汉坦病毒H8205株IL-2/G1融合基因在Vero细胞中的稳定表达

目的 探讨外源性IL-2／G1融合基因在非洲绿猴肾细胞(Vero)获得稳定表达的可行性,为汉坦病毒基因工程疫苗的研制提供一定的实验基础。方法将汉坦病毒H8205株G1的cDNA重组人源IL-2基因后克隆到真核表达载体pcDNA3．1／His,形成重组真核表达质粒pcDNA3．1／His-IL-2-G1,在脂质体介导下,将其导入Vero细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,并继续培养6周,然后通过间接免疫荧光、ELSIA、SDS-PAGE电泳等方法检测IL-2-G1基因在Vero细胞中的稳定表达情况。结果成功构建重组质粒pcDNA3．1／His-IL-2-G1,其片段插入方向正确。经间接免疫荧光和SDS-PAGE电泳证实,转染了真核表达质粒pcDNA31／His-IL-2-G1后在Vero细胞培养上清和胞浆中有融合蛋白的表达,其相对分子量为78000u,与预期的相符合。经人IL-2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论在脂质体介导下,外源性IL-2／G1融合基因能够成功导入Vero细胞并获得稳定表达。     

结核分枝杆菌热休克蛋白65与汉坦病毒G2糖蛋白融合基因真核表达载体的构建与表达

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65（HSP65）和汉坦病毒G2糖蛋白重组融合基因为基础的真核表达载体。为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定基础。方法 采用聚合酶链反应从结核分枝杆菌H37Rv株基因中．扩增出HSP65的编码基因，从T-H8205G2质粒扩增出G2糖蛋白的编码基因．经相应限制性核酸内切酶消化后．插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过脂质体介导转染NIH3T3细胞．用SDS-PAGE、免疫组织化学及免疫荧光方法分别测定表达产物的相对分子量及特异性。结果 获得正向插入的pcDNA3.1/ His-HSP65-G2重组表达质粒，表达产物的相对分子量为105kD．与理论预期大小一致．并且可与汉坦病毒H8205株的腹水抗体和HSP65单抗起特异反应。表明构建的pcDNA3．1／His-HSP65-G2能在哺乳动物细胞中表达并具有抗原性。结论 编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功。     

结核杆菌HSP65与汉坦病毒H8205株G2基因的构建

目的 构建以结核分枝杆菌热休克蛋白65和汉坦病毒G2重组融合基因为基础的核酸疫苗。方法 采用聚合酶链反应从结核杆菌H37Rv株基因中，扩增出HSP65的编码基因，从T—H8205G2质粒扩增出G2蛋白的编码基因，经相应限制性核酸内切酶消化后，插入真核表达载体pcDNA3．1／His，并将此重组质粒通过酶切、SDS—PAGE分别测定表达产物的相对分子量。结果 获得正向插入的pcDNA3．1／His—HSP65-G2重组表达质粒，与理论预期大小一致。结论 以编码HSP65和G2抗原基因的重组基因的真核表达载体构建成功，为进一步研究其在结核病和出血热防治中的作用奠定了基础。     

汉坦病毒H8205株M-IL-2融合基因的构建

目的研究汉坦病毒新型裸DNA疫苗,构建融合基因pcDNA3.1/HisBIL2M(G1 G2)。方法采用PCR扩增汉坦病毒H8205株G1和G2基因片段,将回收的G1和G2片段经双酶切插入到pcDNA3.1/HisBIL2,构建成新的质粒pcDNA3.1/HisBIL2M。结果融合基因转录一分子量为100kD左右的蛋白,对照组则未见电泳条带出现,回收的片段与预期的相符。结论成功构建pcDNA3.1/HisBIL2M融合基因。     

汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2-IL-2嵌合基因的稳定表达

目的 探讨汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2-IL-2嵌合基因（IL-2-G2）在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞获得稳定表达可溶性融合蛋白的可行性。方法 将人源IL-2基因与汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G2的cDNA分别克隆于真核表达载体pcDNA3．1-HisB，构建重组真核表达载体pcDNA3．1HisB-IL2G2，在脂质体介导下，将其导入cHO细胞，通过G418筛选获得阳性克隆，并继续培养6周，然后用原位杂交、ELISA、SDS-PAGE电泳方法检测IL-2-G2基因在CHO细胞中的稳定表达情况。结果 经原位杂交和SDS-PAGE电泳证实，转染pcDNA3．1-HisB-IL-2-G2的CHO细胞内有IL-2-G2的mRNA转录，且在培养上清和CHO细胞胞质中有融合蛋白的表达，经人IL-2 ELISA检测试剂盒检测证实在培养上清和细胞裂解物中所表达的融合蛋白有IL-2特性。结论 在脂质体介导下，外源性IL-2-G2嵌合基因能够成功导入CHO细胞并获得稳定表达。     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达

