反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达简

 目的 探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果。方法 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,体外转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响。 结果 加入锁核酸后,对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用,6 d后抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%。锁核酸对细胞代谢无明显影响。结论 针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗治疗提供理论和实验依据。     

反基因锁核酸体外阻断肝癌细胞系乙肝病毒S基因表达

目的探讨针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的效果。方法针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导,体外转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术和时间分辨免疫荧光技术分别监测2、4、6、8和10 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和HBeAg的含量;四甲基偶氮唑蓝法检测锁核酸对细胞代谢的影响。结果加入锁核酸后,对细胞内HBV DNA复制、HBsAg与HBeAg表达均有较明显的时间和剂量依赖性抑制作用,6 d后抑制率分别为52.14%、57.48%和29.63%。锁核酸对细胞代谢无明显影响。结论针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区的锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据。     

不同方式给予反义寡核苷酸对培养肝癌细胞HBV基因表达的影响

为开发新型抗HBV药物,设计合成针对HBV ENⅡ（1713－1727）的反义寡核苷酸（as-ENⅡ）,以不同浓度,不同作用方式作用于HepG2.215细胞,ELISA检测结果表明10umol/L的as-EN Ⅱ可显著抑制HBsAg,HBeAg表达,抑制率可达52．1％和40．1％,10umol/L as-EN Ⅱ一次性用于HepG2.215细胞后,其对HBsAg,HBeAg的抑制作用呈现双峰现象,分别在1d,5d和1d,3d,抑制作用分别为30．4％,52．1％和34．0％,40．1％。同样浓度as-ENⅡ每天反复加入HepG2.215, 抑制作用缓慢上升,分别在第7,6d达高峰,抑制作用分别为73．69％和73．64％,结果提示HBV ENⅡ是设计抗HBV反义寡核苷酸片段的良好靶位,并为临床设计合理用药方案提供了实验依据。     

霉酚酸对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒复制的影响

目的:探讨霉酚酸（MPA）在体外对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。 方法:将不同浓度的MPA（1-20 mg/L）作用于HepG2.2.15细胞，在外加或不加鸟嘌呤核苷（简称鸟苷）的情况下，分别收集第4 d细胞培养上清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测上清中乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg），采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测细胞内乙型肝炎病毒核心蛋白mRNA（HBV core mRNA）,狭缝印迹杂交法定量分析细胞内 HBV DNA。 结果:在不外加鸟苷情况下，MPA对HBV复制具有抑制作用，随着浓度增加，对HBsAg和HBeAg的抑制率逐渐上升，细胞内HBV DNA复制水平下降。外加鸟苷后能逆转MPA对HBV复制的抑制作用。 结论:MPA对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的分泌及HBV DNA复制具有抑制作用。MPA可能通过减少细胞内鸟苷酸的合成来实现对HBV复制的抑制。     

新型融合多肽HTPP-MDC体外抑制HBV复制活性及亚细胞定位

 目的： 研究肝细胞靶向穿膜肽-家蝇天蚕素（HTPP-MDC）融合多肽体外对乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用及其在肝细胞中的定位。方法：不同浓度HTPP-MDC分别与HepG2.2.15细胞和Chang liver细胞共培养,用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测药物对细胞的毒性作用,应用ELISA和实时荧光定量 PCR技术定量研究HTPP-MDC对HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg、HBeAg及HBV DNA复制的影响。应用激光共聚焦技术研究HTPP-MDC在肝细胞中的定位。结果：HTPP-MDC 在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞系分泌HBsAg和HBeAg,对HBV DNA的复制亦有显著抑制作用。激光共聚焦显微镜观察显示HTPP-MDC进入细胞内部。结论：HTPP-MDC在体外对 HBV 复制有较强的抑制作用,并能快速透过细胞膜进入细胞内,有望用于临床治疗慢性乙型肝炎相关疾病。     

