磷酸磷酸酶的鉴定

目的鉴定结核分枝杆菌异烟肼耐药菌株分泌蛋白中异烟肼耐药相关蛋白。方法应用二乙胺基乙基纤维素(DEAE)亲和凝胶层析,去除结核分枝杆菌7H9培养上清液中牛血清白蛋白。应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDSPAGE)和疏水高效液相色谱技术,分离异烟肼耐药菌株特异蛋白,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪进行质谱分析,获得肽质量指纹谱,通过蛋白质数据库进行检索分析。结果从3株异烟肼耐药菌株分泌蛋白中可重复检测出一种特异性分泌蛋白,经鉴定为海藻糖磷酸磷酸酶(TPP),分子量为46000,等电点为53。结论海藻糖磷酸磷酸酶可作为一种快速检测异烟肼耐药结核分枝杆菌的血清学标志物和抗结核药物的靶位。     

MPB64分泌蛋白检测鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究

目的 对应用MPB64分泌蛋白检测鉴定结核分枝杆菌复合群进行方法学评价.方法 对临床分离菌株,取BacT/ALERT 3D系统的液体培养液或改良罗氏固体培养基分离培养菌落室温静置约2 h、浊度为1麦氏单位的生理盐水菌悬液0.1 ml为检测样本,应用胶体金标记抗MPB64单克隆抗体采用免疫层析色谱法进行MPB64分泌蛋白检测,而后与菌种鉴定结果相比较.对参考菌株,则同时采用两种样本进行检测.结果 对23株分枝杆菌参考菌株、267株临床分离菌株进行了检测.①对于参考菌株的两种样本,MPB64检测结果均为:结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌菌株阳性,其他20株非结核分枝杆菌为阴性.分群鉴定准确度为100%.②在111株BacT/ALERT 3D系统分离培养临床株中,55株为结核分枝杆菌,其中51株MPB64检测阳性;56株为非结核分枝杆菌,其中54株MPB64检测阴性.分群鉴定准确度为94.59%.③在156株改良罗氏培养基分离培养临床菌株中,121株为结核分枝杆菌,其中115株MPB64检测阳性;35株为非结核分枝杆菌,MPB64检测全部阴性.分群鉴定准确度为96.15%.④对于所有研究样本,应用MPB64分泌蛋白检测鉴定结核分枝杆菌复合群的敏感度、特异度与准确度分别为94.41%、98.20%和95.86%.结论 应用MPB64分泌蛋白检测鉴定结核分枝杆菌复合群是一种准确、快速、简便而又不需要任何仪器设备的实用型方法,值得临床推广应用.     

分枝杆菌分泌蛋白及膜蛋白的分离

目的探讨一种新发现的分枝杆菌Mycobac- terium Immunogenum分泌蛋白及膜蛋白的分离方法。方法1用7H9液体培养基培养分枝杆菌Mycobac- terium Immunogenum。2膜蛋白的分离采用酶消化及超声的方法。3分泌蛋白的分离采用Millipore公司的蛋白质浓缩滤器多次离心浓缩获得。4对分离的分枝杆菌Mycobacterium Immunogenum分泌蛋白及膜     

结核分枝杆菌全细胞C_9～C_(20)脂肪酸成份分析

目的分析结核分枝杆菌全细胞脂肪酸的种类与数量构成,以进一步揭示其生物学特征,为结核分枝杆菌的其它基础研究提供依据。方法应用Middlebrook 7H10琼脂培养基对临床分离培养的初代分枝杆菌培养物进行纯培养,对被鉴定为结核分枝杆菌的87株及结核分枝杆菌标准株H37Rv、H37Ra各1株应用气相色谱技术、采用峰面积归一化法定量分析碱处理细菌细胞释放出来并甲基化的细胞脂肪酸。结果1.各菌株均含有C14:0、C16:0、C18:0、C18:1ω9、10-Me-C18:0脂肪酸,其平均相对含量分别为:2.08%、39.78%、10.09%、21.21%和14.17%。C15:0、C16:1ω6、C17:0、C20:0脂肪酸为90%以上菌株含有组分,其平均相对含量分别为:1.15%、4.07%、2.91%和1.38%。C12:0、C16:1ω9、C16:1ω7、8-Me-C16:0、10-Me-C16:0、C17:1ω7、C17:1ω8为含量少且为只有部分菌株具有的细胞脂肪酸组分。所有菌株均不含C9、C10、C11、C13、C19脂肪酸。2.临床分离株脂肪酸的相对含量构成与H37Rv接近,而与H37Ra有较大差别。结论在C9~C20脂肪酸中,结核分枝杆菌主要含有C16:0、10-Me-C18:0、C18:0饱和脂肪酸与C18:1ω9、C16:1ω不饱和脂肪酸,并提示脂肪酸的组成特征可能与结核分枝杆菌毒力有关。     

