微弧氧化钛片与大鼠牙髓干细胞的生物相容性及成骨诱导研究

目的：观察大鼠牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）在微弧氧化（micro-arc oxidation,MAO）钛片表面粘附和分化情况,初步评价MAO钛片对DPSCs的成骨诱导性能。方法：实验组：DPSCs与MAO钛片共培养,阳性对照组：DPSCs成骨诱导培养,空白对照组：DPSCs无诱导普通培养。扫描电镜（SEM）观察DPSCs在MAO钛片表面粘附情况,碱性磷酸酶（ALP）活力检测,实时定量PCR分析Runx2、Osterix、DSPP和DMP-1基因表达和钙结节茜素红染色,鉴定DPSCs的成骨能力。结果：SEM观察MAO钛片表面粗糙多孔,DPSCs在MAO钛片表面粘附紧密,有触角向微孔内伸展。ALP活力检测和钙结节染色,实验组与阳性对照组无显著差异（P〉0.05）,与空白对照组有显著差异（P〈0.05）。实验组Runx2、Osterix表达增强,DSPP和DMP-1表达无明显变化。结论：粗糙多孔的MAO钛片与DPSCs有良好的生物相容性,DPSCs在MAO钛片表面粘附紧密,具有向成骨细胞系分化的能力。     

掺镁微弧氧化钛表面促进大鼠BMSCs成骨分化的研究

目的:探讨掺镁微弧氧化钛表面对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化活性的影响.方法:以含钙、磷电解液微弧氧化处理钛表面(MAO)为对照组,通过在电解液中加入不同浓度镁构建低镁(Mg-1)和高镁(Mg-2)含量微弧氧化处理钛表面;采用场发射扫描电子显微镜(SEM)观察表面相貌结构,X射线光电子能谱仪(EDS)分析材...     

微弧氧化钛表面对2型糖尿病大鼠骨髓基质干细胞成骨分化与种植体骨结合的影响

目的研究微弧氧化钛表面对2型糖尿病大鼠骨髓基质干细胞成骨分化与种植体骨结合的影响。方法对TC4表面微弧氧化处理获得微纳米表面,高糖高脂饮食结合腹腔内注射链脲佐菌素溶液建立2型糖尿病大鼠模型,分离大鼠骨髓基质干细胞。接种细胞到微弧氧化钛表面,观察细胞附着形态、增殖活性、碱性磷酸酶(ALP)活性和成骨分化相关基因。植入微弧氧化种植体到2型糖尿病患者股骨内,荧光素标记新骨形成。采用激光共聚焦显微镜(EDS)观察新骨形成速度,苦味酸品红染色观察骨结合率。采用配对t检验(SPSS 2.0软件)分析实验组和对照组之间细胞增殖、成骨分化相关基因表达、碱性磷酸酶半定量活性、新骨形成量和骨结合率差异(α=0.05)。结果 TC4经酸蚀处理后形成粗糙表面,经微弧氧化处理后可以观察到微纳米结构的孔隙。EDS检测到微弧氧化后的钛表面有钠、硅和磷等元素。微弧氧化钛表面的细胞伸展形态由于对照组,ALP活性增加,成骨分化基因表达上调。动物实验显示微弧氧化钛表面种植体新骨形成速度在前两个月快于对照组,骨结合率高于对照组。结论对TC4表面微弧氧化处理后可以促进2型糖尿病大鼠骨髓基质干细胞成骨分化与种植体骨结合。     

大鼠脂肪干细胞体外培养及成骨诱导分化研究

目的:观察SD大鼠脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的基本生物学特性、鉴定其诱导成骨分化潜能。方法:无菌条件下取6周龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,0.1%I型胶原酶消化,分离培养。显微镜下观察细胞形态;采用MTT比色法绘制细胞生长曲线;用流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第3代细胞行成骨和成脂诱导培养,分别用碱性磷酸酶(ALP)、茜素红染色和油红O染色鉴定成骨诱导效果。结果:从SD大鼠脂肪组织中分离获得的ASCs呈长梭形或多角形,呈集落生长;细胞生长曲线呈"S"型,具有较强的增殖能力;流式细胞仪分析示:CD29、CD90高表达,CD34、CD45低表达;成骨诱导后ALP染色及茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性。结论:分离培养的细胞为ASCs,具有成骨潜能。     

