小鼠GM—CSF cDNA重组逆转录病毒的构建及在成纤维细胞中的表达

为探索粒－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因治疗的可能性，将小鼠ＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ重组于缺陷型逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ中，重组质粒转染病毒包装细胞ＰＡ３１７，经Ｇ４１８筛选，用其抗性克隆培养上清液感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３筛选出抗Ｇ４１８的转化细胞克隆，用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明转化细胞的基因中整合有ＮｅｏＲ基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因，原位杂交显示转化细胞有较强的ＧＭ－ＣＳＦｍ     

GM—CSF基因转导的肿瘤疫苗研究

目的：观察ＧＭ－ＣＳＦ基因转导的肿瘤细胞免疫小鼠的抗肿瘤效果。方法：用电穿孔法将小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的表达质粒导入ＲＭＡ淋巴瘤细胞,经Ｇ４１８筛选后,将ＧＭ－ＣＳＦ高表达克隆（ＲＭＡ－ＧＭ）细胞皮下接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠,观察成瘤性,以及经丝裂霉素－Ｃ处理灭活的ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠,观察抗肿瘤作用。结果：ＲＭＡ－ＧＭ细胞免疫小鼠及亲代肿瘤细胞攻击后与对照组相比,肿瘤生长速度减慢,小鼠生存期明显延长     

HSV-TK基因逆转录病毒重组体的构建和鉴定

利用逆转录病毒载体ｐＬＮＳＸ构建了带ＨＳＶＴＫ基因的逆转录病毒重组体ｐＬＮＳＴＫ，用磷酸钙沉淀法转染ＰＡ３１７包装细胞，经Ｇ４１８筛选抗性克隆，建立了产生重组病毒的载体产生细胞系ＰＡ３１７／ＴＫ，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒（ＣＦＵ）滴度为３×１０８Ｌ－１。提取ＰＡ３１７／ＴＫ细胞的ＤＮＡ和细胞上清液的ＲＮＡ，在特异性引物引导下，分别用ＰＣＲ和ＲＴＰＣＲ检测证实ＰＡ３１７／ＴＫ细胞整合了ＨＳＶＴＫ基因并产生重组病毒，为ＨＳＶＴＫ基因治疗恶性肿瘤的实验研究打下了基础。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７，经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆，用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度，获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６，得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ，经ＰＣＲ检测，ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性，结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降，基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

基因转移人TGF-β1在NIH/3T3细胞中表达鉴定

目的：研究转移人转化生长因子β１（ＴＧＦ－β１）在真核细胞系中蛋白表达。方法：借助真核质粒表达载体,将人ＴＧＦ－β１转移入小鼠成纤维细胞株（ＮＨ／３Ｔ３）细胞中,经Ｇ４１８筛选,克隆扩增,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＰＣＲ、ＰＴ－ＰＧＲ鉴定,并经水貂肺上皮细胞（ＣＣＬ－６４）生长抑制法,对克隆细胞分泌ＴＧＦ－β１蛋白进行活性检测。结果：证实了重组人ＴＧＦ－β１基因在ＮＩ     

vIL—10逆转录病毒载体构建及在鼠成纤维细胞中的表达

目的：探讨ｖＩＬ－１０的免疫抑制作用，为应用ｖＩＬ－１０进行免疫基因治疗打基础。方法：用基因重组技术将ｖＩＬ－１０ｃＤＮＡ克隆到逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ，并用脂质体法导入包装细胞ＰＡ３１７，取基土清感染小鼠成纤维细胞ＮＩＨ３Ｔ３。结果：经筛选获得抗Ｃ４１８的ＮＩＨ３Ｔ３阳性克隆，用ＲＴ－ＰＣＲ，ＥＬＩＳＡ方法检测到ｖＩＬ－１０的表达，用＾３Ｈ－ＴＤＲ法检测到ｖＩＬ－１０对ＭＬＲ的抑制作用。结论     

逆转录病毒转染的小鼠IL－3基因在NIH／3T3细胞中的表达

将小鼠白细胞介素３（ＩＬ－３）ｃＤＮＡ重组到逆转录病毒载体ｐＮ２Ａ质粒上，用电穿孔法将此重组子转染包装细胞系（ＰＡ３１７），经用Ｇ４１８（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）选择培养基筛选，得到产病毒效价为每ｍｌ５×１０４～２×１０５ＣＦＵ（ｃｏｌｏｎｙ－ｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）的Ｇ４１８抗性细胞克隆。然后取其培养上清液转染ＮＩＨ／３Ｔ３细胞。通过检测被病毒转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞培养上清液对小鼠骨髓细胞的增殖反应（ＭＴＴ法）和促分化作用（ＣＦＵ培养法），表明转染的ＮＩＨ／３Ｔ３细胞克隆能分泌ＩＬ－３。此结果为进行ＩＬ－３转基因治疗研究奠定了实验基础。     

