SELDI技术分析体外培养不同肝细胞株差异蛋白的表达

目的: 运用表面增强激光解吸/离子化/飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS) 技术,检测体外培养的肝癌细胞株(HepG2),转染乙肝病毒的肝癌细胞株(HepG2.2.15)与正常肝细胞株(LO2)蛋白质的差异表达,筛选肝细胞癌的标志蛋白,为进一步研究肝癌发病的蛋白质组学机制奠定基础. 方法: 常规培养上述3种细胞,细胞状态良好时收集细胞,裂解细胞后采用 SELDI-TOF-MS技术用WCX2芯片检测HepG2, HepG2.2.15, LO2细胞内蛋白质组学的差异表达. 结果: WCX2芯片共捕获91个蛋白,在Mr 5000～15 000区段,与正常肝细胞株比较,有7个蛋白质在两种肝癌细胞中出现明显变化,其中2个蛋白在肝癌细胞中表达量增高,5个蛋白在肝癌细胞中表达量降低;另外两种肝癌细胞株也有其各自的标志蛋白,9个蛋白分子在HepG2表达量增高,10个蛋白分子在HepG2.2.15表达量增高. 结论: SELDI蛋白芯片技术检测可作为检测肝癌早期生物标记的方法,它简便,敏感性高,重复性好,本文发现的这些组织特异性蛋白生物标记对肝癌的早期诊断有潜在的应用价值,对我们从血清或组织标本中筛选和鉴定不同型别肝癌细胞之间的标志蛋白有重要意义,从而为从蛋白质水平研究肝癌的发病机制及新的治疗靶位的寻找奠定了一定的基础.     

SELDI飞行质谱技术检测结直肠癌患者血清肿瘤转移相关蛋白

结直肠癌的淋巴结转移和远处转移是决定患者预后的主要原因,早期结直肠癌的5年生存率明显优于中晚期患者.目前对大肠癌侵袭转移的分子机制仍不清楚.     

激光捕获显微切割联合SELDI蛋白质芯片筛选肺腺癌早期诊断标志蛋白

目的 探讨应用激光显微切割(LCM)联合表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱蛋白质芯片(SEL,DI-TOF-MS)及模式识别分类技术-支持向量机(SVM)筛选肺腺癌标志蛋白的可行性.方法 将6例新鲜肺腺癌组织标本及其配对的4例正常肺组织制备8μm厚度冰冻切片,改良HE染色;用LCM技术选择性获取同质腺癌细胞和配对正常肺组织细胞.应用PBSⅡ+型SELDI-TOF-MS分析仪(IMAC芯片)分析腺癌及其配对正常细胞的蛋白质表达谱,比对差异点;应用SVM筛选并验证候选标志蛋白的判别效能.结果 平均每个LCM帽子的激光点数约4000 shots,获得了同质性>95%的肿瘤细胞和正常细胞.比较腺癌和配对正常细胞之间的SELDI谱图,共筛选出84个蛋白峰.将差异最明显的10个蛋白峰作为候选标志蛋白.和正常组织相比,6种蛋白在腺癌中呈低表达,4种蛋白在腺癌中呈高表达.差异有统计学意义(P<0.05).初步筛选出3191 m/z蛋白峰作为腺癌诊断标志蛋白.结论 LCM联合SEIDI蛋白质芯片技术有可能筛选出敏感性高、特异性强的肺腺癌标志蛋白;该技术将为肺腺癌早期诊断研究提供新的强有力的工具.     

