NAC-1特异的siRNA增强紫杉醇诱导的人卵巢癌细胞凋亡

目的: 探讨 NAC-1 (nucleus accumbens-1)基因特异的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)联合紫杉醇诱导人卵巢癌HO8910细胞凋亡的协同作用及其可能机制。方法: 测定不同浓度 NAC-1 基因特异的siRNA与紫杉醇单用或者合用对HO8910细胞增殖与凋亡的作用,设立阴性siRNA对照和空白对照。以实时荧光定量RT-PCR 检测NAC-1 mRNA表达水平、Western印迹法检测NAC-1蛋白、表皮生长因子受体(EGFR)下游信号磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK),以MTT法检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡。结果: 单用 NAC-1 基因特异的siRNA作用48 h能抑制HO8910细胞NAC-1 mRNA和蛋白的表达,分别下调71.2%和80.5%,细胞周期被阻滞于G₁期,p-Akt和p-ERK蛋白水平分别下降43.7%和49.8%;作用72 h细胞增殖被抑制45.6%,与转染阴性siRNA 及未转染组比较,差异显著(P<0.05)。 NAC-1 siRNA(0.5 μmol/L)与紫杉醇(2 μmol/L)联合作用于卵巢癌HO8910细胞72 h细胞凋亡率为(30.93±4.57)%,显著高于单用紫杉醇时的细胞凋亡率[(23.85±3.65)%],P<0.05。结论: 靶向抑制 NAC-1 基因表达能显著抑制卵巢癌HO8910细胞增殖,增强其对紫杉醇的敏感性,这与部分抑制EGFR下游信号途径有关。     

MR1 siRNA抑制人肝癌细胞BEL-7402的增殖

目的 研究MR1基因对肝癌细胞增殖的影响及机制。 方法 化学合成MR1 siRNA,用脂质体lipofectamine 2000转染肝癌细胞系BEL-7402细胞,RT-PCR检测MR1 siRNA基因沉默效果。用SRB法、集落形成法和生长曲线法检测MR1 siRNA对BEL-7402细胞增殖的影响。流式细胞术检测BEL-7402细胞周期,用细胞同步化的方法,即与G2期阻滞药物噻氨酯哒唑（nocodazole）联合应用,以间接反映MR1 siRNA对肿瘤细胞周期的影响。Western blot法检测Cyclin D1蛋白。结果（1）300nmol/L MR1 siRNA处理BEL-7402细胞24h后,MR1基因的mRNA水平明显降低。（2）经siRNA处理后,BEL-7402细胞存活细胞数明显下降,细胞生长速度明显减慢,集落形成率显著下降,Cyclin D1表达水平明显降低。（3）MR1 siRNA与nocodazole联合处理BEL-7402细胞后,G2期细胞比例显著减少,而G1期细胞明显增多。结论 MR1基因与人肝癌BEL-7402细胞增殖相关,抑制MR1表达,能够引起细胞的增殖抑制,其作用机制与诱导细胞的G1期阻滞有关。     

下调Notch1信号抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y的增殖能力

 目的 探讨Notch1基因与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖能力的关系。方法 应用?-分泌酶抑制剂DAPT或表达Notch1-shRNA慢病毒载体阻断SH-SY5Y细胞Notch1信号的活化,RT-PCR和Western blot法行Notch1及Hes1表达水平的检测,MTT法和裸鼠体内种植检测瘤细胞体内外增殖能力的变化。结果 DAPT处理和表达Notch1-shRNA慢病毒载体转染均能减少细胞内NICD和Hes1表达,其细胞体外增殖能力受到明显抑制(P<0.01),Notch1RNAi细胞体内种植瘤重为0.20±0.13g,明显轻于对照组的0.89±0.58g（P<0.01)。结论 Notch1信号的活化与人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖能力密切相关,有望成为神经母细胞瘤基因治疗的潜在靶点。     

MicroRNA在建立DJ-1基因敲减细胞模型中的应用

 目的 与传统的siRNA方法建立基因敲减模型不同,探讨合成microRNA(miRNA)在DJ-1基因敲减细胞模型中的应用。方法 构建针对DJ-1基因的合成miRNA载体,合成DJ-1基因的siRNA干扰片断。在脂质体介导下,将上述两种小干扰RNA载体或片断分别转染MN9D细胞系,应用real-time PCR和Western blots检测目的基因DJ-1的mRNA和蛋白表达。结果 与Control组相比,转染合成microRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调90%（p<0.05）,蛋白水平下调70%~85%(p<0.05);而转染siRNA的MN9D细胞中,DJ-1的mRNA水平下调50%~70%（p<0.05）,蛋白水平下调20%~50%（p<0.05）。结论 microRNA与siRNA均可作为基因敲减的重要研究手段。与传统的siRNA相比,合成microRNA对目的DJ-1的干扰效率更为显著。     

