杜氏盐藻高盐诱导蛋白的分离和鉴定

目的:对高盐和低盐培养条件下杜氏盐藻蛋白质组的双向电泳(2-DE)图谱进行比较分析,筛选高盐诱导蛋白并鉴定.方法:提取高盐(3.5 mol/L NaCl)和低盐(1.5 mol/L NaCl)培养条件下杜氏盐藻的总蛋白并进行2-DE,考马斯亮蓝染色后用Image-Scanner扫描仪扫描,ImageMaster 5.0...     

双向电泳两种凝胶染色方法的比较

目的比较肾脏蛋白质双向电泳凝胶银染色法与考马斯亮蓝G-250染色方法的染色效果。方法利用蛋白质固相pH梯度双向电泳技术分离SD大鼠肾脏组织蛋白,应用银染色和考马斯亮蓝G-250染色两种染色方法,及ImageMaster 2D5．0凝胶分析软件对凝胶进行染色分析。结果银染后的可见蛋白点比考马斯亮蓝染色法多,银染色法与考马斯亮蓝染色法平均匹配率为49．42％。结论银染法比考马斯亮蓝染色法的灵敏度高。     

霍乱弧菌菌体蛋白双向电泳技术的建立

目的 建立霍乱弧菌全菌体蛋白的双向电泳技术,获得分辨度高、重复性好的双向电泳图谱.方法 利用适当的裂解液处理霍乱弧菌,提取全菌蛋白;采用pH梯度等电聚焦对全菌蛋白进行双向电泳;考马斯亮蓝染色后获得的双向电泳图谱,并利用ImageMaster 2D Elite 5.0图象分析软件进行分析,所得的数据用SPSS15.0进行统计分析.结果 得到了(1081±16)个蛋白斑点,蛋白主要集中在pI 4.24～7.20之间,重复胶的匹配点数为(1057±28),匹配率为97.85%.结论 建立了霍乱弧菌全菌双向电泳分析方法,2-DE图谱中蛋白位点的分辨率和重复性非常高,获得了较为理想、清晰的双向电泳图谱,为进一步研究其蛋白质组学奠定了基础.     

人白细胞蛋白质的提取及双向电泳分析

目的 :建立人白细胞蛋白质提取及双向电泳分析方法 ,为构建白细胞在不同生理或病理条件下的蛋白质表达谱或进行蛋白质表达的差异分析奠定基础。方法 :取人全血 ,分离白细胞 ,提取蛋白质 ,双向电泳分离 ,考马斯亮蓝R - 2 5 0染色获得蛋白质的电泳分离图谱 ,利用PDQuest2D分析软件进行图像分析 ,结合SWISSSPORT蛋白质数据库对白细胞蛋白质斑点进行初步鉴定。结果 :所得双向电泳图谱中各点分离清晰 ,无明显横向或纵向拖尾 ,分析显示图谱上有 2 12个蛋白质斑点 ,主要集中在pH4 .75～ 6 .81之间 ,其中高丰度蛋白斑点有 36个点 ,低丰度的蛋白质斑点约 176个 ,对其中 6个高丰度蛋白质斑点初步鉴定可知这些蛋白质为 :CAN2 (MW :77975 .95pI:4 .84 )、I17R(MW :94 4 15 .6 3pI:4 .90 )、CARF(MW :5 130 2 .6 5pI:5 .82 )、FIG1(MW :6 8184 .0 6pI:6 .2 9)、PIGR(MW :82 96 9.32pI:5 .2 2 )、F16P(MW :36 781.2 8pI:6 .18)。结论 :本实验建立了人白细胞蛋白质的双向电泳分析方法 ,图谱分离、染色效果好 ,能满足 2 -DE专业软件分析的要求 ,为后续白细胞的蛋白质组研究奠定了基础。     

