电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞的影响

背景：课题组早期研究表明体外一定剂量酸性成纤维细胞生长因子对骨骼肌卫星细胞增殖有促进作用。目的：进一步验证电穿孔转染酸性成纤维细胞生长因子基因对骨骼肌卫星细胞生长、增殖及分化的影响。方法：原代培养、纯化骨骼肌卫星细胞,将带有酸性成纤维细胞生长因子基因的质粒pSectag-GFP-aFGF通过电转染的方法转染大鼠骨骼肌卫星细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况并计算转染率,以流式细胞仪分析转染后细胞周期,绘制细胞生长曲线,观察转染后肌管形成情况,Western Bloting检测酸性成纤维细胞生长因子基因的表达。结果与结论：①免疫细胞化学检测：骨骼肌肌动蛋白呈阳性表达。②转染效率：pSectag-aFGF 质粒电转染12 h后即可看见散在发绿色荧光的卫星细胞,72-96 h达高峰,阳性表达率约90%。③细胞周期检测：电转染后S期所占的百分比明显多于未转染对照组(P <0.05)。④细胞生长曲线检测：电转染细胞接种后第3天进入对数生长期,第5天后开始减少。⑤分化能力观察：电转染组肌管较未转染对照组明显减少,老化细胞较少。⑥Western-blot：酸性成纤维细胞生长因子基因在转染骨骼肌卫星细胞中表达。结果表明,通过电穿孔法可以将酸性成纤维细胞生长因子基因转染进骨骼肌卫星细胞并获得高效持久的表达,并有促进骨骼肌卫星细胞增殖及抑制分化为肌管的作用。     

一种新的离体培养大鼠海马神经元基因转染技术

目的:探讨一种新的离体培养大鼠海马神经元基因转染方法。方法:选用17d的胚胎SD大鼠,取海马组织分离成细胞悬液,离心去上清并用混有2μg CAG-RE质粒的电转液重悬,置Neucleofector电转染仪中,选用O-03程序进行电转染,后用基础神经元培养液稀释并接种于培养皿中,4h后,待细胞贴壁时换新的神经元维持培养液,继续培养,选择不同时间点在荧光显微镜下观察,并计算在转染后4d时神经元的转染效率。结果:电转染24h后可以观察到有绿色荧光蛋白表达的转染神经元,荧光可以持续表达到2周,转染效率可达60%～80%,神经元生长良好,神经突起显示清楚。结论:电穿孔基因转染技术可以作为离体培养海马神经元很好的基因导入方法。     

骨骼肌卫星细胞的培养鉴定及生物学特性

目的 :探讨骨骼肌卫星细胞体外培养、鉴定的方法及其生物学特性。方法 :采用 型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞 ,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态 ,通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力 ,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果 :二步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取。在生长培养基作用下 ,细胞增殖旺盛 ;在分化培养基条件下 ,细胞分化良好 ,可融合成肌管。 α sarcometric actin和 m yosin免疫细胞化学染色 ,骨骼肌卫星细胞呈弱阳性 ,肌管呈强阳性。结论 :体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力 ,适用于组织工程和基因治疗     

绿色荧光蛋白标记的报告系统优化K562细胞转染条件的研究

本研究旨在提高基因转染人红白血病细胞株K562的转染效率，同时观察绿色荧光蛋白（GFP）作为报告系统用于转染条件优化的可行性。目的基因以GFP为报告系统，通过脂质体转染及电穿孔两种方式转染K562细胞，荧光显微镜下观察并计算转染效率。结果表明：电转染较脂质体转染K562细胞的效率高，电穿孔转染效率在10％左右，而脂质体转染效率小于1％。结论：电转染较脂质体转染K562细胞的效率高，GFP可作为报告系统优化K562细胞转染条件。     

骨骼肌卫星细胞的体外培养与生物学特性(英文)

目的:建立理想的骨骼肌卫星细胞体外培养方法,探讨其生物学特性,以达到应用于组织工程和基因治疗的目的。方法:采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态,通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:二步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取。在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。α-sarcometric肌动蛋白和肌球蛋白细胞免疫化学染色,骨骼肌卫星细胞弱阳性,肌管强阳性。结论:体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,适用于组织工程和基因治疗。     

骨骼肌卫星细胞的体外培养与生物学特性

目的：建立理想的骨骼肌卫星细胞体外培养方法，探讨其生物学特性、以达到应用于组织工程和基因治疗的目的：方法：采用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶二步消化法获取大鼠骨骼肌卫星细胞，进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态，通过生长曲线、细胞融合率研究骨骼肌卫星细胞的增殖与分化能力，利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果：二步消化法适用于骨骼肌卫星细胞的获取。在生长培养基作用下，细胞增殖旺盛；在分化培养基条件下，细胞分化良好，可融合成肌管。α-sarcometric肌动蛋白和肌球蛋白细胞免疫化学染色，骨骼肌卫星细胞弱阳性，肌管强阳性。结论：体外培养的骨骼肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力，适用于组织工程和基因治疗。     

