雷帕霉素对白血病SUP-B15细胞株HIF-1α、VEGF表达的影响

目的:观察雷帕霉素对人急性淋巴细胞白血病SUP-B15细胞的生长及HIF-1α、VEGF表达的影响.方法:实验分为雷帕霉素处理组和对照组,雷帕霉素处理组以含不同终浓度雷帕霉素( 10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/C)的IMDM培养处理,对照组以相同体积细胞IMDM培养液培养,并于处理后24 h、48 h、72 h观察各组细胞形态,实时荧光定量PCR检测HIF-1α及VEGF mRNA的表达.结果:雷帕霉素处理后SUPB15活细胞数量减少,死细胞数量增加,可见细胞抱团生长、胞膜出泡、细胞破碎等现象,随药物浓度升高和作用时间增加变化程度明显.瑞氏染色观察可见,雷帕霉素处理组早期无明显变化,处理后期(72 h)细胞出现明显空泡样改变,并呈浓度依赖关系;雷帕霉素处理组细胞HIF-1α mRNA的表达在24h变化不明显;48 h时,10 nmol/L、100nmol/L雷帕霉素处理细胞HIF-1 αmRNA的表达上调,20 nmol/L、50 nmol/L雷帕霉素处理细胞HIF-1α表达下调;72 h时,各浓度的雷帕霉素对HIF-1αmRNA的表达均呈上调趋势;在雷帕霉素处理后,除较低浓度(10 nmol/L、20 nmol/L)雷帕霉素处理72 h外,SUP-B15细胞的VEGF mRNA表达均呈显著下调.结论:雷帕霉素可抑制SUP-B15细胞生长,导致形态明显改变,并能下调SUP-B15细胞VEGF mRNA的表达.     

体外共培养诱导骨髓间充质干细胞向雪旺细胞分化

目的:观察体外雪旺细胞环境对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的诱导分化作用。方法:分离和体外培养新生大鼠MSCs和雪旺细胞;实验组MSCs经DAPI标记后与雪旺细胞按1∶2比例共培养,观察细胞的形态变化,在第1,3,6天时使用免疫细胞化学染色检测MSCs中Nestin,GFAP及S-100表达。对照组MSCs单独培养,其余处理与实验组相同。结果:共培养1 d后部分MSCs出现雪旺细胞样形态,Nestin表达率为(83.4±3.5)%,随时间增加而降低。GFAP及S-100表达率随时间而增加。对照组细胞形态无变化,不同时间点均有少量MSCs表达Nestin,而GFAP和S-100未见表达。结论:MSCs可通过体外共培养向雪旺细胞分化。     

葫芦素B抑制JAK2/STAT3信号拮抗非小细胞肺癌H1975细胞增殖的研究

目的:证明葫芦素B通过影响JAK2/STAT3信号活化抑制非小细胞肺癌(NSCLC)H1975细胞增殖。方法:采用不同浓度葫芦素B作用于H1975细胞不同时间,采用CCK-8法测定细胞增殖抑制情况,采用PI染色法检测细胞周期分布,采用Western blot法测定EGFR、JAK2、STAT3蛋白表达。结果:葫芦素B浓度10、100、1 000 nmol/L作用24、48 h的细胞增殖抑制率均高于葫芦素B浓度0 nmol/L,其中1 000 nmol/L100 nmol/L10 nmol/L(P0.05)。葫芦素B浓度10、100、1 000 nmol/L作用48 h的细胞增殖抑制率均高于作用24 h(P0.05)。细胞增殖抑制率随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长逐渐增高(P0.05)。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用24、48 h的G2/M期阻滞率均高于葫芦素B浓度0、10 nmol/L,其中1 000 nmol/L100 nmol/L(P0.05)。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用48 h的G2/M期阻滞率均高于作用24 h(P0.05)。G2/M期阻滞率随着葫芦素B浓度增加和作用时间延长逐渐增高(P0.05)。葫芦素B浓度100、1 000 nmol/L作用H1975细胞后p-STAT3与p-JAK2的表达均低于葫芦素B浓度0、10 nmol/L,其中1 000 nmol/L100 nmol/L(P0.05)。结论:葫芦素B能够抑制H1975细胞增殖、阻滞细胞周期,其机制与葫芦素B抑制JAK2/STAT3信号活化有关。     

