氨基胍延缓人胚肺二倍体成纤维细胞复制性衰老的实验研究

目的探讨人工合成单体抗氧化剂氨基胍（2-AG）对人胚肺二倍体成纤维细胞（2BS）复制性衰老的影响及其分子机制。方法观察2-AG对2BS细胞衰老表型、细胞代龄、传代速度、细胞周期、细胞增殖能力、晚期糖基化终末产物（AGEs）水平及衰老相关β半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性率的影响。结果2-AG可维持细胞的非衰老表型，增加2BS细胞代龄19～20代，MTT法分析发现用2-AG孵育细胞84h，细胞增殖能力较对照组升高36％～40％。2-AG显著加快了细胞的增殖速度，其培养细胞S期的比例较对照细胞升高约1倍。另外，2-AG连续培养的细胞在老龄阶段AGEs、SA-β-Gal阳性率均显著低于老年对照细胞，而与年轻2BS细胞相似。结论2-AG可有效延缓2BS细胞的复制性衰老。     

人胚肺成纤维细胞复制性衰老的基因表达变化

目的检测人胚肺成纤维细胞(2BS细胞)复制性衰老过程中的基因表达变化,并试图寻找细胞衰老的标志性基因。方法利用cDNA芯片对比检测28代龄和64代龄的2BS细胞基因表达谱,通过RT-PCR对挑选的9个差异基因在7个不同代龄2BS细胞中的表达进行验证分析。结果和年轻细胞相比,衰老2BS细胞有117种基因的变化幅度在2倍以上,46种基因在2.5倍以上;细胞衰老过程中下调的基因主要是细胞周期相关基因,上调基因主要参与细胞应激反应和蛋白分泌等过程;9个差异基因的RT-PCR验证结果与芯片结果基本一致。结论基因芯片是研究细胞衰老基因表达和调控网络的重要工具,可用于衰老特征性基因的筛选。     

p16基因甲基化在人二倍体成纤维细胞衰老中的作用

目的 研究DNA甲基化与衰老细胞中细胞周期负调控因子p16^MTS1/INK4a高表达的关系。方法 应用甲基化敏感的DNA限制性内切酶与PCR相结合的方法,分析特定位点的甲基化状态。结果 人胚肺二倍体成纤维细胞衰老过程中p16基因表达增高,中年细胞与衰老细胞中p16基因的表达水平分别约为年轻细胞的3倍和10倍。p16基因外显子Ⅰ限制性内切酶SmaⅠ位点的甲基化水平则表现出随增龄而降低的趋势,在年轻细胞、中年细胞中分别约为64％和41％,虽然在衰老细胞中仅为24％,但仍保持一定的水平。结论 p16基因外显子Ⅰ的SmaⅠ位点的甲基化水平改变可能与其在衰老过程中的高表达有一定的关联,其重要性值得进一步研究。     

抑制细胞间通讯功能可加速人成纤维细胞的衰老

目的研究间隙连接蛋白connexin43在人成纤维细胞衰老过程中的调节作用。方法设计并合成针对人connexin43的双链RNA(siRNA),抑制人二倍体成纤维细胞WI-38细胞的connexin43表达和细胞间通讯功能,观察对其衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性率、细胞增殖能力、细胞周期调节蛋白P27、P21表达水平等衰老表型的影响。结果我们合成的siRNA-cx43可高效、特异的抑制connexin43 mRNA和蛋白质表达及细胞间通讯功能。转染WI-38细胞后,细胞增殖能力降低、细胞SA-β-gal染色阳性率(75.32±5.17)较对照组(32.48±3.94)和转染siRNA-con组(37.81±4.1 2)细胞升高(P<0.05),P27、P21表达增加,转染siRNA-cx43的WI-38细胞增殖能力显著降低,细胞变扁平、肥大,细胞SA-β-gal染色阳性率达100%,细胞提前出现衰老。结论间隙连接蛋白connexin43对WI-38细胞的衰老进程有重要的调节作用,其表达减少和细胞间通讯功能降低,可以促进WI-38细胞衰老进程。     

松花粉抗成纤维细胞复制性衰老的机制

目的 研究松花粉对衰老成纤维单细胞面积、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)阳性率、p16INK4A和p21CIP-1表达以及细胞周期的影响.方法 以二倍体成纤维(2BS)细胞建立衰老细胞模型.生物体视学法分析单细胞面积变化;免疫组化法测SA-β-gal阳性率;流式细胞术分析细胞周期;RT-PCR法测定p16INK4A、p21CIP-1基因mRNA表达量.结果 56代细胞出现典型的衰老细胞形态改变,同时SA-β-gal染色阳性率与G1期细胞比例均增高.经松花粉处理后,衰老细胞的单细胞面积、SA-β-gal染色阳性率与G1期细胞比例均显著减少(P＜0.05);p16INK4A与p21CIP-1mRNA的表达量均较衰老模型组明显下调(P＜0.05). 结论松花粉具有改善细胞复制性衰老的作用,其分子机制可能与下调p16INK4A及p21CIP-1基因mRNA的表达从而改善衰老细胞G1期阻滞有关.     