CD自杀基因联合GM-CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理

目的：研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机制。方法：小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３ｄ后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续１０ｄ腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）、单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组、单用ＡｄＧＭ－ＣＳＦ组、注射对照病毒ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ组或ＰＢＳ组。结果：与接受ＡｄＣＤ／５ＦＣ、ＡｄＧＭ－ＣＳＦ、ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ或ＰＢＳ治疗的荷瘤小鼠比较,经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制,荷瘤小鼠的存活期明显延长（Ｐ＜０．０１）。经ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ联合基因治疗后,肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、ＣＤ８＋Ｔ细胞浸润,黑色素瘤细胞表达ＭＨＣ－Ⅰ和Ｂ７－１分子明显增加,荷瘤小鼠脾细胞对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论：联合应用自杀基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞,又可提高机体对肿瘤的免疫应答,两者可协同发挥抗肿瘤作用。     

重组人造血生长因子对骨髓增生异常综合征造血干细胞集落分化的研究

用体外细胞培养法，观察重组造血生长因子（Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＰＨＡ－ＬＣＭ）对骨髓增生异常综合征（ＭＤＳ）造血干细胞集落分化进行研究。结果表明：ＭＤＳ造血干细胞对正常造血生长因子Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ的感受性低于正常组而高于再障（ＡＡ）组，其丛／集比值明显高于正常组和ＡＡ组，在ＭＤＳ转化为白血病过程中，其造血干细胞对正常造血生长因子的感受性降低尤为显著，而对白血病克隆源性细胞生长所需要的条     

抗人粒细胞集落刺激因子单克隆抗体的研制

应用杂交瘤技术，用重组人Ｇ－ＣＳＦ（ｒｈＧ－ＣＳＦ）免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，然后将其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＮＳ－１融合，成功地获得了多种能够分泌抗ｒｈＧ－ＣＳＦ单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交癌细胞。对其中的２株杂交瘤细胞２Ａ６和２Ｃ２分泌ＭｃＡｂ的研究表明，它们能够特异性地和ｒｈＧ－ＣＳＦ结合，而与重组的人ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－ＣＳＦ、ＩＬ－２、ＩＬ－２α和ＴＮＦ细胞因子无交叉反应，为抗Ｇ－ＣＳＦ特异性ＭｃＡｂ。这些杂交瘤细胞经反复冻存和复苏后，仍能稳定地分泌ＭｃＡｂ。     

重组逆转录病毒介导的人载脂蛋白AI基因在肌源细胞中的表达

目的 探索一种安全有效的载脂蛋白ＡＩ基因表达系统。方法 构建含人载脂蛋白ＡＩ ｃＤＮＡ的双顺反子逆转录病毒载体ｐＬＡＥＮ,用其转化小鼠原代肌母细胞及肌源性细胞Ｃ２Ｃ１２,ＥＬＩＳＡ法检测细胞液中人载脂蛋白ＡＩ的含量。结果 转化后的小鼠原代肌母细胞及Ｃ２Ｃ１２细胞在分化为肌管细胞后均获得异源表达人载脂蛋白ＡＩ的能力;而且经Ｇ４１８筛选也获得稳定转化的Ｃ２Ｃ１２细胞株,３０天后仍保持有效表达人载脂蛋白     

HIV-1辅受体配体的逆转录病毒载体的构建和表达

目的: 构建HIV-1辅受体的配体-趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体,并观察在NIH3T3细胞的表达.方法: 从重组质粒pCMV-R-K-S-K中获取RANTES-KDEL-SDF-KDEL基因片段,构建RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体pLNCX-R-K-S-K,酶切鉴定并测序.采用标准的磷酸钙共沉淀法转染包装细胞Bing, G418筛选克隆细胞,制备重组病毒液,继之感染NIH3T3细胞,计算病毒滴度.间接免疫荧光检测NIH3T3细胞中RANTES、SDF-1的表达.结果: pLNCX-R-K-S-K逆转录病毒载体酶切和测序结果与预期一致,筛选出抗性克隆,制备了高滴度的重组病毒液,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可表达于转染细胞.结论: HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的逆转录病毒载体构建成功,重组病毒可以感染NIH3T3细胞,为下一步HIV-1感染实验打下了基础.     