迷走神经递质P物质对人类肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其分子机制

目的探讨迷走神经递质P物质对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其相关分子机制。方法实时荧光定量PCR及琼脂糖凝胶电泳检测并分析两种人肝癌细胞株Hep G2和SMMC-7721中神经肽-1(NK-1)受体表达;Cell Titer Blue检测不同浓度P物质(0、100、250、500 nmol/L)在不同时间点(0、24、48、72、96、120 h)对肝癌细胞增殖能力的影响;肝癌细胞均经不同浓度的(0 nmol/L,对照组;100 nmol/L,实验组)P物质处理48 h,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭功能,Western blot检测细胞中上皮-间质转化蛋白质标志表达变化,实时荧光定量PCR及Western blot检测NK-1受体表达变化。结果 Hep G2和SMMC-7721两种人肝癌细胞中均有NK-1受体表达;不同浓度P物质(0、100、250、500 nmol/L)在96 h内不影响两种细胞的增殖能力(P>0.05),而在120 h 250 nmol/L和500 nmol/L P物质可抑制两种细胞增殖(P<0.05);100 nmol/L P物质明显促进两种细胞迁移和侵袭能力(P<0.05);与对照组相比,实验组细胞NK-1受体表达明显上调(P<0.05),同时,细胞中上皮-间质转化蛋白质标志E-Cadherin表达下调,N-Cadherin和Slug表达上调(P<0.05)。结论迷走神经递质P物质与人肝癌细胞中表达的NK-1受体相互作用并使其表达上调,促进细胞发生上皮-间质转化,进而提高其侵袭转移能力。     

胰岛素对血管内皮细胞衰老及Akt表达的研究

目的:探讨胰岛素对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)衰老及Akt表达的影响。方法:不同浓度的胰岛素(对照组、1 nmol/L、10 nmol/L、胰岛素100 nmol/L)加入体外培养的人脐静脉内皮细胞,24 h后β半乳糖酶染色检测细胞衰老率和免疫组化检测Akt活性。结果:与对照组比较,1 nmol/L组和10 nmol/L组细胞衰老程度降低,Akt表达上调。但随着浓度增加,100 nmol/L组细胞衰老反而加重。而Akt表达无统计学差异。结论:低浓度胰岛素可延缓内皮细胞衰老,可能与Akt基因表达上调有关。而高浓度胰岛素加重细胞衰老,其机制可能与Akt蛋白无关。     

姜黄素对人卵巢癌SK细胞增殖活性及PCNA、P53 mRNA表达的影响

目的探讨姜黄素抗卵巢癌SK细胞增殖活性的作用及机制。方法培养好的人卵巢癌SK细胞,分别加入10、20、30、40、50μmol/L姜黄素,对照组加等量溶剂二甲基亚砜(DMSO),分别孵育24、48 h,应用MTT方法和细胞计数方法测定SK细胞生长抑制率。40μmol/L姜黄素孵育48 h后,收集细胞,RT-PCR方法测定PCNA和P53 mRNA的表达。结果姜黄素对SK细胞增殖具有明显的抑制作用。在10～50μmol/L浓度范围内,姜黄素对SK细胞增殖的抑制率随浓度增高和时间延长而增加。40μmol/L姜黄素处理SK细胞48 h后,PCNA mRNA表达显著下降(P<0.01),P53 mRNA表达显著上升(P<0.01)。结论姜黄素可通过下调PCNA表达、上调P53 mRNA表达,发挥其抑制卵巢癌SK细胞增殖的作用。     