采用血清蛋白指纹图谱技术筛选食管鳞状细胞癌特异相关性蛋白的研究

目的应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术检测食管鳞状细胞癌患者血清蛋白指纹图谱,筛选候选肿瘤标志物并建立诊断模型,初步探讨所建的诊断模型在食管鳞癌诊断中的临床意义。方法144例经手术后病理证实的食管鳞状细胞癌患者和50例健康人血清,用SELDI—TOF—MS检测各血清标本获得血清蛋白指纹图谱。用Biomarker Wizard筛选差异峰。扩大样本量,采用SPSS12．0中ROC曲线分析入选差异峰用于食管癌诊断的灵敏度和特异性。结果在分子量1500～30000范围内,共检测到93个蛋白峰,其中10个差异峰有统计学意义（P〈0．01）。ROC曲线面积超过08的有2768、2745、3403、6638、5972、6440、3321和3978m/z差异峰。当差异峰3403m／z以3．0为临界值时,其敏感性和特异性分别为87．5％和94．0％;3978m/z以2．0为临界值时,其敏感性和特异性分别为8417％和72．0％。其诊断价值均超过CA724、CEA和CA242单独或联合检测。结论3978和3403m/z两个蛋白对区分食管鳞癌患者和健康人群具有较好的诊断价值。     

血清蛋白指纹图谱筛选食管鳞癌特异相关性蛋白与临床病理因素关系分析

目的应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术检测食管鳞状细胞癌患者血清蛋白指纹图谱,分析特异相关性蛋白与临床病理因素的关系。方法 144例经手术后病理证实的食管鳞状细胞癌患者,用弱阳离子交换芯片(WCX2)检测各血清标本获得血清蛋白指纹图谱,用Biomarker Wizard筛选差异峰;比较不同年龄、临床分期、淋巴结转移及食管外膜侵犯各组差异有统计学意义的蛋白峰。结果年龄40～60岁(77例)和>60岁(67例)患者表达的蛋白差异峰差异无统计学意义(>0.05)。28例I期与51例III期患者比较发现10个差异峰差异有统计学意义(<0.05);28例I期与6例IV期患者比较发现1个差异峰差异有统计学意义(<0.05)。而28例I期与59例II期患者比较,未发现差异峰差异有统计学意义(>0.05)。69例淋巴结转移和75例无淋巴结转移患者比较,发现5个差异峰差异有统计学意义(<0.05)。53例无外膜浸润和91例有外膜浸润患者比较,发现有9个差异峰差异有统计学意义(<0.05)。结论应用SELDI-TOF-MS技术检测分析食管鳞状细胞癌患者血清蛋白指纹图谱,对个体化治疗、预后判断有一定的预测提示作用。     

蕨麻对大鼠缺血心肌的保护作用及其血清差异蛋白表达的影响

【目的】研究蕨麻乙醇提取物对大鼠结扎冠状动脉所致急性心肌缺血损伤的保护作用及其差异蛋白质表达谱的影响。【方法】选取雄性SD大鼠随机分为手术对照组,模型组,盐酸地尔硫卓组(diltiazem,30 mg/kg),蕨麻乙醇提取物7.2、3.6、1.8 g/kg干预组。连续灌胃10 d后,结扎在体大鼠冠状动脉致急性心肌缺血损伤模型。缺血时间持续30 min。记录各处理组动物心电图,左心室收缩压LVSP,左心室舒张末期压LVEDP及左室内压最大变化速率(±dp/dt max);取血清检测乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)含量;用强阴离子交换芯片(SAX-2)及弱阳离子交换芯片(WCX-2)结合表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术分析大鼠急性心肌缺血损伤后不同处理组血清中蛋白质表达谱的改变。【结果】冠状动脉结扎致心肌缺血后,心电图ST段出现抬高,蕨麻醇提物7.2和3.6 g/kg组显著抑制了急性心肌缺血损伤导致的大鼠心电图ST段升高(P<0.05)。蕨麻醇提物各剂量组的各项心功能指标[左心室收缩压LVSP,左心室舒张末期压LVEDP及±dp/dt均优于模型组(P<0.05)]。心肌缺血后,血清中LDH和CK含量显著升高,蕨麻醇提物各剂量组血清中LDH和CK均显著降低(P<0.05)。蛋白质芯片结果显示:WCX-2芯片共获得338个血清蛋白质峰;SAX-2芯片共获得348个血清蛋白质峰。缺血30 min,模型组质/荷(M/Z)比为4 972 Da的蛋白质相对含量明显高于对照组(P<0.01),蕨麻干预后,该蛋白质峰随药物浓度升高而降低,至高剂量组时降至对照组水平,呈现出明显的剂量依赖关系,提示4 972Da蛋白质可能是蕨麻抗心肌缺血损伤的药物作用靶点之一,有待进一步研究证实。【结论】蕨麻乙醇提取物能够显著保护急性心肌缺血所致心肌损伤,改善心脏功能。不同剂量蕨麻干预后,心肌损伤后异常表达的蛋白质(4 972 Da)剂量依赖性下降。     