用双向电泳及蛋白质印迹技术筛选乳腺癌相关抗原

目的：应用双向电泳及免疫印迹技术分析乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,寻找乳腺癌相关抗原。方法：提取乳腺癌MCF-7细胞总蛋白,双向电泳技术（2-DE）对总蛋白进行分离后转膜,将健康人血清（对照组）和乳腺癌患者血清（实验组）作为一抗进行蛋白质印迹（Western blotting）分析,寻找杂交蛋白点的差异。结果：MCF-7总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱共检测到248个蛋白质斑点,Western blotting显示实验组抗原抗体反应点23个,对照组为13个,找到10个差异蛋白点。结论：乳腺癌患者血清中的抗体表达水平有改变,这10个差异蛋白点有可能是乳腺癌相关抗原。     

多囊卵巢综合征患者血清蛋白质双向凝胶电泳技术条件优化

目的探讨多囊卵巢综合征（PCOS）患者外周静脉血血清蛋白质的双向凝胶电泳条件优化。方法对去除血清中的高丰度蛋白与否、不同蛋白质上样量、固相pH梯度（IPG）胶条的pH值范围、水化上样液体积、水化时间进行双向电泳实验结果比较。结果将去除高丰度蛋白血清样品中300μg蛋白质溶解于终体积为400μl水化上样液,水化14h,应用pH4～7的IPG胶条和浓度12％的SDS—PAGE凝胶进行双向电泳,得到图象清晰,蛋白斑点数为369个蛋白质二维图谱。结论优化了PCOS血清双向凝胶电泳的条件,得到分辨率较好的PCOS血清的蛋白图谱,创造了进一步开展PCOS血清蛋白质组图谱分析条件。     

几种不同提取方法对Hela细胞总蛋白双向电泳结果的影响

目的比较几种不同的提取方法对Hela细胞总蛋白双向电泳图谱的影响。方法采用反复冻融裂解法、超声加冰浴裂解法、室温振摇及试剂盒纯化法提取Hela细胞总蛋白,进行双向凝胶电泳(2-DE)。以7cmpH3-10NL固相pH梯度胶条做一向等电聚焦,上样量为300μg,SDS-PAGE做二向垂直电泳,改进的胶体考马斯亮蓝染色,ImageMaster2D Platinum软件分析电泳图谱。结果反复冻融裂解法得到的2-DE图谱条纹很多,蛋白点数较少(400±);超声加冰浴裂解和室温振摇法得到的2-DE图谱横向条纹明显减少,蛋白点数明显增加(分别为700±和800±);进一步用试剂盒纯化法得到的2-DE图谱基本上没有蛋白拖尾现象,且加Destreak试剂后蛋白点数有所增加(由800±→900±),但纯化的同时有低丰度蛋白的丢失。结论超声加冰浴裂解和室温振摇法处理细胞,可得到条纹较少、蛋白点数较多较全的2-DE图谱;进一步用蛋白纯化试剂盒和Destreak试剂纯化样品能更好地解决碱性端的横向拖尾,得到较多的蛋白点。     

3种方法提取胸腺组织蛋白双向电泳纯化结果比较

目的:选择合适的胸腺组织蛋白质提取和纯化方法.方法:分别采用组织裂解液法、丙酮沉淀法和蛋白纯化试剂3种方法提取7例重症肌无力患者胸腺组织蛋白质,上样量为1 mg蛋白,以17 cm pI 3～10 固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦,SDS-PAGE垂直电泳为第二向进行双向电泳(2-DE),考马斯亮蓝染色,图像分析软件分析电泳图谱.结果:利用蛋白纯化试剂法提取的胸腺组织蛋白2-DE凝胶图像纵条纹、横条纹以及背景都明显减少,获得蛋白点数量较其他2种方法增加(P均＜0.05).结论:采用蛋白纯化试剂法提取胸腺组织蛋白,能够获得较好2-DE凝胶图像,为胸腺组织蛋白质组学的研究打下基础.     

结肠癌蛋白质双向电泳技术的建立

目的:建立结肠癌双向电泳技术.方法:利用不同体积的裂解液提取结肠癌中的蛋白质,并通过不同的蛋白质上样量(1mg,2mg,3mg),不同样品制备方式,进行双向电泳,考马斯亮蓝染色,图谱分析.结果:在等电点3～10,分子量6.5～200ku范围内分离得到蛋白质斑点为,1mg蛋白质上样量为658个蛋白质斑点,2mg为820个,3mg为845个斑点.2mg蛋白质上样量的双向电泳图谱更清晰,分离更好.制备方式2可以满足双相电泳的需要.结论:成功建立了结肠癌蛋白质的双向电泳技术.     