四环素调控的WT1基因表达系统在U937中的建立

目的：在白血病细胞系U937中建立四环素诱导的WT1基因表达系统。方法：运用脂质体将质粒pRevTet-On、pRevTRE-Luc和pRevTRE-WT1分别转染逆转录病毒的包装细胞PT67以产生逆转录病毒。将逆转录病毒RevTet-On感染U937细胞，经G418筛选，产生抗性细胞，用有限稀释法将U937/Tet-On抗性细胞单克隆化。14天后，克隆逐步形成，在显微镜下标记并移出。再将逆转录病毒RevTRE-Luc瞬时感染这些克隆，培养基中加入强力酶素(Dox)2mg/L或不加Dox，应用荧光素酶报告基因分析试剂盒检测荧光素酶的活性。挑选一株低背景和高诱导倍数的U937/Tet-On克隆，最后将逆转录病毒RevTRE-WT1感染这株克隆。结果：在U937中建立四环素调控的WT1基因表达系统。结论：建立逆转录病毒整合的U937细胞株，可用四环素及其衍生物精确调控WT1基因的表达，为研究WT1在白血病细胞系的功能提供一种有力的实验手段。     

异基因外周血干细胞的动员,检测及临床移植的应用研究

目的：探讨异基因外周血干细胞移植（ａｌｌｏ－ＰＢＳＣＴ）供者经Ｇ－ＣＳＦ或Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ动员后,采集的外周血干细胞（ＰＢＳＣ）移植物中的幼稚粒细胞与单个核细胞（ＭＮＣ）、ＣＤ３４＾＋细胞及ＣＦＵ－ＧＭ之间的相关性和移植的剂量标准及临床应用效果。方法：对１１例ａｌｌｏ－ＰＢＳＣＴ供者用Ｇ－ＣＳＦ（９例）或Ｇ－ＣＳＦ＋ＧＭ－ＣＳＦ（２例）进行动员,于动员前及动员后,分别对外周血及ＭＮＣ惧物中的幼稚粒细胞、ＣＤ３４＾＋细胞及ＣＦＵ－ＧＭ进行检测计数,预处理方法主要用大剂量环磷酰胺（ＣＴＸ）＋全身照射（ＴＢＩ）。结果：动员后外周血中的幼稚粒细胞与ＣＤ３４＾＋细胞及ＣＦＵ－ＧＭ同步增加,外周血ＭＮＣ中的幼稚粒细胞数与ＣＤ３４＾＋细胞数及ＣＦＵ－ＧＭ有较好的相关性。１１例患者全部植活和恢复造血功能,并为染色体核型     

G418抗性HEK293细胞的培育

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。     

贮脂细胞TGF-1反义基因转移及对细胞外基质合成的抑制作用

目的探讨ＴＧＦβ１在肝纤维化贮脂细胞激活和细胞外基质产生中的作用。以及对细胞外基质基因的表达和自身ｍＲＮＡ表达的作用。方法将ＴＧＦβ１的基因序列反向插入逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ,构建反义ＴＧＦβ１的逆转录病毒载体ｐＬＡＴＳＮ,用ＰＡ３１７包装细胞包装,获得高滴度的逆转录病毒。将携有反义ＴＧＦβ１ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＬＡＴＳＮ导入人的贮脂细胞株ＬＩ９０内,选择稳定转染的贮脂细胞株培养,应用ＰＣＲ、ＲＴＰＣＲ检测反义基因的表达,用ＥＬＩＳＡ、免疫组织化学和原位杂交等方法检测ＴＧＦβ１和细胞外基质的产生。结果贮脂细胞株ＬＩ９０内有反义ＴＧＦβ１的表达,且其合成分泌ＴＧＦβ１和细胞外基质如ＦＮ、ＣｏｌＡ１降低。结论反义ＴＧＦβ１ＲＮＡ可以抑制贮脂细胞的激活和内源性ＴＧＦβ１和细胞外基质的产生,为抗纤维化基因治疗提供理论基础     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

mdr—1基因转移可提高肺癌细胞对阿霉素的抗性

以逆转录病毒介导，将人全长mdr-1cDNA导入人肺腺癌细胞系GLC82中，经G418和阿霉素筛选，挑选出3个阳性克隆。用mdr-1cDNA的一种特异引物在3个克隆中都扩增到1条167bp的带，表明mdr-1基因cDNA已稳定地整合在染色体基因组中。原位杂交显示转染细胞的mdr-1转录升高，免疫细胞化学发现转染细胞中P170糖蛋白呈弱阳性。MTT药敏实验表明3个克隆对阿霉素的抗药性分别是GLC细胞的6.4、7.0和8.8倍。提示在mdr-1基因cDNA转染的细胞中，mdr-1基因低表达足以大大提高细胞对药物的耐受性。     

HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达

通过ＤＮＡ重组技术,将ＨＳＶ１ ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ,以磷酸钙法转染ψ２,ＰＡ３１７包装细胞后,经Ｇ４１８筛选,抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３,细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ,最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。