促红细胞生成素与鼠骨骼肌卫星细胞的增殖及分化

背景：骨骼肌卫星细胞心肌移植过程中，一些重要环节仍无法很好的解决，其中就包括骨骼肌卫星细胞移植后的死亡问题。促红细胞生成素从生产到临床使用技术都很成熟，具有抗凋亡和减轻炎症反应的作用。目的：探讨促红细胞生成素对鼠骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响，从而为二者联合进行心肌移植的设想提供一些支持依据。设计、时间及地点：细胞生物学行为体外实验，于2006—07／2007-10在暨南大学医学院中心实验室和深圳市人民医院中心实验室完成。材料：清洁级1～3d龄SD乳鼠6只，促红细胞生成素为沈阳三生制药公司产品。方法：改良酶消化法分离培养鼠骨骼肌卫星细胞，传至第3代分别加入含0，10，20，40u／mL促红细胞生成素的DMEM培养基。主要观察指标：倒置显微镜下观察骨骼肌卫星细胞分化能力，MTT法检测细胞活力，流式细胞仪分析细胞周期。结果：未加入促红细胞生成素组培养5d，局部相邻的骨骼肌卫星细胞可以互相融合成长条状的肌管，随时间延长肌管数量逐渐增多，且能看见肌管跳动；10，20，40u／mL促红细胞生成素组均未见肌管形成，骨骼肌卫星细胞大量堆积在一起。与未加入促红细胞生成素组比较，作用48h，72h时各浓度促红细胞生成素组骨骼肌卫星细胞活力均明显升高（P〈0．05）。随促红细胞生成素浓度的升高，G。期细胞所占百分率逐渐降低，而S＋G2/M期细胞所占百分率逐渐升高。结论：促红细胞生成素呈剂量依赖性提高骨骼肌卫星细胞活力、促进骨骼肌卫星细胞增殖，并抑制其向肌管分化。     

非病毒载体介导脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞:脂质体及电穿孔转染法的比较

背景:基因转染细胞有病毒及非病毒载体法,因病毒载体面临安全性、免疫排斥等问题,实验探讨脂质体及电穿孔转染法.目的:比较脂质体及电穿孔法介导人脑源性神经营养因子基因转染骨髓间允质干细胞的细胞转染特性和体外表达情况,建立基因工程细胞.方法:①脂质体法:取体外分离、培养的第3代豚鼠骨髓间充质干细胞,将质粒-脂质体混合物加入含细胞的培养基中培养6 h,再加入胎牛血清的培养基,孵育48 h后行免疫组织化学检测,即为瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.②电穿孔法:取骨髓间充质干细胞,胰酶消化,用无血清培养基重悬细胞,将细胞悬液加入电转化池中,加入质粒,将电转化池移至电极间放电转导.转染48 h后,检测目的基因瞬时表达.48 h后加入含G418培养基筛选.用免疫组织化学及RT-PCR检测两种方法脑源性神经营养因子基因表达情况.结果与结论:免疫组织化学显示脂质体介导转染的脑源性神经营养因了瞬时表达率约为5.80%,电穿孔法约为24.29%.脂质体法转染筛选14 d后细胞几乎全部死亡;电穿孔法转染后筛选并扩大培养建立工程细胞,免疫组织化学显示工程细胞脑源性神经营养因子阳性表达率达90%以上,RT-PCR扩增产物电泳证实目的基因阳性条带.结果表明,用电穿孔法可成功建立脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞的工程细胞,并用免疫组织化学和RT-PCR办法证实细胞体外表达目的基因.     

大鼠眼外肌成肌细胞的增殖及分化特征

目的:完善眼外肌成肌细胞体外培养、鉴定的方法及观察其生物学特性。方法:实验于2005-02/08在青岛大学医学院附院中心实验室(省级实验室)完成。取出生后3～7d的大鼠,通过大鼠眼外肌细胞的取材、分离、消化、培养等技术,观察细胞的形态、生长曲线、细胞融合率,观察大鼠眼外肌卫星细胞的增殖与分化能力,利用成肌细胞标记物α-横纹肌肌动蛋白、中间丝结蛋白免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:①成肌细胞的生长情况:在生长培养基作用下,细胞增殖旺盛;在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。②成肌细胞融合率:在24h和48h融合率提高明显,72h达高峰,之后不再变化。③细胞免疫化学检测结果:α-横纹肌肌动蛋白和中间丝结蛋白免疫细胞化学染色阳性。结论:体外培养的大鼠眼外肌卫星细胞具有良好的增殖与分化能力,其生物学特征同骨骼肌卫星细胞。     

超声辐照SonoVue增强脂质体介导pEGFP-N1转染乳腺癌细胞

目的 探讨超声辐照SonoVue介导增强型绿色荧光蛋白报告基因质粒(pEGFP-N1)转染乳腺癌MCF-7细胞的最优条件以及超声联合微泡造影剂增强脂质体转染的效果.方法 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞,按照不同的辐照条件分组:不处理组,超声辐照十质粒组,微泡浓效组,超声声张组,辐照时间组及工作周期组.分别进行超声辐照,辐照后以MTT法测细胞存活度,流式细胞仪测pEGFP-N1瞬时转染率,取得最佳的辐照条件.重新准备细胞后先以脂质体转染细胞,2 h后加入超声微泡并以最佳条件辐照,用同样的方法测细胞存活率及转染率.结果 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期(占空比)为超声辐照SonoVue介导pEGFP-N1转染MCF-7细胞的最优条件,转染率为(14.21±2.55)%,细胞存活率为(84.60±2.85)%.在增强脂质体转染的实验中,超声微泡脂质体组的转染率最高(22.15±2.69)%,与其他各组相比差异有统计学意义(P<0.05),此时细胞存活率为(80.13±3.61)%.结论 20%的造影剂浓度、1.5 W/cm2的声强、90 s的辐照时间、20%的工作周期是MCF-7细胞的最佳转染条件,超声联合微泡能够增强脂质体转染的效果.