表面增强激光解吸/离子化蛋白质芯片技术在肝细胞癌早期诊断研究中的应用

随着蛋白质组学研究技术的飞速发展,集样品分离、纯化、检测和数据分析为一体的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱蛋白质芯片技术已成为蛋白质组学研究的有力工具,它可以快速、简便地直接检测各种体液及分泌物,具有标本用量少、高通量分析等特点,并在筛选、鉴定肿瘤标志物及临床疾病的诊断、防治方面发挥了重要作用。本文介绍了该技术的特点和分析步骤,以及该技术在肝细胞癌早期诊断中的应用情况,并对其前景进行展望。     

SELDI—TOF MS技术筛选传染类疾病诊断标志物的研究

表面增强激光解吸电离-飞行时间质谱（SELDI-TOF MS）蛋白质芯片技术是一种基于质谱的高通量分析技术,通常只需要极少的样品就可以进行。目前被广泛应用于传染类疾病的血清和组织蛋白标志物的筛选。蛋白标志物能用于诊断感染、预测疾病状态和病程。精心的实验设计、样品处理和保存,以及选择合理的对照和参数是运用此项技术成功的关键。     

SELDI蛋白质芯片技术检测膝骨性关节炎患者黏附关节液中蛋白质的差异改变

目的运用表面增强激光解吸附离子化飞行时间质谱（SELDI—TOF—MS）技术检测膝骨性关节炎患者关节液中蛋白质的差异改变，寻找骨性关节炎特异的生物标志，以期用于骨性关节炎的早期诊断。方法使用WCX2芯片，SELDI-TOF—MS技术检测20例膝骨性关节炎患者和8例正常对照关节液中蛋白质谱的改变。结果膝骨性关节炎患者与正常人比较，关节液中的蛋白质存在差异表达，共有6个蛋白表达水平发生变化，其中5754Da和15522Da蛋白峰仅在患者中表达，在正常人中不表达，13412．3Da蛋白符合Cys—tatin-c。结论SELDI蛋白芯片技术可以检测关节液标本，检测膝骨性关节炎患者关节液蛋白质的差异表达敏感性高，从而为骨性关节炎的早期诊断提供了一种新的方法。     

应用SELDI-TOF-MS筛选矽肺模型大鼠的血清生物标志物及建立血清蛋白指纹分类决策树

【目的】应用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry,SELDI-TOF-MS)技术寻找染矽尘大鼠血清潜在生物标志物,探索建立染矽尘大鼠血清蛋白指纹分类决策树。【方法】128只雄性Wistar大鼠随机分为对照组和染矽尘模型组,以气管暴露法建立矽肺模型,分别在7、14、28和60 d进行腹主动脉采血。采用SELDI-TOF-MS技术以CM10芯片检测大鼠的血清蛋白指纹图谱,用Ciphergen公司专有软件分析数据并建立血清蛋白指纹分类诊断决策树。【结果】与对照组相比,14 d时,m/z 4968.66多肽分子在染矽尘大鼠模型组显著升高(P<0.05);而m/z 9312.29和m/z 9511.19多肽分子分别在28、60 d时显著升高(P<0.05),并均与Ⅰ型胶原增加呈显著正相关(r=0.982,P=0.018;r=0.939,P=0.061);以28、60 d的对照组和染矽尘大鼠组为训练样本,血清蛋白指纹诊断决策树图分类敏感性和特异性分别达100%、83.33%。【结论】m/z 4 968.66多肽分子可作为矽尘所致早期炎症反应的生物标记物,m/z 9312.29、m/z 9511.19多肽分子可能是矽尘所致进行性肺间质纤维化的标志分子。在矽尘暴露28、60d时,血清蛋白指纹分类诊断树的敏感性和特异性分别达100%、83.33%。     