MPB64抗原检测快速诊断结核分枝杆菌的临床价值

目的比较痰涂片抗酸染色、改良酸性罗氏培养、MPB64的免疫胶体金法用于检测结核分枝杆菌特异性的分泌蛋白质MPB64,评价MPB64的免疫胶体金法在结核分枝杆菌快速检测中的应用价值。方法选取438例确诊肺结核患者痰液,进行痰涂片抗酸染色、7H9液体培养基和改良酸性罗氏培养基培养、基于MPB64的免疫胶体金法检测,对结果进行比较分析。并选取痰涂片确认为阳性的标本33例,用米氏7H9液体培养和基于MPB64的免疫胶体金法进行检出时间对比。结果痰涂片阳性率为14.8%,罗氏培养阳性率为20.7%,7H9液体培养阳性率24.8%,MPB64的免疫胶体金法阳性率为25.1%。基于MPB64的免疫胶体金法在培养的第15天检出32例阳性;而单纯的7H9液体培养加抗酸染色检测法在第15天只检出11例阳性。结论7H9液体培养配合基于MPB64的免疫胶体金法可以作为一种较为敏感和特异的检测结核分枝杆菌感染的方法,并可以有效的区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。     

结核分枝杆菌休眠菌的复苏培养与初始菌量的关系

目的探讨复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌复苏作用与初始菌量的关系。方法取培养100d的陈旧结核分枝杆菌（休眠菌）,用7H9稀释成麦氏比浊1mg／ml,之后倍比稀释成0．5、0．25、0．125、0．0625、0．03125mg／ml。取12支无菌培养管,加入5ml7H9培养基并分为2组,每组依次加入上述各浓度结核分枝杆菌,第1组加入复苏因子蛋白质,第2组作为对照加入等体积7H9,37℃培养,分别在15、25、30、35d检测光密度值,并取1μ1培养液涂7H11平板培养,进行菌落计数。重复上述实验。结果0、15、25、30、35d分光光度计检测光密度（OD）值结果显示：各浓度组间细菌增殖呈直线正相关性（P〈0,05,P〈0．01）,即复苏因子对不同稀释浓度的复苏作用相同。7H11培养结果和OD值检测结果显示：各组两种方法检测结果呈直线相关性（P〈0．05,P〈001）,即两种方法检测结果有一致性。结论复苏因子对结核分枝杆菌休眠菌的复苏作用与初始菌量无关。     

DNA芯片鉴定分枝杆菌的研究

目的评价DNA芯片技术鉴定分枝杆菌菌种的应用价值,为临床实际应用提供科学依据。方法收集以BACTECMGIT960从结核病患者分离到的分枝杆菌阳性培养物,以传统分枝杆菌菌种鉴定方法为对照,应用DNA芯片技术进行菌种鉴定。结果两种方法鉴定结果一致和基本一致共112株,吻合率为83.6%(112/134),包括胞内分枝杆菌50株,龟分枝杆菌14株,结核分枝杆菌14株,戈登分枝杆菌9株,鸟分枝杆菌7株,偶然分枝杆菌7株,堪、瘰、胃和猿分枝杆菌6株,土分枝杆菌和海分枝杆菌各1株;未分类NTM3株。应用DNA芯片未能分类的17株分枝杆菌中,传统方法分别鉴定为戈登分枝杆菌5株、胞内分枝杆菌3株、龟分枝杆菌2株、蟾分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和浅黄分枝杆菌各1株,未分类NTM4株。结论用DNA芯片检测技术,可以简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,但有待进一步完善。     