绞股蓝皂苷对体外培养神经前体细胞增殖的影响

目的 探讨不同浓度绞股蓝皂苷(GPs)对体外培养的神经前体细胞(NPCs)增殖能力的影响.方法 从孕14d大鼠胚胎端脑分离NPCs,体外贴壁培养7d传代.传代第1代细胞培养3d,免疫荧光法鉴定NPCs纯度后进行分组实验.加不同浓度GPs(0、25、50、100、200、400μg/mL)作用48h后再次鉴定NPCs纯度,采用MTT法检测细胞活力、细胞计数绘制生长曲线、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)掺入法检测细胞增殖能力、Western blot法检测细胞内增殖细胞核抗原(PCNA)表迭情况.结果 传代第1代培养3d的NPCs纯度达97%,GPs作用后不影响NPCs纯度,可使细胞活性增强,生长速度加快,BrdU阳性率增高,PCNA表达水平上调.结论 GPs可通过提高PCNA的表达量,促进体外培养的NPCs增殖,100μg/mL为GPs最佳作用浓度.     

FK866对非小细胞肺癌细胞迁移的影响

目的: 探讨低浓度烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）抑制剂FK866对人非小细胞肺癌细胞株（A549细胞）迁移的影响及作用机制。方法: MTT法检测不同浓度FK866对A549细胞增殖的影响;划痕实验检测1.0 nmol/L和10.0 nmol/L FK866对A549细胞迁移的影响;实时定量RT-PCR检测上皮间质转化相关蛋白上皮钙黏素和波形蛋白mRNA的表达量;蛋白质印迹法检测细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）和磷酸化ERK1/2蛋白的表达量。结果: FK866作用时间越长、浓度越高,对A549细胞增殖的抑制作用越明显。FK866作用72 h时的半抑制浓度（IC₅₀）为9.55 nmol/L。以1.0、10.0 nmol/L的FK866预处理细胞48 h,划痕后继续给药48 h,两种浓度的FK866均能抑制A549细胞迁移;如不进行预处理,仅10.0 nmol/L浓度的FK866对划痕愈合有一定的抑制作用;1.0 nmol/L的FK866处理细胞72 h可上调上皮钙黏素和波形蛋白mRNA表达,并激活ERK1/2;以1.0 mmol/L的烟酰胺单核苷酸（NMN）或10.0 μmol/L的ERK1/2抑制剂U0126预处理,能够逆转FK866引起的上皮钙黏素和波形蛋白表达上调。结论: 低浓度FK866能够通过减少细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和激活ERK1/2,增加上皮钙黏素表达,进而抑制细胞迁移,对肿瘤转移可能有一定的抑制作用;但其同时促进了波形蛋白的表达,不利于肿瘤的治疗。     

迷迭香酸对醛固酮诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响及机制研究

目的:探讨迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)对醛固酮(aldosterone,ALD)诱导的人肾小管上皮细胞转分化的影响及其作用机制。方法:将体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2),分为5组:正常对照组、ALD(100nmol/L)诱导组、ALD(100nmol/L)+RA(5μg/ml)干预组、ALD(100nmol/L)+RA(25μg/ml)干预组、ALD(100nmol/L)+线粒体呼吸链酶抑制剂rotenone(ROT,10μmol/L)干预组。应用倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;应用RT-PCR、Western blot检测波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及钙粘蛋白(E-cadherin)的表达水平;采用Western blot检测细胞胞外信号调节激酶(ERK1/2)的磷酸化水平;DCFDA荧光法定量检测活性氧(ROS)表达情况。结果:①与对照组相比,醛固酮诱导肾小管上皮细胞从原有典型的上皮细胞形态转变为长梭形肌成纤维细胞样形态;Vimentin和α-SMA表达显著上调,E-cadherin表达下降;ERK1/2磷酸化水平增高;活性氧族(ROS)释放显著...     