细胞周期抑制因子p16可诱导人成纤维细胞发生衰老样变化

目的 探讨细胞周期抑制因子p16在细胞衰老中的作用。方法 利用逆转录病毒载体将p16基因转染入人胚肺二倍体成纤维细胞2BS中,获得高表达,检测其对2BS细胞衰老的影响。结果 与对照组细胞相比,p16基因转染后,2BS细胞生长速度下降了约50％,细胞周期阻滞于G1期,细胞对生长因子刺激的反应性下降了79．4％,细胞形态呈衰老细胞样变化。结论 p16在人二倍体成纤维细胞的衰老过程中起促进作用。     

SO2慢性染毒对中国仓鼠肺成纤维细胞DNA损伤的实验研究

目的 探讨低浓度SO2长期暴露对哺乳动物肺细胞DNA的影响.方法 采用单细胞凝胶电泳技术(彗星试验)观察不同染毒浓度SO2对中国仓鼠肺成纤维细胞(chinese hamster lung fibroblast,CHL)DNA的损伤作用及其程度,以研究其致癌作用和致癌机制.结果 SO2浓度为(20±1)mg/m3、(30±1) mg/m3时,CHL细胞的细胞核DNA迁移长度分别为(11.23±2.56)μm、(23.33±19.65)μm,拖尾长度明显增加(P＜0.01).结论 浓度较低的SO2也具有引起哺乳动物肺细胞DNA突变的潜在危险.     

花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞的抗衰老研究

本研究选用体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS株)作为抗衰老研究体外模型,从30代开始在培养液中加入花粉精为实验组,加入氢化可的松为阳性对照组,不加任何药物为空白对照组。结果表明,加入花粉组传至80代,空白对照组细胞传至64.5代,阳性对照组传至72代。花粉组细胞的生长形态和增殖速度均优于对照组。本研究证明,花粉对体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞有抗衰老作用。     

松花粉对衰老成纤维细胞线粒体DNA缺失突变的影响

目的 通过研究松花粉对衰老细胞线粒体(mt) DNA4977缺失突变的影响,探讨松花粉抗衰老的作用机制.方法 将细胞分为青年组、衰老细胞组、含240 mg/dl松花粉的衰老细胞处理组,三组细胞分别用不同培养基培养后,抽提线粒体DNA,进行PCR检测mtDNA4977缺失突变,以线粒体DNA中保守序列PCR扩增结果作为内参,比较各组mtDNA4977缺失突变在总线粒体DNA中的比例;同时对各组细胞进行β-半乳糖苷酶染色;并测定各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量.结果 松花粉能够改善衰老成纤维细胞的衰老变化,并能降低衰老细胞mtDNA4977的缺失突变,提高细胞SOD活性及降低其MDA含量(P＜0.05).结论 松花粉可能通过减轻成纤维细胞的氧化损伤,从而保护细胞mtDNA延缓成纤维细胞的衰老.     

Comparative levels of DNA breaks and sensitivity to oxidative stress in aged and senescent human fibroblasts: a distinctive pattern for centenarians

Basal and H₂O₂-induced DNA breaks as well as DNA repair activity and efficacy of the antioxygenic system were determined in human dermal fibroblasts explanted from either (i) young donors and passaged serially to reach replicative senescence or (ii) young, old and centenarian donors and shortly propagated in culture. These fibroblasts have been employed as an in vitro and ex vivo model, respectively, to evaluate comparatively DNA integrity during senescence (increasing population doubling levels) and aging (increasing donor age). Constitutive levels of DNA total strand breaks, as determined by the alkaline extraction procedure, changed moderately among the different cell lines, which exhibited, however, significant differences in the amount of either single or double strand breaks. The former decreased along with both aging and senescence; the latter augmented during senescence while being virtually steady during aging. Moreover, fibroblasts from centenarians showed to be less sensitive to H₂O₂-induced DNA damage than otherex vivo fibroblasts. This feature could not account for either increased DNA repair activity or higher efficacy of the antioxygenic system and pointed, instead, to an intrinsic nuclear stability which might be typical of centenarian fibroblasts and potentially functional to longevity. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

