应用抑制消减杂交克隆支气管哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因

目的 探讨嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制。方法 提取1名哮喘发作病人嗜酸细胞总RNA为实验子，治疗后作为对照的嗜酸细胞的RNA为驱动子。检测子、驱动子的总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA，进而由抑制消减杂交方法获得消减杂交产物。消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库，对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取400个克隆进行PCR扩增，阳性率约为80％。部分阳性克隆经2轮杂交筛选及序列对比后获得6个差异片段，涉及与编码炎症介质、细胞信号传导、能量代谢和细胞凋亡相关的基因。结论 抑制消减杂交技术有效地克隆了支气管哮喘发作期和缓解期嗜酸细胞差异表达的基因，为阐明嗜酸细胞在支气管哮喘发病中的分子机制奠定了良好的基础，并为临床防治支气管哮喘、寻找新的药物和方法提供了依据。     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的：利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因。方法：采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM—TEasyVector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5a,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息。结果：扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4个,ESTs2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个。结论：成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因。     

利用抑制性消减杂交技术筛选大鼠哮喘相关基因

目的:利用哮喘大鼠模型筛选与哮喘发病相关的差异性表达基因.方法:采用抑制性消减杂交技术,以哮喘大鼠肺组织总RNA为检验子,对照大鼠肺组织总RNA为驱赶子,将消减杂交获得的DNA片断与pGEM-T Easy Vector连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆.将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对,获得差异性表达基因的信息.结果:扩增消减cDNA文库获得300余个白色克隆,随即挑选36个测序,除去重复序列,结果中含有已知的基因4 个,ESTs 2个及与任何序列无同源性的新基因片段3个.结论:成功构建了哮喘大鼠肺脏差异性表达基因的正向消减cDNA文库,筛选出数个与哮喘相关的差异表达基因.     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因,为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术,以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象,构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减文库。随机挑取文库克隆进行差异筛选,对所得的差异片段进行测序和同源性分析,利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减文库分别含有235和232个白色克隆,90%以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选。共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因,GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段;5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

应用Super SMART cDNA合成技术扩增哮喘嗜酸性粒细胞总RNA

目的 应用Super SMART cDNA 合成技术从嗜酸细胞微量总RNA扩增大量双链cDNA。方法 利用Percoll密度梯度离心分离哮喘病人血嗜酸性粒细胞,用Trizol试剂盒提取细胞总RNA,利用Super SMART cDNA合成技术合成cDNA第1链及优化扩增第2链。通过梯度电泳鉴定cDNA产品质量,通过对获得的cDNA定量来评估扩增效能。结果 从20 ng总RNA成功扩增出双链cDNA 7.155 μg,电泳结果显示cDNA质量及纯度较高。结论 Super Smart cDNA 合成技术可实现从微量总RNA高效扩增高质量的cDNA,为进一步从基因水平研究哮喘机制奠定了基础。     

HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离和鉴定

目的:建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库,并从中克隆鉴定出新的应答基因.方法:分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA,用SMART PCR技术合成全长双链cDNA,经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组,分别衔接两个不同的接头,再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR,将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,挑取克隆进行筛选排除假阳性,再行序列分析,鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因.结果:成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库,得到158个白色的克隆,随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个,长约100～400 bp,经筛选后得到70个克隆,测序表明有16个差异表达的基因,其中可能的新基因有5个.结论:用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库,为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础,初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据.     

肾阴虚证cDNA文库的构建

目的探讨肾阴虚证的相关基因。方法以辨病与辨证相结合，从糖尿病、慢性肾炎、狼疮性肾病以及亚健康状态等肾阴虚证入手，应用RNA微量扩增、抑制性消减杂交、基因克隆等技术和方法。分别构建肾阴虚证的cDNA子消减文库，再运用核酸分子杂交原理和PCR进一步筛选上述消减文库中的相同部分．以构建肾阴虚证的共同文库，然后将PCR产物与U载体连接，经蓝白斑筛选后，再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒。结果该研究成功地构建了肾阴虚证的cDNA文库，其中正向消减文库共获得625个阳性克隆，反向消减文库获得736个阳性克隆。结论该研究初步构建了肾阴虚证的cDNA文库，为进一步克隆肾阴虚证的相关基因奠定了基础。     

大剂量辐射诱导IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的克隆和鉴定大剂量辐射前后大鼠空肠上皮细胞IEC-6差异表达基因,为探索肠上皮细胞辐射损伤修复的分子机制提供线索.方法IEC-6细胞经35Gyγ射线照射后由抑制性消减杂交(SSH)方法和T/A克隆技术进行差异表达基因消减cDNA文库的构建,用反向Northerm杂交法对库中的EST序列进行筛选,挑取阳性克隆测序,和GenBank比对后挑选有限克隆进行正向Northerm杂交进行验证.结果扩增消减杂交cDNA文库得到约2 000个克隆,随机选取96个白色克隆进行PCR扩增,用反向Northern杂交法对库中的EST片段进行筛选得到15个阳性克隆,代表12个基因的转录产物,部分基因功能已经明确,涉及细胞骨架、细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,另外还获得一新的cDNA序列.结论SSH法建立了IEC-6细胞差异表达基因消减cDNA文库,一次获得多条差异显示EsT片段,基因种类涉及细胞骨架,细胞应激、细胞周期、信号转导等多方面,这些基因可能在肠上皮细胞的辐射损伤反应中起重要作用.     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