目的：构建牛乳头瘤病毒晚期基因L1-GFP融合基因真核表达质粒，自细胞水平探讨优化密码对晚期基因L1蛋白瞬时表达的影响。方法：用PCR方法扩增获得优化密码人源化BPVL1(hL1)基因。TA克隆后，酶切释放hL1基因，定向插入质粒pET30a／NM-GFP的BamHⅠ、SacⅡ位点，获得正确框架的hL1-GFP融合基因。再用BamHⅠ、NotⅠ酶切释放hL1-GFP融合基因，与pcDNA3载体定向重组构建真核表达质粒pcDNA3／hL1-GFP。同法克隆获得含野生型BPVL1-GFP融合基因的表达质粒pcDNA3／wL1-GFP。用质粒DNA分别在体外转染哺乳动物细胞COS-1细胞和Wish细胞，荧光显微镜下观察L1-GFP融合蛋白的瞬时表达情况。结果：酶切鉴定表明成功构建了含wL1-GFP、hL1-GFP的真核表达栽体，与pcDNA3／wL1-GFP相比，pcDNA3／kL1-GFP在COS-1细胞、WISH细胞中获得有效表达。结论：优化密码能提高乳头瘤病毒L1基因在哺乳动物细胞内的蛋白表达。     

丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段的融合基因真核表达载体pcDNA3 HCV C-Fe，为下一步修饰和转染树突状细胞，制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。方法：用分别含有Xhol I和Xba I初位点的人免疫球蛋白(IgG)Fc区基因上、下游引物，以含有人IgG基因序列的质粒pCMVsFc为模板，通过PCR扩增获得Fc区基因片段，基因片段回收后，以Xhol I和Xba I双酶切，定向插入到含HCV C基因的质粒PcDNA3 HCV C下游双粘端位点之间，获得重组表达质粒pcDNA3 HCVFc。通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。以抗HCV C和抗Fc单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法检测pcDNA3 HCV-Fc在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测定鉴定证实，pcDNA3 HCV—Fc插入片段为Fc区基因片段，免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pcDNA3 HCV—Fc可以在7721细胞中瞬时表达Fc基因，为研究HCV C—Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础。     

Sjcb2 DNA疫苗的构建及其在真核细胞中的表达（英文）

目的 克隆日本血吸虫组织蛋白酶B基因，构建真核表达重组质粒，转染真核细胞，观察其表达情况。方法用PCR技术从已构建好的重组质粒pBCSK＋／Sjcb2中扩增出Sjcb2基因片段，重组入克隆载体pUCm-T。再将Sjcb2基因片段亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋）。进行PCR、双酶切和DNA序列鉴定后，运用电穿孔技术将重组体pcDNA3．1（＋）／Sjcb2转染HeLa细胞，间接免疫荧光技术观察目的基因的表达。结果成功扩增出Sjcb2基因片段并构建DNA疫苗；重组质粒在HeIJa细胞中获得表达。结论Sicb2基因能够在体外真核细胞中表达。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

小鼠FGFR1/MIP3a-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法 设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果 经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。     

Stable Expression of Hantavirus H8205 Strain G1/IL-2 Gene and Immune Protection of the Fusion Gene

To explore the feasibility of stable expression of Hantavirus H8205 strain G1 segment and human IL-2 fusion gene in Vero cells, and to examine the immune protection effects on mice vaccinated with this recombinant eukaryotic expression vector containing Hantavirus G1 gene and IL-2 gene. With the help of lipofectamine, the Vero cells were transfected with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 and the positive cells were selected by G418. IFAT and SDS-PAGE elec- trophoresis were used to determine the stable transfection and expression of recombinant protein. Each mouse was inoculated with plasmids intramuscularly (i.m.) three times, 2 boosts were given at 2-week intervals, serum anti-hantavirus antibodies were detected by ELISA and neutralizing antibod- ies (NAb) were detected by Plaque Reduction Neutralization Test. The fusion protein expressed in Vero cells was 78 kD, corresponding to the estimated molecular size. The neutralizing antibody titers of mice with pcDNA3.1/HisB-IL-2-G1 were 1:20-1:80. IL-2/G1 fusion gene could be transferred in Vero cells and stably express the fusion protein. Specific humeral immune responses in mice can be induced with the recombinant eukaryotic expression vector containing the fusion gene, which lays the foundation for further development of therapeutic HTNV vaccine.     

小鼠CTLA4-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4Fc融合基因（CTLA4-Fc）的真核表达质粒,并检测其在293T细胞中的表达,为后续在小鼠体内研究CTLA4-Fc抗肿瘤作用机制奠定基础。方法 Gene Runner 软件设计并合成互为搭桥、互为模板的CTLA4融合基因引物,利用重叠PCR方法扩增获得CTLA4基因片段,与pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒同时进行双酶切,连接合成CTLA4-Fc融合基因表达质粒;菌落PCR扩增、双酶切以及测序鉴定后,在293T细胞中瞬时转染表达融合基因的质粒,ELISA法检测其在293T细胞内的蛋白表达含量。结果 成功构建CTLA4-Fc融合基因。经菌落PCR和双酶切,琼脂糖电泳检测到CTLA4-Fc片段长度为1 200 bp,CTLA4片段长度为568 bp DNA。将阳性重组克隆菌落挑于液体LB培养基中扩大培养并将菌液送公司测序,测序结果证实DNA序列与GenBank同源性为100%。通过ELISA方法能够检测到CTLA4-Fc质粒在293T细胞中的表达。结论 CTLA4-Fc融合基因正确克隆入pcDNA3.1(+)/Fc (Mouse IgG2a)质粒中,该质粒能够在293T细胞中表达。本研究利用重叠PCR技术扩增获得CTLA4基因序列,能够快速获得目的 基因扩增产物,提高了实验的成功率。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。