蛋白激酶C在人绒毛膜癌JAR细胞中作用的研究

目的：研究蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)对人绒毛膜癌JAR细胞分泌人绒毛膜促性腺激素(hCG)的影响，进一步探讨PKC在调控JAR细胞hCG分泌中的作用。方法：不同浓度的PKC激动剂phorbol 12—myristrate l3—acetate(PMA)急性和慢性刺激、PKC抑制剂chelerythrine chlorine(CHEL)分别作用JAR细胞，用ELASA法测定hCG分泌量变化，以及蛋白印迹(Western blot)法测定细胞内磷酸化丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的改变。结果：不同浓度PMA急性刺激时，抑制JAR细胞hCG分泌，在200nmol/L时，其抑制作用最强；不同浓度PMA慢性刺激时，JAR细胞hCG分泌量增加，在200nmol／L时，其作用最强。CHEL作用JAR细胞时，hCG分泌量升高，在600nmol/L时，其作用最强。对照组及各实验组都有活性的MAPK的表达，与对照组相比，PMA慢性刺激组、CHEL组MAPK磷酸化水平升高;PMA急性刺激组MAPK磷酸化水平降低。结论：PKC参与调节JAR细胞hCG的分泌，活性升高时，下调MAPK磷酸化，使JAR细胞hCG分泌减少，而活性降低时，增强MAPK磷酸化，JAR细胞hCG分泌量增加。MAPK通路激活是PKC介导的JAR细胞分泌hCG的重要机制。     

应用激光解吸电离飞行时间质谱技术筛选无精子症患者精浆差异蛋白

目的：用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）分析无精子症和正常人精浆蛋白指纹图谱的变化，建立能鉴别无精子症和正常人精浆标志物的诊断模型。方法：收集33例无精子症和31例正常人的精浆，用H50（疏水芯片）蛋白质芯片和SELDI-TOF-MS检测蛋白质质谱的表达。用Biomarker Patterns Software分析软件进行数据处理，建立区分无精子症和正常人精浆中蛋白质谱差异表达模型。结果：在分子量2000～20000范围内，共检测到78个有差异的蛋白峰，其中12个差异有显著性（P〈0.01），建立了由3个差异蛋白组成的无精子症诊断模型，其诊断灵敏度为96．9％（32／33），特异性为96．7％（30／31）。结论：用SELDI-TOF-MS技术初步建立的区分无精子症和正常人的精浆蛋白差异表达模型可以区别无精子症和正常人，可能为无精子症的诊断提供新的手段。     

SELDI-TOF-MS检测正常肾细胞株与肾癌细胞株的差异表达蛋白

目的分析体外培养的正常肾细胞株和肾癌细胞株的蛋白质表达差异。方法运用表面增强激光解吸离子化蛋白质芯片（SELDI-TOF-Ms）技术检测常规体外培养的正常肾细胞株（HK-2）和肾癌细胞株（786-0）。2种细胞株均用IMAC3（固定金属亲和）和WCX2（弱阳离子交换）2种芯片检测。采用PBSIIC型蛋白质芯片阅读机读取数据，Ciphegenproteinchip3．1软件采集数据，BiomarkerWizard软件分析2种细胞株的蛋白差异。结果SELDI-TOF-MS技术检测发现体外培养的肾癌细胞株与正常肾细胞株的蛋白质存在差异表达，共有15个蛋白质水平发生变化。IMAC3芯片发现差异峰6个，WCX2芯片发现差异峰9个。结论肾癌细胞株与正常肾细胞株之间的蛋白质谱有差异蛋白表达。     