3种激光处理对微弧氧化钛板微结构和牙周膜干细胞成骨活性的影响

目的:研究半导体(Diode)、铒(Er)和Nd:YAG激光照射对微弧氧化(microarc oxidation, MAO)钛板表面的微结构和牙周膜干细胞成骨活性的影响。方法:采用Diode、Er和Nd:YAG激光分别对MAO钛板表面照射,扫描电镜观察MAO钛表面以及人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)的形貌,X射线电子衍射光谱(X-ray diffraction, XRD)分析MAO钛表面的晶相,CCK-8法检测细胞的增殖活性A值,RT-qPCR法检测细胞的Runx2、ALP、OCN和OSX的表达水平。结果:扫描电镜和XRD显示经3种激光照射后MAO钛表面的形貌和晶相均发生改变;经Nd:YAG激光照射的MAO钛表面显著促进hPDLSCs的Runx2和ALP的表达(P<0.001),但其A值下降(P<0.05);经Er激光照射的MAO钛表面促进细胞的ALP基因表达(P<0.005);经Diode激光照射的MAO钛表面的细胞A值以及成骨基因的表达量均减少。结论:经Er和Nd:YAG激光照射的MAO...     

牙囊干细胞诱导成骨的体外研究

目的:体外研究牙囊干细胞(DFSC)的成骨能力,为其在牙周组织工程中的应用提供理论基础。方法:结合组织块法和酶消化法分离培养DFSC,用有限稀释法纯化细胞,经细胞形态、免疫组化和流式细胞技术鉴定DFSC后,然后进行成骨诱导,并通过碱性磷酸酶和茜素红染色、Real-timePCR、Western-blot检测成骨/牙骨质细胞表面标记物ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达。结果:DFSC具有较强的增殖能力,免疫组化示波形丝蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性;DFSC高表达间充质干细胞表面标记物CD44、CD90、CD105、CD146;随着诱导时间的增加,其ALP、OCN、BMP2、RUNX2的表达明显上调(P＜0.05)。结论:DFSC是牙周组织再生良好的种子细胞,必将为牙周组织再生治疗开辟新的途径。     

人牙髓干细胞向成牙本质细胞分化的诱导及鉴定

牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化受多种细胞分化信号的调控。其中 ,骨形成蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、多种生长因子被认为在诱导其分化中起关键作用 ;而碱性磷酸酶、牙本质涎磷蛋白和牙本质基质蛋白 - 1常被用作鉴定其分化的特异性指标     

山羊乳牙牙髓干细胞构建组织工程骨的异位成骨研究

目的:评价山羊乳牙牙髓干细胞在体外的成骨分化能力,及复合多孔磷酸钙骨水泥在山羊肌袋模型内的异位成骨能力。方法:采用改良组织块法培养山羊乳牙牙髓干细胞,并且在成骨诱导条件下培养。经成骨条件培养的第3代细胞与多孔磷酸钙骨水泥复合后,植入山羊背部左侧肌袋;将多孔磷酸钙骨水泥空白支架植入右侧肌袋作为对照组。分别在植入后4、8周取材,进行组织学观察。结果:复合山羊乳牙牙髓干细胞的支架材料在4周后有类骨质形成;植入8周后,类骨质形成更多;未复合细胞的支架材料在组织学检查中未见有类骨质形成。结论:山羊乳牙牙髓干细胞在体外具有分化为成骨细胞的能力;多孔磷酸钙复合山羊乳牙牙髓干细胞在山羊体内具有异位成骨能力。     

大鼠牙髓干细胞可塑性研究

目的:研究大鼠牙髓干细胞向脂肪、神经、肌肉三个方向的横向分化能力。方法:采用地塞米松、IBMX、牛胰岛素和indomethacin对大鼠牙髓干细胞进行程序诱导,RT-PCR和油红O染色方法进行检测;采用bFGF和RDPSCs对大鼠牙髓干细胞进行诱导,RT-PCR方法进行检测;采用5-azacytidine对大鼠牙髓干细胞进行诱导,免疫组织化学染色和RT-PCR的方法进行检测。结果:经脂肪细胞系诱导后,大鼠牙髓干细胞出现脂肪细胞特异性PPARg阳性表达,油红O染色出现阳性脂滴颗粒;经神经细胞系诱导后,大鼠牙髓干细胞未出现预期的神经细胞特异性nestin表达;经肌细胞系诱导后,大鼠牙髓干细胞未出现预期的肌细胞特异性MHC表达,免疫组织化学染色肌动蛋白表达阴性。结论:大鼠牙髓干细胞经过一定的诱导后,可以向脂肪细胞方向分化,具有一定的可塑性;在常规诱导条件下,大鼠牙髓干细胞不能向神经、肌肉方向分化。     

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节,ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。     