Visfatin通过线粒体途径抑制胰岛β细胞凋亡

目的 探讨内脏脂肪素(visfatin)对棕榈酸诱导胰岛β细胞凋亡的影响.方法 小鼠胰岛β细胞株MIN6体外传代培养,进入对数生长期后进行实验.MTT法检测不同浓度visfatin(0～10-7 mol/L)作用24～72 h后MIN6细胞活力变化.流式细胞术检测0.5 mmol/L棕榈酸和(或)10-8 mol/L visfatin处理24 h后MIN6细胞凋亡率的变化;Western blotting检测MIN6抗凋亡蛋白bcl-2、bax、激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的变化.结果 Visfatin作用24～48 h,MIN6细胞活力呈剂量依赖性增加(P<0.05).流式细胞仪检测发现,10-8 mol/L visfatin处理24 h可明显降低棕榈酸诱导的细胞凋亡率(P<0.05);Western blotting结果 表明,10-8 mol/L visfatin可显著抑制棕榈酸引起的细胞内源性bcl-2表达的下调及激活型caspase-3和胞质细胞色素C表达的上调(P<0.05).结论 Visfatin可促进胰岛β细胞增殖,并通过细胞内线粒体途径抑制由棕榈酸诱导的胰岛β细胞凋亡.     

吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤大鼠海马神经元Bcl-2、Bax表达的影响

目的:观察吡咯喹啉醌(PQQ)对谷氨酸损伤海马神经元存活和Bcl-2、Bax表达的影响。方法:原代培养胚鼠海马神经元,谷氨酸损伤15min后加入不同浓度的PQQ(50、100、200μmol/L)孵育24小时,采用MTT法检测细胞活性;Western blot法检测Bcl-2、Bax的表达。结果:不同浓度PQQ均可明显改善谷氨酸损伤后细胞的活力,增加Bcl-2/Bax的比值,且随浓度增加比值增高。结论:PQQ对谷氨酸损伤的海马神经元具有一定保护作用。     

不同浓度葛根素对体外培养血管内皮细胞增殖的影响

目的：观察不同浓度葛根素对体外培养血管内皮细胞增殖的影响。方法：取3只5d龄SD大鼠·分离心脏，在体外消化收集血管内皮细胞并进行培养，第3代细胞用于实验。除空白对照组外·血管内皮细胞分别于含0．01、0．1、1、10和100umol／L葛根素的培养基中进行培养。24h后纠置显徽镜下观察细胞形态并进行细胞计数，采用甲基噻唑基四唑比色法、免疫组织化方法和流式细胞仪检测血管内皮细胞的增殖情况。结果：与空白对照组比较，1、10和100umol／L葛根素组血管内皮细胞细胞计数增加（P〈0．05，P〈0．01）·增殖细胞梭抗啄阳性细胞比率及细胞分裂增殖指数增加（P〈0．05，P〈0．01）．结论：葛根素对体外培养的血管内皮细胞有明显的促进增殖作用，其作用与葛根素的剂量有关。     

米贝地尔增强3，3′二吲哚甲烷对肝癌细胞的抑制作用

目的: 探讨T型钙通道阻滞剂米贝地尔对3,3′二吲哚甲烷（3,3′-diindolylmethane, DIM）抗肝癌效应的影响及其潜在的分子机制。方法： 选用肝癌SMMC-7721和HepG2细胞,分别设4组,对照组用含10%胎牛血清的高糖培养基培养24.5 h;米贝地尔组用5 μmol/L米贝地尔处理24.5 h;DIM组用60 μmol/L DIM处理24.5 h;米贝地尔+DIM组用5 μmol/L米贝地尔预处理0.5 h,再与60 μmol/L DIM共同处理24 h;采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化;采用CCK-8法检测各组细胞增殖活力;Hoechst 33342染色观察细胞凋亡水平,蛋白免疫印迹法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）、裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleaved caspase 3）以及磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（phosphorylation of p38 mitogen activated protein kinase,p-p38 MAPK）表达水平;以Fluo 3/AM为探针,观察肝癌细胞胞质游离钙（cytosolic free calcium,［Ca2+］i）水平。结果： 与对照组相比,DIM组细胞增殖活力下降,PCNA表达明显降低,凋亡水平升高,cleaved-caspase 3、p-p38 MAPK表达水平明显升高（P均<0.05）;部分细胞形态消失,［Ca2+］i荧光增强。与DIM组相比,米贝地尔+DIM组细胞增殖活力明显降低,PCNA表达明显下降,凋亡水平进一步升高,且cleaved-caspase 3、p-p38 MAPK表达水平进一步升高（P均<0.05）;多数细胞形态消失,［Ca2+］i荧光增强更明显。结论： T型钙通道阻滞剂米贝地尔可增强DIM抗肝癌作用,可能与［Ca2+］i水平增加以及p p38 MAPK表达升高有关。     