反基因锁核酸体外抑制乙肝病毒前S1基因表达

 目的 探讨针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的锁核酸体外抑制细胞内病毒复制的作用。方法 针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区,利用RNAstructure软件分别设计合成锁核酸、硫代寡核苷酸、未修饰寡核苷酸及无关对照序列,以阳离子脂质体介导转染HepG2.2.15细胞,采用荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR）、时间分辨免疫荧光技术（TRFIA）和酶联免疫法（ELISA）分别监测1、3、5和7 d细胞培养上清液中HBV DNA、HBsAg和前S1抗原的含量;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测锁核酸对细胞代谢的影响。结果 加入锁核酸后,对HBV DNA复制、HBsAg和前S1抗原表达均显示有较强的抑制作用,且抑制率随时间呈增高趋势,7 d后抑制率分别达64.32%、67.51%和63.88%。LNA对细胞代谢无明显影响。结论 针对乙肝病毒前S1基因同聚嘌呤区的反基因锁核酸,体外能有效抑制乙肝病毒的复制,既为乙肝病毒治疗提供有效靶位,也为反基因治疗提供理论和实验依据。     

反义核酸抑制荷瘤裸鼠乙肝病毒基因表达

我们曾针对乙型肝炎病毒(HBV)基因序列,设计合成了一系列反义寡核苷酸(asON)基因封条,在HBV基因转染的Hep-G_2(2.2.15)细胞上比较了其抗病毒活性与作用特性。本研究进一步应用2.2.15细胞转种裸鼠,建立荷瘤裸鼠HBV动物模型,继而尝试应用反义核酸阻断裸鼠体内HBV基因表达。 1×10~8的2.2.15细胞接种于2月龄ALB纯系裸鼠皮下,2周内局部即长出肉眼可见肿瘤,初始绿豆或黄豆样大,至3周时平均瘤直径可达0.8cm。肿瘤出瘤率在85％以上,出瘤率和出瘤时间无裸鼠性别差异,而与细胞种量有关。镜下见肿瘤由中等分化度的肝癌细胞岛组成,周围包绕以纤维间隔,久之可见细胞坏死现象。酶联免疫试验检测带瘤鼠血清中HBsAg、HBeAg结果均为阳性;聚合酶链反应及核酸斑点杂交     

反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断乙肝病毒C基因表达

目的 探讨针对乙肝病毒C基因反义锁核酸在转基因小鼠体内阻断病毒基因表达的效果.方法 各实验组经尾静脉给药后,采用real-time PCR、时间分辨免疫荧光技术、免疫组织化学法等技术分别检测血清HBV DNA、HBeAg含量及肝细胞内HBcAg的表达情况.结果 注射锁核酸后,对乙肝病毒核酸的复制和乙肝病毒e抗原的合成均有较强的抑制作用,注射后1、3 和5 d,HBV DNA的平均抑制率分别19.24％、39.20％和44.47％;HBeAg的平均抑制分别为30.71％、51.14％和63.46％;小鼠肝细胞的HBcAg阳性细胞数也较对照组明显减少.结论 针对乙肝病毒C基因的反义锁核酸在转基因小鼠体内能有效抑制病毒基因的复制和表达,提示C基因可作核酸药物治疗的有效靶位.     

针对S基因的siRNA抑制HepG2 2.2.15细胞中HBV基因的表达

目的 构建针对乙型肝炎病毒（HBV）S基因的siRNA（short interfering RNA）表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,观察其对HepG2 2.2.15细胞中的HBV基因表达的影响.方法 设计并合成针对HBV S区基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入pSUPER载体,构建成功的siRNA表达载体与pTK-Hyg质粒共转染稳定表达HBV的HepG2 2.2.15细胞,经200μg/ml潮霉素抗性筛选,4周后获得稳定细胞克隆,对所得细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,免疫荧光染色检测细胞内抗原的表达,同时用RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果.结果 成功构建了针对HBV S基因的siRNA表达载体pSUPER-S1和pSUPER-S2,两种siRNA均能明显抑制HepG2 2.2.15细胞的HBsAg和HBeAg分泌,抑制率分别为83%和78%,免疫荧光染色显示siRNA能抑制细胞内抗原的合成,RT-PCR结果证实HBV的mRNA表达降低,而无关序列的siRNA和对照则无此作用.结论 载体产生的针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达.     