COX-2参与戊地昔抑制Lewis肿瘤生长

目的探讨戊地昔布对Lew is肿瘤的抑制作用及与抑制环氧化酶-2(COX-2)是否有关。方法用W estern b lot检测COX-2的表达,用ELISA检测前列腺素E2(PGE2),用HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞的浸润。结果戊地昔布可抑制肿瘤生长,提高荷瘤小鼠的生存率;戊地昔布对COX-2表达没有明显影响,但降低肿瘤部位PGE2的含量;戊地昔布增加肿瘤组织淋巴细胞浸润,不影响荷瘤小鼠胃肠道上皮细胞结构以及出、凝血时间。结论戊地昔布可抑制Lew is肿瘤的生长,与抑制肿瘤组织COX-2的活性,降低PGE2含量有关。     

卵巢癌ES-2、SK-OV3和JHOS-3细胞系TSLC1基因启动子区甲基化状态与表达

TSLC1(tumor suppressor in lung cancer 1,TSLC1)属肿瘤抑制基因,研究发现,恶性肿瘤中存在TSLC1基因表达降低或缺失,并且与肿瘤侵袭转移密切相关[1];并且TSLC1基因表达缺失多与启动子甲基化状态相关[2].卵巢癌是女性常见生殖系统肿瘤,较早发生侵袭和转移,严重威胁妇女的健康.本研究旨在探讨TSLC1基因在卵巢癌细胞系中CPG位点的甲基化状态及该基因的表达情况,为寻找卵巢癌基因治疗的靶点提供理论依据.     

黄连素抑制人卵巢癌SKOV3细胞增殖并诱导凋亡

黄连素(berberine)对多种肿瘤有抑制增殖和诱导凋亡的作用[1-2],但在卵巢癌中的作用尚未见报道.本研究以人卵巢癌SKOV3细胞为研究对象,观察黄连素对SKOV3细胞增殖抑制作用及凋亡诱导效应.     

抑制Coronin-1基因表达的siRNA载体的构建和筛选

目的:构建和筛选能高效、特异性抑制Coronin-1基因表达的siRNA表达载体。方法:提取鼠巨噬细胞总RNA,RT-PCR扩增Coronin-1基因目标序列,克隆入pSEB-HUS真核表达质粒,构建pSEB-HUS-C重组质粒。将设计、合成的3条siRNA及阴性对照分别克隆入pSEB-HUS-C,构建重组pSEB-HUS-C1、pSEB-HUS-C2、pSEB-HUS-C3及pSEB-HUS-CN质粒。将干涉质粒瞬时转染A549细胞,通过绿色荧光信号观察、实时定量PCR和Western blot法检测其对Coro-nin-1基因表达的影响。结果:经双酶切及测序证实,所构建siRNA表达载体目的基因大小、序列与预期相符。经瞬时转染A549细胞后,其中的pSEB-HUS-C3能明显抑制Coronin-1 mRNA的表达和Coronin-1蛋白的合成,抑制率分别是75.9%和75.1%。结论:成功构建并筛选出高效、特异性抑制Coro-nin-1表达的siRNA表达载体,为进一步研究Coronin-1在巨噬细胞中的作用奠定基础。     

下调DPT基因通过调节CyclinD1抑制食道癌细胞的增殖

目的观察皮肤桥蛋白(Dermatopontin, DPT)对食道癌细胞增殖能力的影响。方法应用基因沉默技术在食道癌细胞Eca-109中下调DPT基因的表达,通过Western blot实验与免疫荧光实验评价24h、48h、72h基因沉默效率;应用克隆形成实验及MTT实验,检测下调DPT基因对食道癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞周期;通过Western blot实验检测CyclinD1蛋白的表达变化。结果抑制DPT基因可以下调人食道癌细胞的克隆形成与细胞增殖能力,沉默DPT基因引起食道癌细胞G 0/G1期阻滞, CyclinD1蛋白表达下调。结论 DPT参与食道癌的发病机制,是食道癌治疗的新靶点。     

转录因子Sp1抑制K562细胞红系分化

 目的 研究转录因子Sp1在K562细胞诱导向红系分化过程中的表达变化,并确定其对于红系分化及珠蛋白表达的影响。方法 用定量PCR及Western blot的方法确定Sp1在红系分化过程中的表达情况。通过RNAi的方法抑制Sp1的表达,并通过联苯胺染色确定K562细胞中血红蛋白的表达情况,同时定量PCR的方法分析红系分化相关基因的表达,流式细胞技术检测红系分化过程中表面标志蛋白的表达情况。结果 在hemin诱导的K562细胞以及促红细胞生成素EPO诱导的造血干细胞向红系分化过程中,Sp1的mRNA及蛋白水平均呈明显下降,提示其可能负调节红系分化过程。在K562细胞中抑制Sp1的表达则可明显提高K562细胞中的血红蛋白含量,促进γ-,ε-珠蛋白,CD71,CD235a基因的表达,同时CD71,CD235a阳性细胞比例明显增加。结论 以上结果说明转录因子Sp1负调节红系分化过程,抑制Sp1的表达可提高K562细胞中珠蛋白的表达,并促进K562细胞向红系分化。     

notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响

目的：探讨notch1基因对人胶质瘤U251细胞增殖和周期的影响。方法: 体外构建notch1-shRNA和pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体,采用RT-PCR和Western blotting方法行notch1沉默和高表达notch1胞内段的效果检测,MTT法和PI单染流式细胞术分析notch1对细胞增殖和细胞周期的影响。结果：notch1-shRNA慢病毒表达载体能有效下调notch1表达,而pNL-NICD/EGFP慢病毒表达载体能有效增加NICD的表达。notch1基因表达下调的细胞其细胞增殖能力受到明显抑制(P<0.01),并引起细胞G1期阻滞(P<0.01), S期减少(P<0.01);在NICD表达增加的细胞其增殖能力明显增强(P<0.01),且引起细胞G1期减少(P<0.05),S期增加(P<0.01)。结论: notch1基因与人胶质瘤U251细胞的增殖能力和周期密切相关,有望成为治疗胶质瘤的靶点。     

siRNA干扰铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因表达的研究

目的 探讨RNA干扰技术对铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因表达及有关功能的影响.方法 设计并合成4条小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)(siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4)序列,构建干扰RNA( short hair pin RNA,shRNA)表达载体,将带有siRNA质粒电转入PAO1和临床耐药株PAO3.应用E-test方法检测PAO1和PAO3抗生素MIC的变化.用半定量RT-PCR和定量PCR方法检测mexB的表达变化.结果 经酶切鉴定siRNA表达载体构建成功,并明显提高PAO和临床耐药株PAO3对抗生素的敏感性.RT-PCR结果显示干扰后的PAO1和临床耐药株PAO3 mexB基因表达明显下降(P＜0.05).结论 siRNA成功干扰MexA-MexB-OprM外排泵mexB基因的表达,提高铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性,为临床上治疗铜绿假单胞菌感染,降低其耐药性提供了新的思路.     

survivin的siRNA靶向干扰膀胱癌的实验研究

目的实验研究靶向转染survivin的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对膀胱癌生物学行为的影响。方法设计1对survivin编码基因序列特异的siRNA，用脂质体转染T24膀胱癌细胞株。采用流式细胞术检测转染效率和细胞凋亡；荧光实时定量PCR检测干扰前后survivin的mRNA表达；用survivin的siRNA片段插入空载体后建立重组载体pRNAT-U6、1／Neo-survivin。结果脂质体转染T24细胞后的转染效率为92．3％；survivin编码基因序列特异的siRNA能有效下调survivin基因的表达，呈时间和剂量依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时survivin表达水平下调了75．91％，并显著地抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P〈0．01）；细胞凋亡率亦增至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P〈0．01）。用限制性内切酶将空载体线性化，T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中，对该重组表达载体进行鉴定，获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-survivin。结论siRNA．survivin能显著下调膀胱癌细胞survivin基因表达水平，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，可能成为膀胱癌基因治疗的新工具。成功构建的靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体为进一步应用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。     

RON基因在膀胱癌组织中的表达及对T24细胞增殖的影响

目的探讨RON基因对T24细胞增殖与迁移的影响。方法收集膀胱癌组织标本,通过RT-q PCR检测RON在膀胱癌组织中的表达,其次用siRNA技术干扰T24细胞RON,用RT-q PCR、Western blot检测干扰效果,CCK-8、Transwell实验及流式细胞术分别检测细胞的增殖、迁移及细胞凋亡。结果膀胱癌组织中RON表达与TNM分期呈正相关(P0.05)。在T24细胞的RON-siRNA组,细胞增殖能力减弱(P0.05),迁移与侵袭能力降低(P0.05),凋亡细胞数增加(P0.05),同时P-ERK蛋白表达减少,但Total-ERK表达不变。结论 RON基因促进膀胱癌细胞的增殖与迁移,有望成为膀胱癌治疗的新靶点。     

RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。     

Ikaros的3种亚型对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

目的:探讨Ikaros的3种亚型对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响。方法:利用逆转录病毒转染人卵巢癌SKOV3细胞,分别表达Ikaros的3种亚型(IK1、IK2和IK6);采用CCK-8法分析表达不同亚型后SKOV3细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期的改变;Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果:CCK-8结果显示IK1和IK2能明显抑制SKOV3细胞的增殖;细胞周期结果表明IK1和IK2能诱导SKOV3细胞发生G1期阻滞,IK6则对SKOV3细胞的增殖能力和细胞周期则无明显影响;Western blot检测结果显示,IK1和IK2明显降低cyclin D1和cyclin D2蛋白的表达水平,同时升高p21蛋白的表达水平。IK6则对SKOV3细胞的cyclin D1、cyclin D2及p21蛋白表达水平无明显改变。结论:IK1和IK2这2种亚型能明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,其机制可能是由于IK1和IK2能降低细胞周期促进蛋白cyclin D1和cyclin D2的表达及增加细胞周期抑制蛋白p21的表达,从而诱导细胞周期发生G1期阻滞。而IK6亚型对SKOV3细胞增殖能力及细胞周期无明显影响。     

小分子干扰RNA对新生鼠肺成纤维细胞转化生长因子β1的干预效果及意义

目的 探讨转化生长因子β1(TGF-β1)小分子干扰RNA(siRNA)体外转染新牛鼠肺成纤维细胞的干预效果,研究TGF-β1 siRNA的最佳干预剂量及维持时间. 方法 首先采用化学合成TGF-β1 siRNA对新生鼠肺成纤维细胞进行干预,通过实时定量PCR检测技术筛选出有效干扰片段;然后构建TGF-β1 siRNA腺病毒载体,体外转染新生鼠肺成纤维细胞,半定量PCR检测体外转染后TGF-β1基因的抑制效果,确定其最佳干预剂量及维持时间. 结果 (1)化学合成siRNA抑制TGF-β1基因表达的效果:siRNA剂量为20 pmol,转染后24 h检测抑制效果,第2、3、4条siRNA均有不同效果,其中第3条siRNA抑制效率>70%;(2)TGF-β1 siRNA腺病毒载体转染细胞,观察20、50μl不同剂量转染后24 h抑制情况,并与20μl阴性和空白对照比较,结果显示20、50μl均有明显抑制效果;观察转染后24、48、72 h的抑制效果,比较显示转染后24 h有明显抑制效果,72 h抑制效果最强,说明随着转染时间延长,抑制作用越明显. 结论 TGF-β1 siRNA腺病毒载体体外转染新生鼠肺成纤维细胞对TGF-β1的表达均有明显抑制效果.     

COL1A1敲除抑制卵巢癌细胞 ES-2增殖

目的:探讨Ⅰ型胶原α1链(collagen type I alpha 1 chain,COL1A1)基因缺失是否抑制卵巢癌细胞的增殖。方法:构建COL1A1基因敲除的载体PX459-COL1A1,转染人卵巢癌ES-2细胞并用嘌呤霉素筛选,获得COL1A1敲除的ES-2细胞。用基因组测序方法检测COL1A1基因的编辑;细胞增殖、集落形成和细胞迁移实验检测COL1A1缺失对卵巢癌细胞增殖、集落形成及迁移的影响;细胞周期和细胞凋亡实验检测COL1A1缺失对卵巢癌细胞周期和凋亡的影响。裸鼠荷瘤模型体内实验研究COL1A1基因敲除对卵巢癌细胞增殖的影响。结果:Western blot和DNA测序结果显示CRISPR/Cas9方法可以编辑ES-2细胞的COL1A1基因,从而抑制COL1A1蛋白表达。COL1A1缺失显著抑制细胞增殖、软琼脂集落形成能力和细胞迁移(P<0.01)。此外,COL1A1缺失将卵巢癌细胞阻滞于G₂期(P<0.01),并促进细胞凋亡(P<0.01)。分子机制研究表明COL1A1缺失可以明显抑制成骨细胞特异性转录因子osterix和基质金...     

Increased insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) expression in small cell lung cancer and the effect of inhibition of IGF1R expression by RNAi on growth of human small cell lung cancer NCI-H446 cell

Abstract

Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) is a tyrosine kinase receptor implicated in tumourigenesis that may be an attractive target for anti-cancer treatment. In this study, the expression and clinical significance of IGF1R were investigated in serum and lung cancer tissues from small cell lung cancinoma (SCLC). We also compared the effect of IGF1R up-regulation and IGF1R inhibition on viability and apoptosis of NCI-H446 cells. We found the concentration of IGF1R in blood serum was significantly increased and positive IGF1R protein in cancer tissue was more prevalent in SCLC. A statistically significant correlation among IGF1R-positve tumors, lymph node metastasis and local invasion was discussed. Furthermore, IGF1R overexpression lead to an increase of cell survival and suppressed cell apoptosis, IGF1R silencing mediated by RNAi abrogate this response of NCI-H446 cells. Our results further demonstrated that the effects of these treatments may be assigned to the effective inhibition of lung cancer cells from Akt/P27^Kip1 pathway in IGF-1R signaling. These features may have important implications for future anti-IGF1R therapeutic approaches.