Taqman-探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌方法的建立

目的 建立一种Taqman荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法。方法 以副溶血弧菌标准株(ATCC-VPJS421)和其它常见致病菌标准株为研究对象,通过Gene Bank获取toxR基因的序列,采用生物信息学软件设计特异性PCR引物及Taqman探针,在SLAN 96P荧光定量PCR仪进行扩增检测,评价该检测方法的特异度和灵敏度。结果 ①设计的引物能够扩增出特异性条带; ②扩增体系中0.5 μl探针的扩增效果优于1.0 μl探针; ③Taqman-探针荧光定量PCR检测方法对副溶血弧菌toxR基因的检测灵敏度为10^-1 mg/L; ④在检测粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、霍氏肠杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、梅氏弧菌和弗尼斯弧菌等10种常见致病菌时未出现阳性扩增,特异度为100%。结论 成功建立Taqman探针荧光定量PCR鉴定副溶血弧菌的方法,该方法特异度、灵敏度均较好,适用于副溶血弧菌的快速检测,具有良好的应用价值。     

多通道Taqman-探针荧光定量PCR 鉴定MRSA方法的建立

目的 建立基于mec A/nuc/fem B三基因联合的Taqman-探针荧光定量PCR鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法 以常规检验标本中分离和采用VITEK 2 Compact微生物分析仪鉴定为凝固酶阳性的MRSA为研究对象,通过PrimerPremier5.0和Beacon Designer 7软件设计针对mec A/nuc/fem B特异性PCR引物及Taqman荧光探针,荧光探针5'端分别采用FAM,HEX及ROX标记,3'端采用BHQ1标记,在荧光定量PCR仪进行检测。结果 ①1 g/dl凝胶电泳结果显示mec A/nuc/fem B三个基因引物特异性较好,扩增出的条带分子量与预期分子量一致且未见非特异性扩增; ②在单管单通道及单管多通道的PCR检测中mec A/nuc/fem B均获得特异性扩增,且三个基因在单管多通道的PCR扩增效果与单管单通道的相类似。结论 成功建立了多通道Taqman-探针荧光定量PCR鉴定MRSA的方法,mec A/nuc/fem B三种基因联合检测可有效区分凝固酶阴性和阳性的MRSA,提高鉴定MRSA的准确率。     

志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光聚合酶链反应快速检测方法的应用研究

目的建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测技术,为从患者、食品和环境中快速分离和鉴定志贺菌提供技术支撑。方法根据志贺菌ipaH基因序列设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针;通过对PCR扩增体系和反应条件的优化,建立志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测方法;用添加已知志贺菌浓度的样本验证方法敏感性;用志贺菌标准菌株、分离株以及大肠埃希菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性。结果用本研究建立的志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法检测志贺菌,其Ct值与模板浓度的对数值具有很好的对应关系（Y=-3.93×log（X）＋37.34,R=0.999）,最低检测浓度为30cfu/ml,3株志贺菌标准株,30株志贺菌分离株检测结果均为阳性;而沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等91株其他细菌的Ct值均〉35或扩增曲线成一平滑直线。与常规分离鉴定方法比较差异无统计学意义（P〉0.05,χ^2=0.27）。对于纯菌和食品样品整个检测过程仅需2h和10h。结论志贺菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术具有特异性强,敏感性高,易操作等优点,有很好的应用前景和研究价值。     

空肠弯曲菌 TaqMan-MGB双重探针实时荧光定量 PCR快速检测

目的　开发一种特异、灵敏的TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 方法,用于空肠弯曲菌的快速定量检 测。方法　针对空肠弯曲菌鞭毛蛋白A 和马尿酸酶基因设计特异性引物和探针,建立一种新型TaqMan-MGB 双重探针 实时荧光定量PCR 检测空肠弯曲菌方法,对该方法的定量检测线性范围、特异度、灵敏度、重复性、稳定性进行评价, 应用该方法对临床标本中的空肠弯曲菌进行检测,同时用细菌培养、普通PCR、基因克隆和测序鉴定。结果　建立的 空肠弯曲菌TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 检测方法专属性强,能准确检出空肠弯曲菌,而与其他细菌无交 叉反应,特异度为100%。该技术灵敏度高,能精确定量检测空肠弯曲菌DNA 线性范围达10 个数量级,最低检测限为 4 个菌落形成单位。重复性和稳定性良好,组内和组间相对标准偏差均小于1%。应用该方法成功从78 例临床标本中定 量检出28 例空肠弯曲菌阳性标本,用普通PCR 和基因克隆测序分析确认,细菌培养方法仅获得6 株存活的空肠弯曲菌。 结论　TaqMan MGB 双重探针实时荧光定量PCR 具有快速简便、可靠稳定、特异灵敏的优点,可用于临床标本中空肠 弯曲菌定量检测,值得推广应用。     

