人胃癌细胞株MGC-803 FHIT基因转染对阿霉素敏感性的影响

目的：将FHIT基因导入该基因表达缺失的人胃癌细胞株MGC-803,探讨胃癌中FHIT基因表达对阿霉素（ADM）敏感性的影响。方法：将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pRcCMV-FHIT用脂质体介导转入FHIT蛋白表达缺失的胃癌细胞株MGC-803,筛选阳性克隆,同时以空载体pRcCMV转染的胃癌细胞及未转染的胃癌细胞株作为对照,以ADM作用于三组细胞,用MTT法测定细胞的生长抑制率,用流式细胞仪检测ADM处理前后各组胃癌细胞的凋亡率及细胞周期的变化。结果：经ADM处理后,转染FHIT基因的MGC-803细胞的凋亡水平（40.66%）与空质粒转染组（13.94%）及胃癌细胞株组（15.81%）相比明显增高（P＜0.01）,并且FHIT基因与ADM有轻度的协同促进凋亡作用（P＜0.05）;同时ADM处理前后实验组胃癌细胞的生长周期较对照组均出现了明显的G0/G1期阻滞（74.43% vs 56.30%,99.27% vs 95.10%）,且细胞的生长抑制率存在浓度和时间依赖性。结论：外源性FHIT基因表达与ADM协同促进MGC-803细胞凋亡及细胞周期阻滞,FHIT基因可增加胃癌细胞对ADM的敏感性。     

外源性FHIT基因表达对胃癌细胞株MGC-803凋亡作用的影响

目的 :探讨外源性 FHIT基因的表达对胃癌细胞株凋亡作用的影响。方法 :将载有人外源性 FHIT基因的真核表达质粒 p Rc CMV- FHIT用脂质体介导转入胃癌细胞株 MGC- 80 3,用流式细胞仪、普通光镜、透射电镜观察 FHIT基因的表达对 MGC- 80 3细胞凋亡的影响。结果 :转染 FHIT基因的 MGC- 80 3细胞的凋亡水平 (32 % )与空质粒转染组 (12 .15 % )相比明显增高 ,且存在显著性差异 (P<0 .0 1) ,同时细胞的生长周期出现了明显的 G0 /G1期阻滞 (6 4.375 % vs 4 9.5 % )。结论 :外源性 FHIT基因能诱导胃癌细胞株 MGC- 80 3凋亡 ,细胞生长周期阻滞。     

FHIT基因转染对肝癌细胞系HepG2的作用

目的:探讨外源性FHIT基因的表达对肝癌细胞株HepG2的影响. 方法:用脂质体介导法将pcDNA3.1-FHIT及空载体pcDNA3.1( )导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化和Western blotting鉴定其过表达. 用流式细胞仪、普通光镜、透射电镜观察FHIT基因的表达对HepG2细胞凋亡和增殖的影响. 结果:获得FHIT基因稳定表达的肝癌细胞株HepG2-FHIT. 转染FHIT基因的HepG2细胞的生长速率明显下降,电镜下超微结构发生了凋亡早期改变,流式分析细胞的生长周期可见S/G2期阻滞. 结论:外源性FHIT基因在体外通过诱导其凋亡及细胞周期俘获作用可有效抑制HepG2生长增殖.     

稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株。方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养。RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为MGC-803/Cdx2细胞（转染组）和MGC-803/EV细胞（空载体组）;流式细胞仪检测MGC-803细胞（未转染组）、MGC-803/EV细胞和MGC-803/Cdx2细胞的细胞周期和凋亡情况。结果 成功筛选出稳定过表达Cdx2基因的MGC-803胃癌细胞,即MGC-803/Cdx2细胞;与MGC-803细胞和MGC-803/EV细胞比较,MGC-803/Cdx2细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达明显增加（P<0.05）,而且细胞周期G0/G1期比例和凋亡率也明显增加（P<0.05）。结论 成功构建了稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株,而且Cdx2过表达使细胞周期停滞、凋亡增加。     