脑脊液双向电泳中去除高丰度蛋白技术的研究

目的 建立一种去除脑脊液高丰度蛋白的方法并进行双向电泳分析评价。方法 采用超滤法浓缩脑脊液样品至适当体积,用商业化血清白蛋白和免疫球蛋白G（IgG）去除试剂盒处理,得到含低丰度蛋白的脑脊液,再用丙酮沉淀法除盐并进行二维凝胶电泳（2-DE）分析和2-DE Western blot鉴定。结果 此法可有效去除脑脊液中的白蛋白和IgG,2 DE图谱分析显示,去除高丰度蛋白后脑脊液低丰度蛋白富集明显,与2-DE Western blot结果对比,四连接素的三个不同片段去除高丰度蛋白后可全部显现。结论 本研究建立的脑脊液高丰度蛋白去除方法简便易行,有利于双向电泳中低丰度蛋白的检出。     

霍乱弧菌O1群稻叶型流行株和非流行株的蛋白质谱特征分析

目的探讨霍乱弧菌O1群稻叶型流行株和非流行株的蛋白表达的差异。方法利用裂解液处理霍乱弧菌,提取全菌蛋白;采用pH梯度等电聚焦对菌蛋白进行双向电泳;考马斯亮蓝染色后获得的双向电泳图谱,并利用ImageMaster2DElite5.0图象分析软件进行分析,找出差异蛋白;在此基础上,胰蛋白酶消化这些特殊差异蛋白,并进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析。结果获得了(1081±16)个蛋白斑点,蛋白主要集中在pI4.00～7.20之间,重复胶的匹配点数为(1057±28),匹配率为97.85%;发现了有明显差异的21个蛋白点,并进行了质谱鉴定。结论获得了霍乱弧菌O1群稻叶型流行株和非流行株的差异表达蛋白。     

喉鳞形细胞癌比较蛋白质组的初步研究

目的:研究喉癌及癌旁喉正常黏膜组织蛋白质组的差异表达.方法:用固相pH梯度双向凝胶电泳分离喉癌及癌旁喉正常黏膜组织总蛋白质,考马斯亮蓝染色显色、ImageMaster 2D软件分析所获得的双向凝胶电泳图谱,找出差异表达的蛋白质点.取差异表达的蛋白质点进行质谱鉴定.结果:获得分辨率和重复性均较好的双向凝胶电泳图谱,并找出在喉癌和癌旁喉正常黏膜组织差异表达的33种蛋白质.其中有22种蛋白质在喉癌组织中表达上凋,11种蛋白质表达明显下调.随机取10个在喉癌组织中表达上调的蛋白点进行质谱指纹图分析,查询数据库初步鉴定出了8个蛋白质.结论:本研究建立了分辨率和重复性较强的喉癌及喉正常黏膜组织蛋白质组表达图谱,且两者蛋白质的表达明显不同,差异表达的蛋白质可能成为潜在的诊断喉癌的肿瘤标志物和治疗靶分子,对探讨喉癌的发生机制有重要意义.     

脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证蛋白质组学比较研究

目的 建立脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,初步分析其差异蛋白质表达情况.方法 双向凝胶电泳(2-DE)分离脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清标本,考马斯亮兰染色,PD-QUEST图像分析系统分析,从凝胶中选取分离较好的蛋白质点,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获取肽质量指纹图谱(PMF),Mascot软件搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质,对差异蛋白质进行组间对比.结果 获得了分辨率较好的脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证双向凝胶电泳图谱,质谱分析了29个差异蛋白质点,获取了87张肽质量指纹图谱,通过查询数据库鉴定了29个蛋白质,其中部分蛋白质与肝阳化风证及阴虚风动证发生发展有关.结论 建立了脑梗死肝阳化风证与阴虚风动证血清双向凝胶电泳图谱,并应用质谱技术鉴定了部分差异蛋白质点,为脑梗死肝阳上亢证与阴虚风动证与正常组血清双向凝胶电泳图谱血清蛋白质组数据库的建立提供了有意义的数据,并认为蛋白质组学能在脑梗死不同证型具有代表意义.     