去氢骆驼蓬碱致细粒棘球蚴DNA损伤修复相关基因表达量的检测

目的观察去氢骆驼蓬碱(HM)对细粒棘球蚴不同类型DNA损伤修复基因表达量的影响。方法以细粒棘球蚴为实验材料,以HM为药物,以虫体不同类型DNA损伤修复方式(同源重组修复、非同源末端连接修复、碱基切除修复)及核苷酸切除修复通路的关键修复基因为目的基因设计引物,筛选确定qRT-PCR反应体系,采用该体系检测基因的差异表达水平,分析HM对细粒棘球蚴不同类型DNA损伤修复相关基因的影响。结果筛选的细粒棘球蚴DNA损伤修复类型代表基因BRCA1引物F:5’-TGATTGCGACCTAAGAGAC-3’,R:5’-TTCCATACACAAGCCATCC-3’);KU70引物F:5’-TGATTGCGACCTAAGA GAC-3’,R:5’-GTCGCCATCTCAACTTCA-3’);OGG1引物5’-CGCTATGGTAAGAAGATGTG-3’,R:5’-CGTGAAGATGGATGGAGAA-3’);ERCC1引物F:5’-TCGTGCTCATTGTGTTAGT-3’,R:5’-CTCCTCTGGTGGCTTATTC-3’)。各基因扩增曲线Ct值可用,溶解曲线特异性良好。qRT-PCR检测各样品组BRCA1,KU70,OGG1基因表达均有不同程度上调,DOX组分别为26.05倍,323.44倍,29.63倍,HM组分别为7.24倍,55.65倍,3.22倍,以KU70和BRCA1基因上调尤为明显。ERCC1基因表达量DOX组显著上调(上调倍数25.24),HM组无显著变化。结论 HM对DNA双链断裂修复类型代表基因BRCA1,KU70,OGG1表达量有较大影响,而对ERCC1基因表达无显著影响。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇致Vero细胞核基因组DNA损伤与修复的彗星实验观察

目的　应用彗星实验技术观察脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (DON)对Vero细胞DNA损伤与修复特征 ,探讨DON的遗传毒性。方法　① 1μmol、5 μmol、10 μmolDON对指数生长期的Vero细胞分别染毒 4、16h后 ,观察DNA的损伤。② 10μmolDON处理的细胞重新孵育 15、3 0、60、12 0min ,观察DNA损伤修复。③以彗星实验技术结合“彗星图像分析软件(KIAS)”获得彗星细胞主要参数 ,并进行统计分析。结果　①随染毒剂量增加 ,染毒时间延长 ,受损伤细胞的数量逐渐增加 ,细胞DNA损伤程度逐渐加重 ;短时间染毒 ( 4h) ,损伤以DNA碎片的数量增加为主 ;较长时间染毒 ( 16h) ,损伤以DNA碎片变小为主。②去除DON ,重新孵育若干时间 ,随修复时间延长 ,受损伤细胞数量逐渐减少 ,细胞DNA损伤程度逐渐减轻 ,提示受损细胞在进行自我修复 ;短时间染毒 ( 4h)修复启动时间较短 ( <15min) ,而长时间染毒 ( 16h)修复启动时间也相应延长 ( >15min) ;孵育 12 0min后 ,修复完成。结论　DON毒素可致Vero细胞DNA损伤 ,重新孵育若干时间后损伤可修复。     

H_2O_2致小鼠淋巴细胞DNA的损伤及修复

目的　应用单细胞电泳检测 (SCGE)过氧化氢 (H2 O2 )致小鼠淋巴细胞 DNA损伤及其修复。方法　标准 SCGE条件下荧光显微镜观察。结果　 H2 O2 不同浓度 80、16 0和 32 0μmol/ L ,3个组 H2 O2 浓度均可致小鼠淋巴细胞 DNA损伤 ,较低剂量即可造成细胞拖尾 ,可逆性损伤在 6 0 m in内可获得明显修复。结论　单细胞电泳可快速灵敏地检测氧化损伤 ,也可能用于流行病学研究。     

Cyclin D type does not influence cell cycle response to DNA damage caused by ionizing radiation in multiple myeloma tumours