槲皮素诱导耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300凋亡

 【目的】 研究槲皮素对耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞株U2-OS/MTX300的增殖抑制和诱导凋亡作用及相关机制。【方法】 以不同浓度槲皮素及甲氨蝶呤处理U2-OS及U2-OS/MTX300。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法及平板克隆检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,Hochest 33258 染色及流式细胞仪检测凋亡,Western blot法检测凋亡相关蛋白cleaved-PARP,Bax,Bak,Bcl-2及Bcl-XL表达。【结果】 槲皮素可明显抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞U2-OS/MTX300的增殖,72 h IC50值为(22 ± 4)μmol/L、10、25、50μmol/L可显著抑制U2-OS/MTX300克隆形成数量,且随剂量增加抑制作用明显增强。槲皮素与甲氨蝶呤之间不存在交叉耐药性。槲皮素能诱导U2-OS/MTX300细胞S期阻滞,并可诱导胞内产生典型凋亡小体,流式细胞仪可检测到明显凋亡。其作用机制是通过上调Bax,Bak及下调Bcl-2表达,促进cytochrome C释放及诱发PARP等重要胞内蛋白断裂来实现。【结论】 槲皮素可显著抑制耐甲氨蝶呤骨肉瘤细胞系U2-OS/MTX300细胞增殖并诱导其凋亡,线粒体途径可能是其诱导凋亡的重要机制。     

马鞭草提取液C部位对人绒毛膜癌JAR细胞增殖的影响

目的：探讨马鞭草(Verbena officinalis)提取液C部位对人绒毛膜癌JAR细胞增殖的影响。方法：通过相差显微镜观察活细胞贴壁程度、细胞形态改变；MTT法测定不同浓度C部位在不同时段对JAR细胞的增殖抑制率，结果用方差分析进行统计学检验：流式细胞仪检测细胞阻滞周期。结果：马鞭草C部位可引起细胞数目减少并萎缩；细胞增殖抑制率随着时间的延长和浓度的增加逐渐增大．72h的40mg／ml剂量组抑制最明显，抑制率为65％；流式细胞仪检测结果显示阻滞周期在GJM期之间。结论：马鞭草提取液C部位对人绒毛膜癌JAR细胞增殖有明显抑制作用，其作用机制有待进一步探索。     

SELDI蛋白质芯片技术在肺癌早期诊断中的研究进展

随着人类基因组计划的完成,分子医学的研究领域已转移到蛋白质组学研究。蛋白质组学为发现肿瘤诊断标志物及可能的新型治疗靶分子提供了可能,肿瘤发生早期的蛋白质变化有可能成为临床早期诊断指标。表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术是一种操作简单、敏感性高、特异性强的高通量蛋白组学方法,是基于蛋白质芯片和质谱技术联用的多种肿瘤标志物筛选的分析平台。现主要对SELDI蛋白质芯片技术在肺癌早期诊断中的应用研究现状予以简要综述。     

蛋白芯片技术筛选急性髓性白血病血清标志蛋白质

目的:利用蛋白质芯片和生物信息学方法从急性髓性白血病患者血清中筛选标志蛋白质。方法:采用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术(surfaced enhanced laser desorption/ion ization tim e of flightm ass spectros-copy)和弱阳离子交换(WCX2)蛋白质芯片对30例急性髓性白血病患者血清和57例健康人血清的蛋白质谱图进行了检测,使用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据,获得的结果采用c iphergen公司的B iom arker w izard和B io-m arker Patterns System软件分析。结果:急性髓性白血病患者与正常人血清蛋白质谱相比有8个显著差异蛋白质,其中1个蛋白质在患者血清中高表达,7个蛋白质在患者血清中低表达。B iom arker Patterns System软件用8个显著差异蛋白质中的7个标志分子建立急性髓性白血病诊断的分类树模型。检测灵敏度为86.7%(26/30)、特异性为96.5%(55/57)。结论:实验证明利用蛋白质组学和生物信息学方法可以从血清中筛选出急性髓性白血病相关的标志蛋白质,而且蛋白质芯片技术对于发现和筛选血清中的急性髓性白血病标志蛋白质是一种有效、快速的工具。     