重症肌无力胸腺组织蛋白质组双向电泳方法的建立

目的:建立和优化重症肌无力(MG)胸腺组织蛋白质组双向电泳技术方法.方法:提取MG患者(n=3)增生型胸腺组织蛋白,以固相pH梯度胶条做第一向等电聚焦电泳,SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳为第二向.在以上过程中分别对蛋白提取、等电聚焦程序(A、B、C、D)和凝胶染色方法等各个实验环节进行控制和优化,利用PDQuest 7.1.1软件分析获得的二维凝胶图像.结果:①采用一步法提取胸腺组织蛋白质,第一向等电聚焦采用7cm IPG胶条,聚焦程序选择B,硝酸银染色.3例标本重复4次,共获12幅二维凝胶图像.随机选取1例标本的2幅图像,利用软件对2幅中的蛋白点进行匹配,匹配率为82.1%;3份样品共12幅凝胶图像的对比,获得3个共同存在的标志蛋白点,相对分子质量和等电点分别为:A点(82 700,7.0)、B点(50 700,5.76)和C点(33 300,5.02).②进一步优化上述实验条件,选择1例标本,采用两步法提取胸腺组织蛋白质,选用17 cm IPG胶条,聚焦采用程序D,考马斯亮蓝染色,获得的二维凝胶图像与一步法(其他条件相同)比较.一步法可检测到蛋白质点326个,两步法可检测到562个蛋白点.结论:①建立了MG胸腺组织蛋白质组提取的方法.采用两步法可以更有效地提取胸腺组织蛋白质组.②利用优化后的实验方法,获得了MG胸腺组织蛋白二维凝胶图像,为开展MG胸腺组织蛋白质组学研究打下了基础.     

健康人和乙肝患者血清蛋白质双向电泳图谱比较

比较健康人和乙肝患者血清中蛋白质双向电泳图谱的差异。方法通过双向电泳技术对健康人和乙肝患者血清中蛋白质进行双向电泳分离,并对这2种血清蛋白质双向电泳图谱进行对比。结果从健康人和乙肝患者血清中共得到8个显著的差异点。其中在乙肝患者血清中表达量上调有5个点,表达量下调有1个点,乙肝患者血清中新出现2个点。结论健康人和乙肝患者血清蛋白质双向电泳图谱有一定的差异,这些差异点可为进一步筛选乙肝患者血清中具有医学价值的蛋白质提供新的途径。     

双向电泳分析失神经支配大鼠腓肠肌蛋白的表达变化

目的:建立骨骼肌蛋白分离的双向电泳(2-DE)技术体系,寻找失神经支配骨骼肌与正常骨骼肌蛋白的表达差异。方法:建立失神经腓肠肌模型,提取腓肠肌总蛋白,进行第一向等电聚焦(IEF)和第二向十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术分离总蛋白,使用PDQuest软件对凝胶图像进行分析,并测量了凝胶蛋白斑点在IEF和SDS-PAGE方向上的位置偏差。结果:失神经组和正常组腓肠肌组织3块凝胶的平均蛋白质点数分别为560±16和545±13,平均匹配点数分别为471±19和447±17,匹配率达84.1%和82.1%。对比分析了两种腓肠肌组织的双向电泳图谱发现,平均匹配点数为445±8;发现在失神经支配后有80个点发生了明显而稳定的质和量(大于10倍或小于0.1倍)的改变。不同凝胶间蛋白质点在IEF方向的偏差为(1.203±0.763)mm,在SDS-PAGE方向上的偏差为(1.062±0.529)mm。结论:失神经组和正常组腓肠肌的双向电泳图谱存在明显差异,失神经后表达下调的蛋白可能与维持肌肉正常功能相关,而表达上调的蛋白则可能与肌萎缩的发生过程相关。     