量子点标记荧光原位杂交法在快速检测金黄色葡萄球菌中的应用

目的:应用量子点标记的荧光原位杂交方法以快速检测金黄色葡萄球菌。方法:采用两种量子点-亲和素-生物素-DNA探针,即A型肠毒素(SEA)基因与FemB基因探针与金黄色葡萄球菌临床分离株或感染金黄色葡萄球菌的粪便标本进行荧光原位杂交,同时与SEA基因聚合酶链反应(PCR)的检测结果比较。结果:10株临床金黄色葡萄球菌分离株中,2株SEA基因探针杂交和SEA基因PCR检测结果均为阳性,其余8株SEA基因探针杂交和SEA基因PCR检测结果均为阴性,10株FemB基因探针杂交结果均为阳性。3例分离培养为金黄色葡萄球菌的临床粪便标本直接进行荧光原位杂交,FemB及SEA基因探针杂交结果均为阳性,SEA基因PCR检测结果均为阳性。SEA、FemB基因探针与其他相关菌种未见非特异性反应。结论:量子点标记荧光原位杂交法检测金黄色葡萄球菌具有快速、简便、特异的特点,且可用于临床粪便标本的直接检测。     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

TaqMan-MGB荧光定量PCR检测人载脂蛋白A5基因方法的建立及评价

目的建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量聚合酶链反应(PCR),用于检测人载脂蛋白A5(apo A5)基因。方法针对人apo A5基因设计特异性引物和TaqMan-MGB荧光探针,以重组克隆质粒pPCR-Script-apo A5为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法和标准曲线,进行灵敏度、重复性、特异性实验。结果建立的定量标准曲线阈值循环数(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为103拷贝/μL;扩增效率(E)为110.2%,且重复性好。结论成功建立检测人apo A5基因的TaqMan-MGB荧光定量PCR。该法具有较好的灵敏度、特异性及重复性。     

嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及应用研究

目的 建立嗜肺巴斯德菌的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR快速检测方法.方法 针对嗜肺巴斯德菌16SrRNA基因设计特异性引物和探针,建立嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异度、敏感度和稳定性.对2008～2011年采集的1 680份样本进行检测.结果 嗜肺巴斯德菌TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR检测方法具有高度特异性,对多杀巴斯德菌、产气巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均无交叉反应,检测灵敏度达22拷贝.标准曲线显示备浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.488,PCR效率为100％.荧光定量PCR检测1 680份样本,检出137份嗜肺巴斯德菌阳性.该方法可直接从样本中特异性地检出嗜肺巴斯德菌.结论 TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法具有灵敏、特异、稳定的特性,适用于嗜肺巴斯德菌的快速检测.     

双重PCR反向杂交快速检测及鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的 研究以非培养法为基础的快速检测和鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的方法。方法 将金黄色葡萄球菌mecA基因特异性探针固定在尼龙膜上,双重聚合酶链反应(PCR)同时扩增待检DNA片段,在扩增中用bio-11-dUTP标记扩增产物,然后与探针膜杂交。结果 50株金黄色葡萄球菌sa442特异性基因片段检测结果为100％阳性,mecA基因结果阳性占72％。结论 该方法灵敏度高、特异性强,适用于临床快速检测和鉴定MRSA。     

多重PCR结合基因芯片技术检测11种致病菌方法的建立

目的建立一种运用多重PCR方法结合基因芯片技术快速、准确检测11种常见致病菌的方法。方法筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157、副溶血性弧菌、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌的特异基因作为目的基因。设计相应的引物及探针,进行多重PCR扩增,制备寡核苷酸芯片。将多重PCR扩增产物与带有11种特异探针的基因芯片杂交。用扫描仪扫描,判定细菌种类。结果该基因芯片可特异性地检测11种致病菌,具有良好的特异性,基因组DNA检测灵敏度可达2×10-3ng。结论多重PCR结合基因芯片技术检测11种不同致病菌的方法特异性好,灵敏度高,具有较好的实用性。     

霍乱弧菌的PCR方法检测及耐药性分析

目的建立PCR检测霍乱弧菌的快速方法,应用于水源、海产品霍乱弧菌快速检测;了解霍乱弧菌的耐药性。方法根据霍乱弧菌的肠毒素基因A亚单位(ctxA)的保守序列,设计引物,以副溶血弧菌和沙门菌为对照,建立PCR检测霍乱弧菌的快速方法,用于霍乱弧菌的快速检测;应用美国德灵公司生产的Walkway40微生物鉴定和药敏分析系统对70株霍乱弧菌进行耐药性检测。结果70株霍乱弧菌出现特异性荧光,其他菌不出现荧光,灵敏度高、特异性强,可在8h内作出诊断。霍乱弧菌对大部分抗生素敏感,对复方新诺明耐药率较高。结论PCR检测霍乱弧菌灵敏度高特异性强可用于水源、海产品霍乱弧菌快速检测;霍乱弧菌对大部分抗生素敏感。     