Multiple myeloma (MM) is characterized by over‐expression of cyclin D1 (CCND1) or D2 (CCND2), which control G1 phase cell‐cycle progression. Proteolytic degradation of CCND1 (but not CCND2), resulting in G1 arrest, is reported in non‐MM cells post‐DNA damage, affecting DNA repair and survival. We examined the effect of ionizing radiation (IR) on D‐cyclin levels and cell‐cycle kinetics of MM cells, exploring differences based on D‐cyclin expression. We showed that CCND1 is downregulated, whereas CCND2 is not, following IR. This did not lead to hypo‐phosphorylation of retinoblastoma protein or G1 arrest. Both CCND1‐ and CCND2‐expressing MM cells arrested in S/G2/M, and did not differ in other cell‐cycle proteins or sensitivity to IR. When treated with a CDK4/6 inhibitor, both CCND1 and CCND2 MM cells arrested in G1 and therefore are subject to physiological regulation at this checkpoint. Immunoprecipitation showed that, despite CCND1 degradation following IR, sufficient protein remains bound to CDK4/6 to prevent G1 arrest. Aberrant expression of CCND1 driven from the IGH promoter in t(11;14) MM cells maintains progression through G1 to arrest in S/G2/M. Differential expression of D‐cyclin does not appear to affect cell‐cycle response to IR, and is unlikely to underlie differential sensitivity to DNA damage.     

刚地弓形虫感染致小鼠生殖细胞DNA损伤的作用

目的 探讨刚地弓形虫感染对小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用.方法 选用9～10周龄雄性BALB/c小鼠20只,随机分为4组,每组5只,分为正常对照组(CG)和3个染虫组(G1,G2,G3).采用腹腔注射法建立小鼠刚地弓形虫感染的动物模型,CG组每只注射PBS 0.2 ml;染虫G1,G2,G3组注射纯化的刚地弓形虫速殖子悬液,每只注射刚地弓形虫速殖子的量依次为2.5×10 3、5×10 3、1×10 4,注射体积均为0.2 ml,应用单细胞凝胶电泳检测睾丸细胞DNA的损伤. 结果 正常对照组和染虫组的尾距分别为10.94±7.57、40.37±6.25、69.76±3.97、79.16±6.36,olive尾距分别为10.57±6.72、31.39±4.59、48.66±4.60、53.87±6.55,G1-G3组与CG组比较,差异具有统计学意义(P＜0.01).结论 弓形虫感染可导致小鼠睾丸生殖细胞DNA不同程度的损伤.     

刚地弓形虫感染致小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用

目的探讨刚地弓形虫感染对小鼠睾丸细胞DNA的损伤作用。方法选用9～10周龄雄性BALB/c小鼠20只,随机分为对照组(CG)和3个染虫组(G1、G2和G3)。采用腹腔注射法建立小鼠刚地弓形虫感染的动物模型,CG组注射PBS 0.2 ml/只,染虫G1、G2和G3组各注射纯化刚地弓形虫速殖子悬液0.2 ml,剂量分别为2.5×10~3个、5×10~3个和1×10~4个。应用单细胞凝胶电泳(彗星实验)检测睾丸细胞DNA的损伤。结果对照组和3个染虫组的彗星实验尾矩分别为10.94±7.57、40.37±6.25、69.76±3.97和79.16±6.36;Olive尾矩分别为10.57±6.72、31.39±4.59、48.66±4.60和53.87±6.55,对照组和实验组彗星尾矩和Olive尾矩差异有统计学意义(P<0.01)。结论弓形虫感染可致小鼠睾丸细胞DNA不同程度的损伤。对小鼠有生殖遗传毒性。     

韩宗超

目的 观测过氧化氢诱导的大鼠衰老神经细胞DNA损伤与修复情况。方法 在荧光显微镜下观察不同浓度H2O2处理的3月、8月和26月龄大鼠的脑皮质、海马和基底节经分离的神经细胞及氧化损伤断裂的单链DNA,并做彗星图像分析。结果 在相同浓度H2O2介导下,衰老神经细胞DNA损伤分值较正常神经细胞高,皮质细胞较海马、基底节区细胞DNA损伤分值高,细胞更易受损伤。给予0．5～4．0 h孵育后,表明脑细胞最大修复时间仅为1．0 h,且衰老神经细胞较正常神经细胞的DNA损伤分值高,修复能力下降。当H2O2介导浓度为64 μmol／L时,3月龄鼠脑皮质、海马和基底节神经细胞DNA损伤分值依次为250、213和205,26月龄鼠DNA损伤分值依次为355、340和335。当H2O2介导浓度为128 μmol／L时,26月龄鼠DNA修复率约为10％。结论 彗星实验是一种非常敏感的检测DNA损伤与修复的方法。