HBV S基因反义锁核酸抑制病毒体外复制

 目的　探讨乙型肝炎病毒S基因反义锁核酸（LNA）片段在HepG22.2.15细胞内抗病毒效果及有效LNA片段筛选。方法　设计合成互补于HBV S基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段,以阳离子脂质体介导,作用于HepG22.2.15细胞株,采用ELISA法和实时荧光定量聚合酶链技术（FQ-PCR）分别监测24、48和72h细胞培养上清液中HBsAg和HBV DNA的含量;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法监测细胞代谢。结果　4条不同序列长度反义LNA均显著性抑制HBsAg表达和HBV DNA复制,72h后最高抑制率分别达72.43%和34.73%。HBsAg分泌量和HBV DNA的拷贝数均明显低于对照组（P<0.01）。LNA对细胞代谢无明显影响。结论　针对HBV S基因mRNA翻译起始区的反义LNA片段体外能显著抑制HBV表达,且抑制作用最强序列长度在15~25个碱基之间。     

SAMHD1 对HBV DNA 形成的抑制作用及其机制研究

目的:研究不同肝细胞SAMHD1 表达水平及其对HBV DNA 形成的抑制作用和相关机制。方法:通过实时荧光定量PCR 和Western blot 法检测Jurkat、THP-1、HepG2、HepG2.2.15 和Huh7 细胞等细胞SAMHD1 mRNA 和蛋白表达水平;通过对HepG2.2.15 细胞转染过表达质粒和shRNA,升高或者降低SAMHD1 的表达水平,观察不同SAMHD1 表达水平对HBV DNA 水平的影响;补充不同浓度的dNTP,比较不同dNTP 浓度对HBV DNA 水平的影响。结果:肝癌细胞系有较高的SAMHD1表达水平;降低SAMHD1 可以使HBV DNA 水平升高2.3 ~ 2.8 倍,升高SAMHD1 可以使HBV DNA 降低至33% 左右(P<0.01);升高dNTP 浓度可以促进HBV DNA 的合成水平,抵消SAMHD1 的抑制作用。结论:SAMHD1 可以抑制肝癌细胞内HBV DNA 的生成,可能是通过降低细胞内dNTP 浓度实现的。     

原蛋白转化酶在转化生长因子β_1抑制HBV复制效应中的作用

目的:探讨原蛋白转化酶(PCs)在转化生长因子β1(TGFβ1)抑制HBV复制效应中的作用。方法:常规培养的HepG2.2.15细胞加2μg/L或5μg/L重组TGFβ1或/和20μmol/L PC抑制剂作用18h,收集细胞提取细胞总RNA和HBV衣壳DNA,采用荧光定量PCR技术检测PC mRNA和HBV DNA含量。结果:HepG2.2.15细胞的7种PCs均有不同程度的表达。加用重组TGFβ1后除PC5/6下调外,其余PCs均显著上调。尽管PC1/3和PC2上调最显著,但结合基础表达水平的分析显示furin和PACE4在TGFβ1处理前后均为优势表达PCs。在HepG2.2.15细胞上,进一步使用PC抑制剂可消除TGFβ1抑制HBV复制的效应。结论:上调PCs mRNA表达是TGFβ1抑制HBV复制的重要中间环节。此结果对进一步探讨TGFβ1有效干预HBV复制具有积极意义。     

Specific expression of human interferon-gamma controls hepatitis B virus replication in vitro in secreting hepatitis B surface antigen hepatocytes

Interferon-gamma (IFN-γ) has been reported to have antiviral activity against Hepatitis B virus (HBV) and to suppress HBV replication noncytolytically in vivo. Since systemic administration of IFN-γ may cause severe adverse effects, studies of the effects of liver-specific IFN-γ expression from adenoviral vectors in vivo have been investigated. In this study, a novel strategy has been described that drives specific expression of human IFN-γ in HBsAg-secreting hepatocytes. A bicistronic expression vector has been developed, pcDNA3.1-HBV antisense S gene-HCV core protein gene-HCV internal ribosome entry sites (IRES)-IFN-γ (pcDNA-SCIγ), by inserting four DNA fragments into pcDNA3.1. Tight modulation of HCV IRES-dependent translation by the HCV core protein was achieved using an antisense RNA technique with a bicistronic expression vector. HepG2 cells and HepG2.2.15 cells stably expressing HBV were transduced with pcDNA-SCIγ to test the responsiveness of IFN-γ to HBsAg expression. Gene transfer resulted in a low background and a 30-fold induction of IFN-γ expression from pcDNA-SCIγ in a cell-specific fashion. Hepatocyte-specific IFN-γ expression controlled effectively HBV replication in HBsAg-secreting HepG2.2.15 cells without cell toxicity.     