基于 LAMP技术针对溶藻弧菌 gyrB基因快速检测方法的建立

目的　应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）建立针对溶藻弧菌gyrB 基因的 快速检测方法。方法　以溶藻弧菌标准株（ATCC-17749）和溶藻弧菌野生株（WT）为研究对象,通过在线生物学软件（http:// primerexplorer.jp/e/）设计针对溶藻弧菌gyrB 基因的LAMP 引物,利用恒温水浴进行等温扩增,优化反应条件,建立快 速检测方法。结果　①经2g/dl 凝胶电泳结果显示反应温度为61℃时扩增产物成像效果较60℃,62℃和63℃明显,为 适宜反应温度;②在61℃条件下反应60 min 和90 min 凝胶电泳成像效果差异不大,反应时间为60 min 能满足扩增需要; ③利用同一体系对临床6 种其它常见致病菌进行等温扩增时未出现阳性条带,提示整个体系特异度较好;④采用模板稀 释法验证该LAMP 体系检测的灵敏度为10-4mg/L。结论　建立了基于LAMP 技术针对溶藻弧菌gyrB 基因的快速检测方 法, 具有良好的特异度和敏感度,对快速检测溶藻弧菌有重要意义。     

荧光定量PCR检测梅毒螺旋体方法的建立及初步应用

目的采用二聚体蝎型探针技术建立一种高敏感性和特异性的检测梅毒螺旋体(TP)的荧光定量聚合酶链反应(PCR)方法。方法根据TP特异性外膜蛋白Gpd的基因序列设计引物和荧光探针,采用基因工程技术构建可用于TP定量的标准品,优化荧光定量PCR的反应体系和反应条件,建立检测TP的二聚体蝎型探针定量PCR。采用本研究建立方法和商品化荧光定量PCR试剂盒检测40例临床标本,对比分析检测结果的统计学差异。结果成功构建了TP重组质粒标准品和TP的二聚体蝎型探针定量PCR,该方法线性范围为101~108 copy/mL,灵敏度为10copy/mL,特异性和敏感性均为100.0%;二聚体蝎型探针定量PCR对疑似梅毒病例阳性检出率显著高于目前商品化Taqman荧光定量PCR试剂盒(82.5%vs 62.5%,P0.05)。结论成功建立了二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测TP的方法,为临床上TP的早期诊断和防控奠定了基础。     

TaqMan荧光定量PCR检测流感嗜血杆菌和肺炎链球菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法 ,用于流感嗜血杆菌和肺炎链球菌的检测和鉴别诊断.方法 针对流感嗜血杆菌种属特异性基因bexA和肺炎链球菌种属特异性基因lytA,设计合成引物和TaqMan探针,研究不同引物和探针荧光定量PCR检测的特异性和灵敏度,确定标本检测中循环阈值(Ct)的临界值(cut-off值).将荧光定量PCR、乳胶凝集和细菌培养3种检测方法 同时应用于278份细菌性脑膜炎患者脑脊髓液标本的检测.结果 bexA基因引物和探针能特异性检测流感嗜血杆菌a、b、c、d血清型的菌株,检测灵敏度为每个反应10个基因组DNA拷贝;lytA基因引物和探针能特异性检测肺炎链球菌常见致病的血清型肺炎链球菌菌株,检测灵敏度为每个反应90个基因组DNA拷贝.通过荧光定量PCR方法 ,278份脑脊髓液标本中共检测出 4份流感嗜血杆菌阳性和7份肺炎链球菌阳性,其中各有2份培养出相应的病原菌,另有1份流感嗜血杆菌和2份肺炎链球菌乳胶凝集结果 阳性.结论 TaqMan荧光定苗PCR方法 能特异地检测和鉴定流感嗜血杆菌和肺炎链球菌,具有较高的灵敏度和快速检测的特点,能提高临床流感嗜血杆菌和肺炎链球菌感染患者标本的阳性检出率.     