人牙周膜成纤维细胞在微弧氧化陶瓷膜表面的生物相容性研究

目的　观察通过微弧氧化（MAO）和水热处理形成的陶瓷膜表面人牙周膜成纤维细胞（hPDLF细胞）的粘附和增殖情况,评价微弧氧化陶瓷膜表面的生物相容性及MAO工艺应用于钛植入材料表面处理的可行性。方法　纯钛试件分为3组,微弧氧化处理组（M组）、微弧氧化-水热处理组（M-H组）和纯钛对照组,每组各20枚。对不同时间点hPDLF细胞在材料表面的附着、生长、增殖情况以及ALP活性进行检测,并对实验结果进行统计分析。结果　陶瓷膜具有良好的生物相容性,培养5 d后,改性两组材料的表面细胞增殖比纯钛组及空白对照组明显增多,各组间细胞增殖情况存在统计学差异。同时培养4 d后,M组和M-H组细胞ALP活性大幅提高,各组间比较均有统计学差异。结论　MAO处理后的纯钛表面对hPDLF的生物相容性优于未处理组,增加水热处理工艺较一般MAO工艺可以更有效提高hPDLF细胞的早期粘附、增殖及ALP活性。     

外泌体对脂多糖诱导的牙髓干细胞成骨分化的作用及代谢机制

目的:探究外泌体对脂多糖(LPS)诱导的牙髓干细胞(DPSCs)成骨分化的影响.方法:收集健康成人和儿童的脱落乳牙牙髓干细胞(SHED),分离、培养DPSCs和SHED并用流式细胞仪鉴定.收集SHED上清的外泌体,使用透射电镜、Western blot和粒径分析进行鉴定;检测对照组(10 mg/L PBS)、LPS组(10 mg/L LPS)和LPS+外泌体组(10 mg/L LPS+10 mg/L外泌体)的DPSCs细胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)水平;加入线粒体呼吸酶抑制剂抗霉素A后,实时定量RT?PCR和茜素红染色检测各组DPSCs的成骨分化能力.结果:成功获得DPSCs和SHED来源外泌体;LPS可以提高DPSCs的ECAR水平,使OCR/ECAR水平下降,而加入外泌体后,DPSCs的OCR水平升高,OCR/ECAR水平得到恢复;外泌体可以恢复LPS诱导的成骨分化下降,而加入抗霉素A可以抑制外泌体的促成骨分化能力.结论:SHED来源的外泌体通过提高OCR/ECAR水平,来促进炎症微环境下DPSCs的成骨分化能力.     

微弧氧化处理Ti2448的生物相容性研究

目的　评价微弧氧化处理低弹性模量钛铌锆锡合金（Ti-24 Nb-4 Zr-7.9 Sn,Ti2448）的生物相容性。方法  通过微弧氧化处理Ti2448试件（MAO-Ti2448）。采用MTT法比较MAO-Ti2448组和Ti2448组浸提液培养小鼠成纤维细胞（L929）的增殖和毒性情况;应用致敏实验观察各组浸提液引起的豚鼠皮肤反应;各组与小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1）共培养,测定MC3T3-E1的碱性磷酸酶（ALP）活性。结果　MAO-Ti2448组与Ti2448组的细胞毒性分级为0级,均无细胞毒性。随着细胞培养时间延长,MAO-Ti2448组和Ti2448组的吸光度（OD）值均增加,且MAO-Ti2448组的OD值明显高于Ti2448组,差异有统计学意义（P < 0.05）。MAO-Ti2448组与Ti2448组的皮肤反应均为0级,无皮肤致敏性。随着细胞培养时间延长,MAO-Ti2448组和Ti2448组MC3T3-E1的ALP活性均增高,与Ti2448组对比,MAO-Ti2448组MC3T3-E1的ALP活性较高,差异有统计学意义（P < 0.05）。结论　微弧氧化处理Ti2448无细胞毒性,可促进细胞增殖及早期成骨分化,具有良好的生物相容性。     

牙髓干细胞诱导为神经干细胞方法的初步研究

目的:体外探究牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)向神经干细胞(neural stem cells, NSCs)诱导分化的有效方式。方法:酶解法分离及培养DPSCs,流式细胞术对DPSCs进行表型分析鉴定。将DPSCs接种于NSCs诱导培养基及低吸附细胞培养板中,每日观察并统计神经球的形态以及直径,对不同直径的神经球进行免疫荧光染色;Western blot检测不同代数DPSCs诱导后Nestin表达情况。结果:在NSCs诱导培养基及低吸附培养板作用下,DPSCs可形成神经球。对神经球形态及直径统计结果表明第5天为最佳诱导时间,6～7 d后神经球形态及直径大小无明显变化。诱导后不同直径大小的神经球Nestin均呈阳性表达,但细胞传代数会影响诱导后神经球Nestin表达。结论:DPSCs可有效的诱导形成NSCs,且早期代数DPSCs诱导后神经球干性较佳。