X-盒结合蛋白1条件性基因敲除小鼠模型的建立

目的建立可进行条件性敲除X-盒结合蛋白1(Xbp1)基因的flox杂合子小鼠。 方法通过ET-clone的方法构建基于cre-loxp系统和FLP-frt系统的条件性基因打靶载体。载体线性化后电转JM8A3 ES细胞,经G418和Ganc筛选获得抗性ES细胞克隆。经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。 结果成功构建打靶载体,共获得144个抗性ES细胞,克隆经长片段PCR鉴定,共获得4个正确同源重组的阳性克隆。获得4只阳性F1代小鼠,经测序鉴定正确。Xbp1基因flox杂合子小鼠表型无明显异常。 结论成功构建了条件性敲除Xbp1基因的flox杂合子小鼠,为未来研究器官或组织特异性的Xbp1生物学作用奠定了基础。     

XBP1s条件性过表达定点敲入小鼠模型的建立

目的获得可进行条件性过表达XBP1s基因的Rosa 26定点敲入杂合子小鼠。 方法通过In-Fusion Cloning的方法构建胚胎干细胞(ES细胞)打靶载体,并进行线性化,电转染JM8A3 ES细胞。药物筛选获得抗性ES细胞克隆,经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。 结果经酶切鉴定证明打靶质粒构建成功,经胚胎干细胞打靶共获得144个抗性ES细胞克隆,通过长片段PCR的方式对同源重组阳性克隆进行筛选和克隆经测序确认,共获得21个正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞克隆E3、C6经扩增后注射C57BL/6J小鼠囊胚96个,通过胚胎移植,共获得2只高嵌合雄鼠,与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得3只F1代杂合小鼠,经PCR及测序鉴定正确。 结论成功建立了XBP1s基因的Rosa26定点敲入F1代杂合子小鼠,为未来获得免疫细胞、肾脏固有细胞及腹膜间皮细胞XBP1s条件性敲入小鼠奠定了基础。     

小鼠生长激素促分泌素受体真核表达载体的构建及表达鉴定

目的 构建小鼠生长激素促分泌素受体(GHS-R)真核表达系统,并观察其在瞬时转染的COS-7细胞系中的表达情况.方法 以小鼠基因组为模板,通过拼接PCR技术(SOE-PCR)克隆出GHS-R的编码序列(CDS),插入真核表达载体pcDNA3中,构建重组真核表达质粒pcDNA3-GHS-R,酶切鉴定并测序,瞬时转染COS-7细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能在真核细胞中表达相应的目的 蛋白.结果 成功扩增了小鼠GHS-R编码序列(CDS),酶切和测序证明pcDNA3-GHS-R构建正确,Western Blot方法证实转染的该质粒能在COS-7细胞中正确表达目的 蛋白.结论 成功构建了小鼠GHS-R真核表达载体,并正确表达蛋白,为进一步研究GHS-R的功能奠定了基础.     

胰腺癌特异性受体基因载体的构建及环氧合酶2L启动子的作用

目的构建环氧合酶-2L启动子（Cox-2L）及2型生长抑素受体（SSTR2）基因重组腺病毒载体，以研究SSTR2重新表达及腺病毒感染对胰腺癌细胞的影响。方法用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法从人正常胰腺组织中调取SSTR2基因，以HL60细胞基因组DNA为模板，以PCR法调取Cox-2L基因，以SSTR2及Cox-2L基因片段为模板，以PCR法扩增Cox-2L—SSTR2融合基因并连入TaKaRa公司pAxcwit腺病毒载体中，以电穿孔法转化E．Coli后挑选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定。以pAxcwit—Cox-2L—SSTR2转染HEK293细胞获得重组腺病毒颗粒，进行PCR、酶切鉴定。结果调取并连接后的基因片段经测序证实为Cox-2L、SSTR2及Cox-2L-SSTR2融合基因，Cox-2L-SSTR2基因片段及PolyA克隆入T载体，经酶切并测序证实PMD18-T—Cox-2L—SSTR2-PolyA构建成功。pAxcwit—Cox-2L—SSTR2-PolyA经酶切及PCR鉴定，Cox-2L—SSTR2-PolyA融合基因正确连入腺病毒载体。结论成功构建了Cox-2L—SSTR2基因重组腺病毒载体，为进一步研究SSTR2在胰腺癌细胞中的表达及作用奠定了基础。     

小鼠胆碱乙酰基转移酶慢病毒载体的构建及其在RAW264.7细胞中的表达

目的：构建胆碱乙酰基转移酶（ChAT）过表达的慢病毒载体,转染小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7,上调细胞中ChAT表达.方法：利用PCR方法从小鼠cDNA文库中调取ChAT基因,克隆至pGC-FU慢病毒载体上,经PCR和测序鉴定.用pGC-FU-ChAT质粒转染RAW264.7后,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）表达,real-time PCR检测RAW264.7细胞中ChAT基因表达丰度.结果：融合表达GFP的慢病毒载体pGC-FU-ChAT感染RAW264.7细胞的效率可达80%以上,感染细胞ChAT基因表达大幅上调.结论：成功构建了携带ChAT基因的慢病毒载体,能有效感染RAW264.7细胞,细胞中ChAT基因过表达.     