Inhibition of hepatitis B virus replication by small interference RNA induces expression of MICA in HepG2.2.15 cells

Hepatitis B virus (HBV) replicates in most tumor tissues of patients with HBV-associated hepatocellular carcinoma (HCC). In the present study, we have shown that the expression of HBV in the HCC cell lines, HepG2 and Huh7, down-regulated the expression of MHC class I-related molecule A (MICA), a ligand of the NKG2D receptor. Inhibition of HBV expression by small interference RNAs (siRNAs) in HepG2.2.15, a cell line that constitutively expresses HBV, induced up-regulation of MICA. The up-regulation of MICA increased the lysis of HepG2.2.15 cells by NK cells. Our results suggest that HBV compromises the innate immune system in HCC patients and that inhibition of HBV replication by siRNAs may enhance the antitumor immune response.     

TRAIL诱导乙型肝炎病毒转染细胞株凋亡的实验研究

目的 探讨人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）对HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2．2．15的凋亡诱导效果。方法应用MTT法了解TRAIL对HepG2．2．15细胞的诱导效果，琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术和Caspase．3酶活性分析TRAIL诱导HepG2．2．15细胞凋亡过程。结果TRAIL（0．1μg／mL）作用于HepG2．2．15细胞株12、24、36h后，细胞抑制率分别为17．91％、41．26％、59．85％；PI单染亚二倍体含量12h后为21．8％，高于对照组的8．7％；24h后DNA电泳200bp处出现特异性条带；6h后Caspase-3酶活性为对照组的4．76倍。结论TRAIL诱导后，HBV稳定转染的肝癌细胞株HepG2．2．15发生凋亡     

MAP30苦瓜抗HIV蛋白对细胞内HBeAg表达抑制作用的定量分析

目的：研究MT为3000的苦瓜抗HIV蛋白(MAP30)对2．2．15细胞内HBV基因表达的抑制作用。方法：将HBV DNA转染的人肝癌细胞株2．2．15，在MAP30存在的情况下培养后，进行间接免疫荧光染色，用共聚焦技术定量分析细胞内HBeAg的表达。结果：与对照组相比较，MAP30培养的细胞内HBeAg荧光量明显减少。结论：MAP30对2．2．15细胞内HBeAg的表达有明显的抑制作用。     

AFP增强型四元复合体介导N-ras反义RNA抑制HepG2.2.15细胞成瘤性的研究

目的　观察AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统对HBV转基因肝癌细胞系HepG2 .2 .15致瘤性的体内外抑制作用。方法　构建含有N ras反义RNA的AFP增强型四元复合体 ,体外瞬时转染HBV转基因HepG2 .2 .15细胞 ,流式细胞术检测转染前后N ras蛋白表达水平、细胞凋亡率及细胞周期的变化 ,同时建立稳定表达N ras反义RNA的肝癌细胞系HepG2 .2 .15 /as ras,绘制转染前后生长曲线。体内抑瘤试验分别以HepG2 .2 .15或HepG2 .2 .15 /as ras细胞制备荷瘤裸鼠模型 ,比较二者成瘤率。HepG2 .2 .15成瘤组局部瘤内注射N ras反义RNA四元复合体 ,研究其对肿瘤的抑制作用。结果　AFP增强型四元复合体介导N ras反义RNA体外瞬时转染HepG2 .2 .15细胞可显著降低胞内N ras蛋白的表达水平 (P <0 .0 5 ) ,使细胞生长停滞于G0 /G1期 ,且可诱导细胞凋亡。体内抑瘤实验显示 ,HepG2 .2 .15 /as ras细胞注射组成瘤率 ( 4 0 % )显著低于HepG2 .2 .15细胞注射组( 10 0 % )。瘤内注射N ras反义RNA四元复合体可使肿瘤体积明显缩小。结论　AFP增强型四元复合体介导的N ras反义RNA转移系统可降低HBV转基因肝癌细胞HepG2 .2 .15N ras蛋白的表达水平 ,逆转其恶性行为 ,体内外均可有效抑制肿瘤的生长增殖