转录因子E2F-1过表达抑制胃癌细胞MGC-803的增殖

目的 了解E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖、生长和细胞周期的影响。方法 PCR扩增E2F-1基因片段;然后经限制性内切酶 EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后将E2F-1定向克隆到真核表达载体pCMV-HA2中转化筛选。用脂质体Lipofectamine2000将该载体转染MGC-803胃癌细胞,然后用含G418的培养基筛选获得具Genectin抗性的过表达E2F-1的胃癌细胞株。RT-PCR和Western blotting技术检测MGC-803/E2F-1细胞内E2F-1表达情况。对稳定转染E2F-1的胃癌MGC-803/E2F-1细胞(实验组)、转染空载体的MGC-803/EV(阴性对照组)及未转染的MGC-803细胞进行MTT法检测,绘制生长曲线和计算细胞增殖率;流式细胞仪检测各组细胞周期分布。结果 RT-PCR和Western blotting 实验证实重组载体pCMV-E2F-1-HA2成功转入胃癌细胞内,并稳定过表达E2F-1。MTT法检测发现,与MGC-803/EV细胞组和MGC-803细胞组相比,胃癌MGC-803/E2F-1细胞的生长受到明显抑制,增殖率下降(26.61±5.19)% vs （93.4±10.29）%、（100±0.00）%,均P <0.01);细胞周期分析显示MGC-803/E2F-1组的细胞在G0/G1期所占比例为70.63%,高于MGC-803/EV组（60.03%,P<0.01）和MGC-803细胞组（60.43%,P<0.01）;MGC-803/E2F-1组的细胞在S期所占比例为(11.27%),明显低于MGC-803/EV组（28.70%,P<0.01）和MGC-803细胞组（29.70,P<0.01）。结论 E2F-1基因过表达抑制胃癌细胞的增殖和生长,细胞周期停滞在G0/G1期。     

shRNA-FHIT对胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响

目的  构建靶向抑制脆性组氨酸三联体（FHIT）基因的短发夹双链RNA（shRNA）真核表达质粒,观察FHIT抑制后对胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响。方法  构建FHIT基因特异性的小RNA干扰质粒PGPU6/GFP/Neo-shRNA1、PGPU6/GFP/Neo-shRNA2,利用脂质体LipofactamineTM2000转染胃癌细胞BGC-823,实验分为未转染组、阴性对照组（转染PGPU6/GFP/Neo-shNC组）及PGPU6/GFP/Neo-shRNA1转染组和PGPU6/GFP/Neo-shRNA2转染组,G418筛选得到稳定表达株,Real-time PCR检测在mRNA水平干扰质粒对FHIT的抑制效应,MTT法、流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果  与阴性对照组相比,转染shRNA-FHIT重组质粒的BGC-823细胞FHITmRNA表达明显下降(P＜0.05)。与未转染组和阴性对照组相比,转染干扰质粒组细胞增殖活性增强,凋亡率减低、生长周期出现S期和G2/M期的比例上调（均P＜0.05）。结论  成功将重组shRNA-FHIT表达载体转染BGC-823细胞,并筛选出稳定低表达FHIT的细胞。shRNA-FHIT可以促进胃癌细胞增殖、降低凋亡率,并削弱G0/G1期阻滞,为进一步研究FHIT基因在肿瘤中的作用机制奠定了实验基础     

稳定过表达Cdx2基因胃癌细胞株的建立

目的 建立稳定过表达Cdx2基因的胃癌细胞株.方法 使用阳离子脂质体分别将真核表达载体pCMV-Cdx2-HA或空载体pCMV-HA转染至人胃癌细胞MGC-803中,G418筛选出阳性克隆后扩大培养.RT-PCR和Western Blot技术检测各组胃癌细胞中Cdx2基因mRNA和蛋白的表达情况,将挑选出的稳定株命名为...     

FHIT基因表达对多西紫杉醇诱导胃癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性FHIT基因的表达对多西紫杉醇（DOC）诱导人胃癌细胞株(MGC 803)凋亡的影响及其分子机制。方法用脂质体将包含有外源性FHIT基因的重组真核表达质粒转染胃癌细胞MGC 803,获得稳定表达重组质粒pRcCMV FHIT的细胞株（已由山东大学附属省立医院中心实验室成功构建）,Western blot法检测外源性FHIT蛋白的表达;采用MTT法检测不同浓度（1.0、5.0、10.0、20.0、40.0?mg/L）及不同时间（24、48、72?h）下多西紫杉醇对MGC 803细胞的抑制率并选择最佳浓度和作用时间;采用流式细胞术检测FHIT转染和DOC单独及联合作用后的细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法检测干预前后cleaved Caspase3的蛋白表达。结果获得稳定表达FHIT基因的胃癌细胞株;DOC对MGC 803细胞具有抑制作用,且浓度为20?mg/L、时间为48?h时最明显;DOC+pRcCMV FHIT组细胞的凋亡水平（65.54%）较阴性对照组（3.27%）、pRcCMV组（3.55%）、pRcCMV FHIT组（13.94%）、DOC组（44.13%）、DOC+pRcCMV（45.29%）组明显增高,且差异具有统计学意义（P＜0.05）;DOC+ pRcCMV FHIT组细胞的cleaved Caspase3蛋白表达较其它各组明显增强。结论FHIT基因表达与DOC能够协同促进胃癌细胞的凋亡,这可能与二者能够协同上调Caspase 3蛋白表达相关。     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的 探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响. 方法 通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87.实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、 U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞).Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化. 结果 U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用.     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响。方法通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87。实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞)。Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用。     