应用抑制性消减杂交技术筛选脂肪细胞分化相关基因

目的:利用脂肪分化细胞模型筛选与脂肪细胞分化相关的差异性表达基因。方法:采用抑制性消减杂交技术,以诱导分化后的人前体脂肪细胞系SW872总RNA为Tester,诱导分化前的人前体脂肪细胞系SW872为Driver,将消减杂交获得的DNA片段与pGM-T载体连接,构建cDNA文库后,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆。将获得的阳性克隆插入片段进行测序分析,并与GenBank数据库进行同源性分析,获得差异性表达基因。结果:扩增消减cDNA文库获得135个白色克隆,随机挑选64个进行测序,共获得34个阳性克隆基因。结论:本研究成功构建了脂肪细胞分化差异性表达基因的消减cDNA文库,筛选出了与脂肪细胞分化相关的差异表达基因。     

食管癌消减cDNA文库的构建

目的 :采用消减抑制杂交技术 ,研究正常食管粘膜和食管癌组织之间的基因表达差异状况 ,分离食管癌相关基因片段 ,构建食管癌的消减cDNA文库。方法 :以食管癌癌组织为测试子 (tester) ,以正常食管粘膜组织为驱赶子 (driver) ,用消减抑制杂交方法分离食管癌差异表达片段。将该差异表达片段克隆至T载体 ,经蓝白斑筛选后 ,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒 ,构建食管癌消减cDNA文库。结果 :用消减抑制杂交技术分离食管癌差异表达片段 ,经蓝白斑筛选 ,得到 2 2 0个白色克隆 ;再用PCR方法快速筛选出 10 0个两端分别含连接子Adaptor1及Adaptor2R的阳性重组质粒 10 0个 ,从而成功地构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。结论 :构建了中国人食管癌特异的消减cDNA文库。消减抑制杂交技术能快速有效地分离差异表达基因 ,方法简便、灵敏度高。使用PCR法快速筛选阳性克隆 ,对于消减文库的构建具有重要意义     

抑制消减杂交技术筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段

目的筛选肺炎链球菌多耐药相关DNA片段,探索肺炎链球菌多耐药的分子机制。方法提取多耐药菌株09062407与标准菌株ATCC49619基因组DNA,应用抑制性消减杂交技术得到富含差异DNA片段的消减混合物,与pEASY-T3克隆载体连接并转化到TP10感受态细胞中,构建多耐药肺炎链球菌差异DNA消减文库。结果耐药株与敏感株间差异片段大量富集,得到大小200～1 500 bp弥散状DNA条带;将这些差异DNA片段富集后构建成消减文库,随机挑取192个白色克隆,经PCR扩增,155个克隆插入有200～800 bp大小片段。结论抑制消减杂交技术能有效筛选肺炎链球菌多耐药株与敏感株间差异DNA片段,可进一步通过克隆鉴定等生物信息学方法寻找与肺炎链球菌多耐药相关基因。     

慢性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建

目的:采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建汉族人慢性肾炎(CGN)肾阴虚证cDNA消减文库。方法:选择汉族人CGN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交。采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阴虚证消减文库。结果:用SSH方法筛选出了CGN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了386个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阴虚证的cDNA消减文库。结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阴虚证相关基因奠定了基础。     

正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选

目的 筛选大鼠经正加速度(Gosiliveacceleration， Gz)重复暴露后脑的差异表达基因，探讨 Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术，构建高消减效率的 Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库；用差异筛选技术筛选阳性克隆；用序列分析确定阳性克隆的性质；用RT—PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆；经差异筛选后，选取其中10个阳性克隆，序列分析表明，7个克隆与已知基因高度同源，3个为新的候选基因。RT—PCR证实了差异表达基因在 Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的3个新的cDNA可能在 Gz脑损伤的病理过程中起重要作用。     

采用消减杂交初步筛选先兆子痫病理相关基因

目的 应用抑制性消减杂交、PCR技术，克隆出与先兆子痫有关的高表达基因和(或)新基因。方法 分别从正常妊娠分娩胎盘和先兆子痫患者分娩胎盘中提取mRNA，采用抑制性消减杂交、PCR技术，构建先兆子痫胎盘cDNA文库，采用反向杂交验证，测序分析；以初步筛选的差异表达基因为探针，与先兆子痫和正常胎盘总体mRNA斑点杂交。结果 构建成功具有高消减效率的与先兆子痫相关cDNA消减文库，文库扩增后得到60个阳性克隆，经杂交验证，有34个阳性克隆有插入片断，随机挑取一阳性克隆菌落，测序分析发现该差异表达基因为核蛋白多糖基因，以该差异表达基因为探针，与先兆子痫和正常胎盘总体mRNA斑点杂交，观察其在总体胎盘中的表达。结论 人类先兆子痫胎盘基因表达同正常胎盘相比，核蛋白多糖呈差异表达基因，该基因差异表达可能与先兆子痫的发病有关．