鼻息肉的2-DE图谱建立和蛋白质组学分析

目的:建立鼻息肉及鼻黏膜双向凝胶电泳(two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis,2-DE)图谱,鉴定差异表达蛋白质。方法:收集鼻息肉及鼻黏膜样本各7例,采用固相pH梯度2-DE,凝胶银染,扫描图像,ImageMaster2-DE软件比较分析等方法,识别差异表达蛋白质,通过质谱分析得到相应肽质指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),采用PeptIdent软件查询Swiss-Protand TreMBL数据库,鉴定差异表达蛋白质。结果:建立了鼻息肉和鼻黏膜蛋白质的2-DE图谱。鼻息肉和鼻黏膜3块凝胶的平均蛋白质点数分别为825±78和936±62;平均匹配点数为682±96和821±78,匹配百分率为82.7%和87.7%;同一鼻息肉的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(IEF)方向偏差为(1.06±0.14)mm,在SDS-PAGE方向偏差为(1.45±0.21)mm。比较分析两种组织各7例样本的2-DE图谱,鼻息肉和鼻黏膜蛋白质点数为1458个和1617个,平均匹配点数为1026个。质谱分析差异蛋白质点40个,获取34张PMF,查询数据库鉴定出蛋白质24个。结论:建立了分辨率高和重复性好的鼻息肉及鼻黏膜2-DE图谱,识别鉴定出一些与鼻息肉病变相关的蛋白质。     

痹肿消汤对胶原性关节炎大鼠滑膜双向电泳蛋白质表达的影响

目的:分析痹肿消汤(bizhongxiao decoction,BZXD)对胶原性关节炎大鼠滑膜双向电泳蛋白质表达谱的影响,为阐明痹肿消汤治疗类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)作用机制提供新线索。方法:70只SD大鼠随机分为正常对照组(正常组)、模型对照组(模型组)、痹肿消汤治疗组(BZXD组),采用皮下注射牛Ⅱ型胶原与完全福氏佐剂制成实验性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型。应用双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分别分离正常组、模型组、BZXD组大鼠关节滑膜的总蛋白后,胶体考马斯亮蓝染色,扫描2-DE胶获取电子图像,Pdquest图像分析软件比较分析此3组双向凝胶电泳图谱并识别差异表达的蛋白质。结果:成功复制了CIA大鼠模型;建立了正常组、模型组和BZXD组大鼠滑膜的2-DE图谱,其平均蛋白质点数分别为947±39,994±41,1031±52,其匹配率为92%,91%,94.2%;模型组的3块胶在蛋白质点位置上有较好的重复性,不同胶间蛋白质点在等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)方向的偏差是(0.896±0.217)mm,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdo-decylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方向的偏差为(1.102±0.104)mm。比较分析模型组和BZXD组大鼠滑膜的2-DE图谱,发现此2组间有328个差异点,BZXD组有174蛋白质点表达上调,147个蛋白质点表达下调,7个蛋白质点只在模型组表达。模型组与正常组之间有193个差异点,123个在模型组表达上调,70个表达下调。结论:建立了CIA大鼠关节滑膜的双向凝胶电泳图谱,识别了328个差异表达的蛋白质,对这些差异蛋白质的鉴定将为痹肿消汤治疗RA的作用机制提供新的实验依据。     

大鼠心肌蛋白双向凝胶电泳技术的建立

[目的]建立大鼠心肌蛋白质组研究的双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis,2-DE）技术。[方法]提取SD大鼠心肌总蛋白,以载体两性电解质pH梯度等电聚焦为第一向电泳,垂直SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向电泳,完成2-DE,考马斯亮蓝染色后扫描获取凝胶图像并用PDQuest软件进行分析。对2-DE中关键环节,如调节pH3~10和pH4~6载体两性电解质的比例、样品离心处理、增加等电聚焦电压和离子强度等方面进行优化。[结果]通过样品处理后离心除去多糖成分,pH3~10和pH4~6载体两性电解质的比例调至1∶2,改变电泳条件,成功消除横向拖尾、分辨率较高的心肌蛋白双向电泳图谱。每张图谱可检测到超过150个蛋白质点,匹配率大于55%。[结论]建立了SD大鼠心肌蛋白的双向凝胶电泳分析技术,该方法可行、重复性好,所提供的方案具有一定参考意义。