稳定表达EGFR-GFP融合蛋白细胞系的建立

目的:建立稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系。方法:CaC l2法将pEGFR-EGFP质粒转化DH5α,酶切鉴定后提取质粒经电穿孔转染CHO-K1细胞;以EGFP作为荧光报告分子,克隆化培养以获取单克隆阳性细胞;流式细胞术、荧光显微镜术、W estern B lot检测转染细胞EGFR-GFP融合蛋白的表达;比较稳定转染细胞及未转染细胞的生长曲线;反复冻存、复苏、传代鉴定细胞表达EGFR-GFP融合蛋白的稳定性。结果:获得1株稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,命名为CHO-EGFR-GFP1,融合蛋白主要表达于细胞膜。稳定转染细胞和未转染细胞生长特性无显著差异。结论:成功获得膜表面稳定表达EGFR-GFP融合蛋白的细胞系,为研制以EGFR为靶点的抗肿瘤药物以及研究EGFR与其配体间相互作用奠定了基础。     

蛋白质芯片筛选儿童急性淋巴细胞白血病血清标志蛋白质的临床研究

目的 利用蛋白质芯片和生物信息学方法从急性淋巴细胞白血病(ALL)息儿血清中筛选标志蛋白质,为临床提供分子诊断学方法.方法 采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术和弱阳离子交换(WCX2)蛋白质芯片对44例ALL初诊患儿血清和35例健康儿童血清的蛋白质谱图进行检测,使用PBSII-C型蛋白质芯片阅读机读取数据,获得的结果采用Ciphergen公司的Biomarker Wizard和Biomarker Patterns System软件分析.结果 ALL初诊患儿与正常儿童血清蛋白质谱相比有7个显著差异蛋白质(P＜0.00001),其中3个蛋白质在患儿血清中高表达,4个蛋白质低表达.Biomarker Patterns system软件用上述标志分子建立儿童ALL诊断的分类树模型,检测灵敏度为88.6%(39/44).特异性为82.9%(29/35).结论 实验证明利用蛋白质组学和生物信息学方法可以从血清中筛选出儿童ALL相关的标志蛋白质.而且蛋白质芯片技术对于发现和筛选血清中的ALL标志蛋白质是一种有效、快速的工具.     

紫草素逆转绒癌细胞JAR/MTX耐药与survivin和Bcl-2表达关系研究

目的 探讨紫草素逆转绒癌细胞耐药效应在凋亡方面的机制.方法 体外培养细胞并将其分为4组,各组加药后观察每组细胞24、48、72 h生长情况并计算细胞贴壁率,电化学发光法检测β-HCG值,S-P免疫组织化学及RT-PCR法检测survivin、Bcl-2基因表达.结果 MTX对细胞JAR/MTX毒性作用、细胞贴壁率、β-HCG下降程度与对照相比差异无统计学意义(P＞0.05);紫草素作用细胞后与对照相比差异有统计学意义(P＜0.05);二者合用作用于JAR/MTX细胞与对照相比差异显著(P＜0.01),survivin基因的mRNA和蛋白表达与对照相比差异显著(P＜0.01),Bcl-2基因的mRNA表达与对照相比差异显著(P＜0.01),蛋白表达与对照相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 紫草素可逆转JAR/MTX细胞对MTX耐药是通过下调survivin、Bcl-2基因表达增加细胞凋亡实现的;紫草素有可能成为绒癌化疗的新型增敏剂.