FHIT基因转染对人结肠癌细胞系SW480增殖和侵袭力的影响

目的 探讨真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT对结肠癌细胞株SW480增殖和侵袭活性的影响。方法 将携有FHIT基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-FHIT体外转染SW480细胞（SW480-FHIT）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞（SW480-pRc/CMV2）和正常SW480细胞为对照,用RT-PCR检测FHIT的表达情况,并用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和细胞侵袭实验分别检测FHIT基因转染前、后SW480细胞增殖和侵袭活性的变化。结果 pRc/CMV2-FHIT的酶切鉴定证实含有目的基因FHIT;SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;MTT实验结果显示重组质粒转染组SW480细胞的增殖明显受到抑制;Transwell体外侵袭实验显示转染pRc/CMV2-FHIT能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力(P<0.01)。结论 应用基因转染技术重表达FHIT基因能有效抑制细胞的生长、增殖及侵袭活性,为以FHIT为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

最小努力(惰性)原则与慢性病预防行为选择

目的:探讨长链非编码RNA MEG3在胃癌组织及细胞系中的表达水平,以及过表达MEG3对胃癌细胞增殖能力的影响,并探索其可能的作用机制?方法:用定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测胃癌组织及细胞系中MEG3的表达水平;通过转染pcDNA-MEG3上调MEG3的表达水平,并通过qRT-PCR检测转染效率?用MTT和克隆形成试验检测上调MEG3的水平对BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力的影响,Western blot检测这两种细胞中上调MEG3的水平对p53蛋白的表达水平的影响?结果:相比正常胃组织及细胞,在胃癌组织和细胞中MEG3的表达出现显著下调,SGC7901?MGC-803和BGC-823细胞中MEG3的表达水平分别是正常胃上皮细胞GES-1中的73.6%?42.0%和27.1%(P < 0.05)?BGC-823细胞和MGC-803细胞中转染pcDNA-MEG3能显著上调MEG3的表达,MEG3的表达水平分别为对照组的252倍和311倍(P < 0.05);MTT和克隆形成试验显示,上调MEG3的表达能降低BGC-823细胞和MGC-803细胞的增殖能力?Western blot实验显示,转染了pcDNA-MEG3的MGC-803和BGC-823细胞中p53的表达相较对照组中显著增加?结论:胃癌组织及细胞中MEG3的表达下调,且这可能通过抑制p53蛋白的激活从而促进胃癌细胞增殖,影响胃癌的发生和发展?     

沉默PHLDA1基因表达抑制胃癌细胞增殖

目的: 明确普列克底物蛋白同源样结构域家族A成员1蛋白(PHLDA1)在各胃癌细胞系中的表达,探讨其对胃癌细胞生物学特性的影响。方法: 先采用蛋白质印迹和qRT-PCR法检测MGC-803、BGC-823、MKN45、SGC-7901和HGC-27共5种胃癌细胞系中PHLDA1蛋白和mRNA的表达;再将MGC-803细胞分为对照组(转染乱序RNA)和干扰组(转染靶向干扰PHLDA1的siRNA),蛋白质印迹法检测2组细胞中PHLDA1蛋白的表达;CCK8实验检测细胞增殖率;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;蛋白质印迹检测各组细胞中Bax、Caspase-8、Cleaved-caspase-8、Caspase-3、Cleaved-caspase-3、Caspase-9和Cleaved-caspase-9凋亡相关蛋白的表达。结果： PHLDA1在5种胃癌细胞中呈不同程度高表达,在MGC-803细胞中表达量最高;与对照组比较,干扰组PHLDA1表达量显著降低(P＜0.01),细胞增殖率明显减慢,克隆形成数显著减少、单个克隆的细胞数明显减少(P均＜0.05),Cleaved-caspase-8、Cleaved-caspase-3、Caspase-9和Cleaved-caspase-9蛋白表达明显升高(P均＜0.05）。 结论： PHLDA1在胃癌细胞系中呈高表达,沉默其表达可抑制胃癌细胞增殖。     

FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附的影响

目的探讨FHIT基因过表达对人胃癌细胞系MKN-45增殖和粘附能力的影响。方法将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1-FHIT转染FHIT基因mRNA阴性表达人胃癌细胞系MKN-45,分别用MTT法、平板克隆形成实验、黏附实验检测转染前后细胞增殖活性、克隆形成能力及粘附能力的变化。结果FHIT基因的过表达可降低MKN-45细胞的增殖和克隆形成能力(P<0.05),但是对MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。结论FHIT基因过表达可抑制人胃癌细胞系MKN-45的增殖和克隆形成,对于MKN-45细胞与内皮细胞的粘附能力无明显影响。