siRNA沉默细胞周期蛋白A2基因对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

目的研究siRNA对骨肉瘤MG-63细胞株及正常成纤维细胞细胞周期蛋白cyclin A2基因表达的抑制及对细胞增殖的影响。方法设计并化学合成靶向cycllnA2基因的siRNA,用oligofectamine将其转染到骨肉瘤细胞系MG-63及正常人成纤维细胞（HSF）中,用无义siRNA转染作为阴性对照,以单加缓冲液磷酸盐缓冲液（PBS）作为空白对照,实时-聚合酶链反应（PCR）、Western印迹方法检测cyclinA2基因沉默效果,采用MTT、RT-PCR、流式细胞、平板克隆培养等方法评价cycllnA2基因表达后被抑制后细胞的生长状态,同时检测细胞PCNA及cyclinB1基因表达的改变。结果1、10、50、100nmol／L浓度的cyclinA2-siRNA分别使MG-63细胞cyclinA2基因表达降低了9．4％,56．4％,79．2％和84．3％,同时cyclinA2蛋白表达也相应降低。转染10nmol／L及50nmol／LsiRNA后48h,MG-63细胞增殖抑制分别达到39．1％及54．9％,细胞周期阻滞于G0／G1期,平板克隆形成率降低,细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）及cyclinB1的mRNA表达水平明显下降。对正常成纤维细胞HSF,50nmol／LcyclinA2-siRNA可抑制58．1％的cyclinA2基因及蛋白表达,其导致细胞周期出现轻度改变,但细胞的增殖及平板克隆形成能力未受影响。结论cyclinA2是肿瘤细胞增殖所依赖的关键基因,针对cyclinA2基因的siRNA能有效降低细胞中cyclinA2mRNA及蛋白的表达,其能抑制骨肉瘤细胞的生长而对正常细胞的增殖影响很小,靶向cyclinA2的siRNA有望成为治疗骨肉瘤的新途径。     

柚皮素对人髓系白血病K562细胞增殖的作用

目的:探讨柚皮素(naringenin)对人慢性髓系白血病K562细胞株生长的影响及其作用机制。方法:MTT法检测柚皮素在不同浓度、不同时间对K562细胞的影响;倒置显微镜下,Wight-Giemsa染色(W-G染色),免疫荧光染色和透射电镜下观察细胞形态变化、凋亡发生情况以及超微结构的变化;并用流式细胞仪分析细胞周期分布,用免疫组织化学的方法检测细胞增殖核抗原(PCNA)的表达。结果:柚皮素对K562细胞增殖有明显抑制作用,作用24,48和72 h后的半数抑制浓度(IC50)分别为455,225和175μmol/L;柚皮素处理组细胞在普通光镜和电镜下均见观察到显著的增殖抑制和典型的细胞凋亡形态学改变;流式细胞仪分析证实柚皮素能使K562细胞聚积在G0/G1期,S期细胞减少;在处理组PCNA的表达显著低于对照组。结论:柚皮素对K562细胞具有明显的增殖抑制作用,这一作用可能是通过细胞周期阻滞和诱导凋亡两种机制实现的。     