携带Notch-1受体胞内段基因重组腺病毒载体的构建及其在胰腺腺泡细胞中的表达

目的构建并鉴定携带Notch-1受体胞内段基因（NICD）的腺病毒表达载体，同时观察重组腺病毒在胰腺腺泡细胞中的表达。方法提取K562细胞总RNA，利用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）扩增NICD并将其克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，经PmeI酶切线性化质粒后与pAdeasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组。将鉴定正确的同源重组质粒线性化后转染293细胞进行包装、扩增得到重组腺病毒颗粒Ad—NICD。将该病毒感染胰腺腺泡细胞并通过实时定量PCR检测其表达。结果经PCR、基因测序和酶切鉴定证实重组质粒pAd—NICD构建成功，将重组质粒导入293细胞可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）的表达，实时定量PCR证实病毒颗粒Ad—NICD感染腺泡细胞后可以有效地增加NICD表达。结论成功构建Ad—NICD并证实其在腺泡细胞中的表达，为进一步研究Notch信号传导途径及其与胰腺的疾病的关系奠定了基础。     

小鼠睾丸gdnf基因的克隆及其在支持细胞中的表达

目的：从小鼠睾丸中克隆胶质细胞源神经营养因子基因gdnf,构建真核表达载体,并转染支持细胞,以便用作培养精原干细胞（SSCs）的滋养层。方法：以正常成年昆明鼠为材料,提取小鼠睾丸组织中总RNA后,以RT-PCR技术克隆小鼠睾丸gdnf基因,构建真核表达载体,并转染TM4细胞（睾丸支持细胞株）,在转染后40h进行免疫荧光鉴定。结果：成功克隆小鼠睾丸gdnf基因的cDNA,测序正确,免疫荧光细胞染色显示转染后的支持细胞中有GDNF蛋白表达。结论：本研究为以转染了gdnf基因的支持细胞作饲养层培养SSCs奠定了基础。     

利用新型DNDF7和携带LoxP位点的LPL4质粒快速构建S-Sox5基因打靶载体

目的体外实验已证实S-SOX5蛋白转录调节运动纤毛基因Spag6,为进一步探索其在体内的作用,拟构建S-Sox5基因的敲除载体。方法利用新型DNDF-7和携带LoxP位点的LPL4载体,选择S-Sox5基因第1外显子作为条件性敲除目的片段,SV129系ES细胞DNA为模板分步扩增包括S-Sox5第1外显子的中间段(middle piece),上游同源左臂4.8kb(upper arm)及下游同源右臂2.5kb(down arm)的基因片段;构建upper-arm-DNDF7、down-armDNDF7和middle-piece-LPL4质粒,将middle-piece-LPL4的酶切产物LoxP-middle-piece-LoxP和down-arm-DNDF7酶切产物相连,形成携带LoxP位点的middle-down-arms-DNDF7重组质粒,该质粒与upper-arm-DNDF7酶切产物相连,获得S-Sox5基因打靶载体。结果经酶切鉴定及测序证实,构建的upper-arm—DNDF7、middle-piece—LPL4、down-arm—DNDF7重组质粒和S-Sox5基因打靶载体结构正确,与设计相符。结论成功构建小鼠S-Sox5条件基因打靶载体,为进一步建立S-Sox5条件敲除小鼠,在体内研究其功能打下基础。     

成骨诱导双基因共表达腺病毒载体的构建

目的 探讨用一条Link序列T2A连接骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因构建含目的 基因的腺病毒载体的可行性.方法 先从cDNA中扩增得到全长BMP-2和bFGF基因片段,再接于Link序列T2A的两端.通过T2A Peptide的互补.延伸得到BMP2-T2A-bFGF的全长PCR产物,利用上游引物的Bgl Ⅱ酶切位点和下游引物的EeoRV酶切位点将其插入到pShuttle-IRES载体中,酶切、测序鉴定;利用同源重组技术将目的 基因表达框从穿梭质粒转移到腺病毒载体,鉴定阳性克隆;将PacI线性化后的腺病毒载体转染到293A细胞,观察GFP表达,PCR鉴定后进行大量扩增,并用CsCl梯度离心法进行纯化;测量A260,计算病毒感染滴度.结果 克隆得到的BMP-2与bFGF基因测序正确.经BglⅡ和EeoR Ⅴ双酶切得到的BMP2-bFGF 2个基因全长序列完全克隆到穿梭质粒和重组腺病毒载体质粒中;转染293A细胞2周后观察到明显的GFP聚集表达,即病毒包装成功,扩增纯化后滴度为3.6×1011 VP/ml.结论 经酶切鉴定BMP-2与bFGF双基因共表达腺病毒载体构建成功.     

携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒的构建

目的 构建携带小鼠白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体,研究肝脏Hepa l石细胞的IDO基因mRNA及蛋白表达情况.方法 酶切含有小鼠全长IDO cDNA的IDO质粒,亚克隆至穿梭载体pAdTrack.ALB上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,生成并筛选阳性克隆,测序、鉴定正确后,转染AD-293细胞进行包装、扩增,检测病毒滴度,RT-PCR和荧光显微镜鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达.重组腺病毒进一步感染Hepa 1-6细胞,RT-PCR和WesternBlot法分别检测IDO基因在细胞内表达情况.结果 经酶切及测序证实携带白蛋白启动子和IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,病毒感染滴度为2.9×10~6pfu/ml.感染Hepa 1-6细胞后,RT-PCR和Western Blot可以检测到IDO mRNA水平和蛋白水平表达.结论 构建了携带白蛋白启动子和IDO基因的重组腺病毒载体.