结核分枝杆菌保护性抗原的研究进展

结核分枝杆菌（MTB）蛋白根据蛋白分布的位置可分为分泌蛋白、胞质蛋白和膜蛋白。分泌蛋白是MTB在早、中期分泌释放于菌体外的一组蛋白，游离于培养基中或在感染细胞的吞噬小体内，在菌体内仅有微量存在；而胞质蛋白主要存在于细菌的细胞质中，在细菌对数生长的晚期细菌死亡后才释放到培养基中。将培养不超过5d的滤液蛋白称为短期培养滤液蛋白，这是记忆性免疫CD4^＋T淋巴细胞的靶分子；将培养7d以上的滤液蛋白称为长期培养滤液蛋白，随着培养时间的延长，滤液中蛋白越来越多，由于部分MTB开始裂解死亡，释放胞质蛋白，培养42d时滤液中已有100多种蛋白质。结核病保护性免疫主要是细胞免疫，诱导细胞免疫反应的抗原主要存在于细胞壁、细胞质和培养滤液中，其中分泌蛋白和细胞壁表面的蛋白是主要的免疫保护性抗原，将成为新疫苗研究的首选靶抗原。现将保护性抗原的编码基因、生物学特性、免疫学功能等介绍如下。     

耐异烟肼和链霉素的结核分枝杆菌临床分离株与敏感株差异蛋白表达研究

目的 鉴定结核分枝杆菌对异烟肼和链霉素耐药相关的潜在蛋白。 方法 以药物敏感株（01105）和标准株H37Rv为对照,核素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)结合Nano液相色谱-串联质谱分析仪（LC-MS-MS）技术和生物信息学,鉴定并相对定量结核分枝杆菌对异烟肼与链霉素耐药的临床分离株02166菌体蛋白。 结果02166菌株分别与01105菌株和H37Rv菌株比较差异表达蛋白为153个和130个,02166菌株与01105菌株和H37Rv比较差异表达蛋白均为86个(共同差异表达蛋白)。差异表达蛋白理论相对分子质量和等电点分布广泛,相对分子质量从7.63~326.22,等电点从3.74~12.48,其主要参与中间代谢、呼吸作用和脂类代谢。共同差异表达蛋白：9个核糖体蛋白（Rv0056、Rv0651、Rv0652、Rv0701、Rv0719、Rv1630、Rv2785c、Rv2909c和Rv3458c）在02166菌株中表达下调;5个蛋白（Rv0234c、Rv2466c、Rv2626c、Rv2986c和Rv3118）在02166菌株中呈显著差异表达,其中琥珀酸半醛脱氢酶（Rv0234c）和假定未知蛋白（Rv2466c）在02166菌株中表达上调倍数>1.2,DNA结合蛋白HU同系物hupB（Rv2986c）、假定未知蛋白(Rv2626c和Rv3118)在02166菌株中表达下调倍数<0.5。 结论iTRAQ发现了耐异烟肼和链霉素的结核分枝杆菌临床分离株差异表达蛋白,为进一步探讨结核分枝杆菌异烟肼或链霉素耐药机制奠定了基础。     

结核病诊断性血清学特异抗原的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定结核病患者血清抗体特异性识别的结核分枝杆菌抗原。方法 于改良罗氏培养基中培养结核分枝杆菌标准株H37Rv 4周,收集菌体,通过冰浴超声法提取结核分枝杆菌菌体抗原。收集2013年2—7月湖南省结核病防治所首次入院的30例初治结核病患者的血清,以及收集2013年7月湖南省人民医院检验科接收的20名健康体检者的血清。通过饱和硫酸铵沉淀法提取纳入的20例结核病患者的血清IgG,从结核分枝杆菌菌体抗原中免疫共沉淀血清学抗原,以纳入的其余10例结核病患者血清免疫印迹(Western blot,WB)验证其免疫反应性;从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上切割阳性反应的蛋白质条带,通过串联质谱技术进行鉴定。结果 免疫共沉淀获得1条相对分子质量为16000(16kDa)、能被结核病患者血清抗体特异性识别的蛋白质条带;经串联质谱鉴定,获得结核分枝杆菌热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)16.3、糖基转移酶蛋白、铁调控Lsr2蛋白前体等3种蛋白抗原。结论 采用免疫共沉淀偶联质谱技术获得3种结核分枝杆菌血清学抗原,可为结核病血清学诊断性抗原的选择进一步提供依据。