吡咯喹啉醌对培养的鼠海马神经元的促生长作用

目的:探讨吡咯喹啉醌(PQQ)对培养海马神经元的促生长作用。方法:原代培养新生大鼠海马神经元,观察PQQ对海马神经元胞体、突起生长和存活率的影响,测定MTT代谢率和脂褐素。结果:PQQ处理后,海马神经元突起的长度和胞体的长径显著大于对照组,细胞的存活率增加、存活的时间延长,尼氏小体的光密度值和MTT代谢率显著高于对照组,脂褐素的含量降低。结论:PQQ能促进海马神经元的生长,增加其存活率、延长存活时间。     

醛固酮对系膜细胞合成纤溶酶原激活剂抑制物-1的影响

目的 探讨醛固酮及阻断其受体后对系膜细胞生成纤溶酶原激活剂抑制物1（PAI-1）的影响。方法 醛固酮单独刺激大鼠系膜细胞24h以及采用螺内酯阻断后,用RT-PCR观察系膜细胞PA1-1mRNA的变化;用Western印迹方法检测细胞上清液中的PA1-1;采用ELISA方法测定细胞上清液中转化生长因子p1（TGF-β1）的含量;采用激光共聚焦检测系膜细胞内的活性氧（ROS）水平。观察不同浓度及不同作用时间的醛固酮刺激系膜细胞对PA1-1mRNA的影响。结果 醛固酮使系膜细胞PA1-1mRNA及蛋白表达明显升高,同时升高了TGF-β1的表达和细胞内的ROS水平。醛固酮使PA1-1mRNA表达呈剂量依赖性增加。100nmol／L醛固酮刺激系膜细胞4h后PA1-1mRNA表达才明显增加。加用螺内酯后使升高的PA1-1、TGF-β1表达以及细胞内ROS恢复到正常水平。结论醛固酮能独立促进大鼠系膜细胞分泌PA1-1的增加,同时醛固酮使TGF-β1表达以及细胞内ROS水平升高,而这些都是通过盐皮质激素受体介导的。     

佛波酯对食管癌EC9706细胞NDRG_1表达及细胞增殖影响的研究

目的:探讨12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)作用于食管癌细胞EC9706后,对NDRG1mRNA表达、细胞增殖、细胞周期的影响。方法:采用50nmol/L的TPA作用于EC9706细胞,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期的变化,原位杂交法检测NDRG1mRNA水平。结果:TPA能上调NDRG1mRNA水平,抑制EC9706细胞增殖,细胞周期发生G1→S期阻滞。结论:TPA可能通过上调NDRG1mRNA的表达而抑制EC9706增殖,促进其分化。     

Survivin反义寡核苷酸诱导肺癌细胞株凋亡的研究

目的: 探讨生存素(Survivin)的反义寡核苷酸(A SO DN)对肺癌细胞株的作用。方法: 在脂质体介导下,分别以100 nmol/L、300 nmol/L和500 nmol/L的Survivin A SO DN作用于小细胞肺癌细胞株NCI-H446和肺腺癌细胞株SPC-A1,于24 h、48 h、72 h用逆转录聚合酶链反应(RT-P CR)检测Survivin mRNA表达,Western blot检测Survivin蛋白,流式细胞仪检测凋亡。结果: NCI-H446和SPC-A1皆表达Survivin基因和蛋白。随着ASODN浓度增加,Survivin mRNA明显下调,其差异有显著性,其中ASODN 500 nmol/L作用72 h时两种细胞Survivin mRNA抑制率分别达62.72%和67.43%;Survivin蛋白表达也有类似的变化;ASODN对两种细胞生长抑制和诱导凋亡作用随浓度增大和作用时间延长而增强。结论: Survivin ASODN能够抑制肺癌细胞株Survivin基因和蛋白表达,呈时间、浓度依赖性,诱导凋亡的效果也呈剂量、时间依赖性,500 nmol/L的浓度作用72 h效果最佳。