双重PCR反向杂交快速检测及鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的　研究以非培养法为基础的快速检测和鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)的方法。方法　将金黄色葡萄球菌mecA基因特异性探针固定在尼龙膜上 ,双重聚合酶链反应 (PCR)同时扩增待检DNA片段 ,在扩增中用bio 11 dUTP标记扩增产物 ,然后与探针膜杂交。结果　 5 0株金黄色葡萄球菌sa4 4 2特异性基因片段检测结果为 10 0 %阳性 ,mecA基因结果阳性占 72 %。结论　该方法灵敏度高、特异性强 ,适用于临床快速检测和鉴定MRSA。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌实时荧光PCR检测方法的建立和评价

目的建立实时荧光PCR快速筛查耐甲氧西林葡萄球菌株和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株的方法。方法以耐甲氧西林mecA基因的保守序列为模板设计特异性引物探针,建立一种能快速检测样本中耐甲氧西林葡萄球菌的实时荧光PCR方法,结合对金黄色葡萄球菌的特异性NUC基因进行实时荧光检测,可鉴定是否为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌株。以纸片扩散法作为对照方法,对所建立的实时荧光PCR检测方法检测效果进行初步评价。结果该实时荧光PCR方法的整个检测过程只需要1.5h;对22例临床样本进行检测,所建立的荧光PCR方法比纸片法多检出2例耐甲氧西林菌株;对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测结果一致。结论本研究建立的实时荧光PCR检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方法不仅能实现耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的快速检测,更可能为指导临床用药提供有价值的参考。     

鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法的建立与应用评价

  目的  建立一种鼠疫多重荧光定量PCR内标检测方法,并进行应用效果评价。  方法  选择鼠疫菌染色体YPO0393基因与pMT1质粒caf1基因为靶基因,设计合成YPO0393-内标模板、特异性引物和TaqMan荧光探针,构建鼠疫多重荧光定量PCR内标检测体系;对非鼠疫菌DNA、不同稀释浓度鼠疫菌DNA、野外监测样本进行检测,评价该方法的特异性、灵敏性、重复性和应用效果。  结果  采用多重荧光定量PCR内标方法,8株鼠疫菌DNA均出现明显的扩增曲线,12株非鼠疫菌DNA未显示扩增曲线,提示该方法特异性良好。 不同浓度的鼠疫EV76疫苗株DNA,检测最低限为22.5×10?4 ng/μL,变异系数为0.99～3.42,提示灵敏性、重复性较好。 105份野外监测样本中,荧光定量PCR内标方法检测阳性的6份,与普通PCR方法检测结果一致,4份样本分离培养出鼠疫菌且采用PCR方法检测阳性。  结论  通过设置双靶基因与内标对照,本研究建立的鼠疫多重荧光定量PCR内标方法可降低检测假阳性率,特异性、灵敏性和重复性理想,可用于鼠疫快速检测。     

金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系的建立及应用

目的 建立SYBR-Green荧光PCR体系金黄色葡萄球菌肠毒素快速分型体系,应用于金黄色葡萄球菌食物中毒和食品风险监测快速诊断.方法 根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E基因的保守序列设计特异性引物,分别建立SYBR-Green荧光PCR体系.应用该系列体系检测185株金黄色葡萄球菌野生株的肠毒素基因A～E型.结果 建立的SYBR-Green荧光PCR系列体系其DNA灵敏度为1.34～2.80 ng/μL,菌液灵敏度为46～96 CFU/mL;用以检测185株金黄色葡萄球菌的肠毒素基因A～E型,携带一种基因型的为58.38%,同时携带两种以上毒素基因占4.86%.结论 建立的荧光PCR反应体系快速、灵敏度高、特异性强,能应用于金黄色葡萄球菌肠毒素基因的准确分型,对食物中毒诊断和食品风险监测很有意义.     

沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR快速检测技术的建立与应用

目的建立快速同时检测沙门菌、志贺菌和副溶血弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)技术。方法根据沙门菌hilA基因、志贺菌ipaH基因及副溶血性弧菌tdh基因序列设计引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定特异性和灵敏度。结果该多重PCR技术能在8 h内同时检测3种目的菌,通过检测其他9种常见食源性致病菌,结果表明该方法特异性好,多重PCR检测灵敏度分别为:沙门菌104cfu/mL,志贺菌102cfu/mL,副溶血性弧菌104cfu/mL。并进行了人工模拟食品和粪便样品的检测。结论初步建立能在8h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和副溶血性弧菌的多重PCR检测技术。     

双重实时荧光定量PCR检测产志贺毒素大肠埃希菌stx1和stx2基因

摘要：目的：建立一种检测产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)的双重实时荧光定量PCR法。 方法：根据stx1和stx2及其变种序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度和特异性评价,并对STEC模拟粪便标本及动物粪便标本进行检测分析。 结果：双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的灵敏度为1×10² copies/反应体系;该法对17种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对47株不同志贺毒素类型及变种的已知STEC菌株的检测特异性为100%;对模拟粪便标本的检测下限为3.55×10³ CFU/g;对动物粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。 结论: 建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同志贺毒素类型及变种的STEC菌株的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本和动物粪便标本STEC感染的快速筛查。