大鼠成骨细胞微小RNAs的筛选研究

目的应用微小RNAs（microRNAs,miRNAs）芯片技术筛选补肾方含药血清干预大鼠成骨细胞后差异表达的miRNAs,与前期获得的软骨细胞差异miRNAs比较,筛选出共有差异miRNAs,以探讨补肾方通过共有miRNAs调控靶基因表达发挥治疗效应的机制。方法原代培养的大鼠成骨细胞经碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色和矿化结节染色鉴定后,用补肾方含药血清干预成骨细胞,在给定时间点收获细胞,抽提纯化总RNAs行miRNAs芯片检测,并挑选差异表达4倍以上的miRNAs行实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应验证。结果所培养的原代细胞具有典型的成骨细胞形态和功能,碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色和矿化结节染色均为阳性。与补肾方含药血清干预成骨细胞1 d相比,干预6 d的共有229个2倍以上表达差异的miRNAs,其中上调的52个、下调的177个。差异表达4倍以上的miRNAs实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应结果与芯片数据一致。与前期软骨细胞差异miRNAs芯片数据比较,miRNAs均上调2倍以上的有8个、下调4倍以上的2个。结论补肾方含药血清干预成骨细胞获得了一套较为特异的miRNAs,初步预测上调的miRNAs可能通过靶向Runx2、Wnt、Notch、Axin2等基因在骨发育、骨形态发生、骨吸收以及软骨内成骨形成等相关的信号通路中发挥作用。     

模拟失重下氧化应激对EA.hy926细胞miRNA表达谱的影响及生物信息学分析

目的探索模拟失重条件下EA.hy926细胞氧化应激后microRNAs(miRNAs)表达谱的变化及生物学意义。方法 EA.hy926细胞分为对照组(Con组)、对照氧化应激组(Con+H2O2)、模拟失重组(MG组)和模拟失重后氧化应激组(MG+H2O2),采用Illumina HiSeq 2500平台开展miRNAs测序并筛选差异表达miRNAs。筛选出的miRNAs以qRT-PCR进行验证,对验证具有显著差异表达的miRNAs进行靶基因预测、靶基因Gene Ontology(GO)功能富集分析、KEGG信号通路分析以及STRING蛋白互作分析。结果模拟失重下氧化应激导致EA.hy926细胞内miRNAs表达谱发生改变。qRT-PCR结果显示,与Con+H2O2组相比,MG+H2O2组细胞内hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-200c-3p表达增加,与miRNA测序结果一致。GO及KEGG通路显著性富集分析结果显示,hsa-miR-29b-3p靶基因显著富集于细胞外基质等生物学过程及局部黏附信号通路,hsa-miR-200c-3p靶基因显著富集于调控细胞代谢过程等生物学过程及miRNA癌症通路等信号通路。蛋白互作分析结果表明,hsa-miR-29b-3p靶基因中COL家族蛋白处于互作关键位置,hsa-miR-200c-3p靶基因中RHOA处于互作关键位置。结论模拟失重下氧化应激可导致EA.hy926细胞miRNAs表达出现显著差异,其中hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-200c-3p可通过对靶基因及其信号通路调节对内皮细胞功能发挥调控作用。     

超声造影定量分析对移植肾排斥反应的诊断价值

目的：通过超声造影成像技术定量分析移植肾术后急性和慢性排斥反应血流灌注参数的特征,为临床快速评估移植肾排斥反应的预后提供参考价值。资料与方法31例行同种异体肾移植患者依据临床症状及移植肾穿刺结果分为移植肾正常组6例、急性排斥组12例和慢性排斥组13例,应用超声造影成像检查移植肾的血流灌注情况。结果超声造影显示无排斥反应患者移植肾实质造影剂增强均匀,而有排斥反应患者移植肾实质增强不均匀;3组移植肾造影剂曲线下面积差异有统计学意义（F=37.102, P<0.01）,移植肾正常组达峰强度显著高于急性排斥组（P<0.01）,但与慢性排斥组无显著差异。急性排斥组和慢性排斥组叶间动脉、皮质和髓质的造影剂起始时间、叶间动脉和皮质的造影剂达峰时间均晚于移植肾正常组（P<0.05）,急性排斥组和慢性排斥组段间动脉、叶间动脉和皮质的绝对强度、叶间动脉和皮质的上升斜率均显著小于移植肾正常组（P<0.05）。结论超声造影能较好地评价移植肾的微循环状态,可以为预测肾移植术后急性和慢性排斥反应提供重要的参考价值。     

移植肾组织Fas配体和T细胞内抗原-1表达水平的定量分析

目的研究移植肾组织Fas配体（FasL）和T细胞内抗原-I（TIA-1）的定量检测及临床意义。方法取移植肾组织32例、对照标本10例,采用竞争性RT-PCR技术分别检测FasL和TIA-1的表达,结果以靶基因／β-actin的比值表示,并与根据Banff标准进行的病理学诊断比较分析。结果将标本分为急性排斥（14例）、慢性排斥（15例）和无排斥改变（13例）三组,其FasL表达例数分别为8例、3例和0例,TIA-1表达例数分别为14例、10例和3例。急性排斥组FasL和TIA-1水平明显高于慢性排斥组（P〈0．05）和无排斥组（P〈0．05）,而慢性排斥组与无排斥组比较无显著性差异（P〉0．05）;急性排斥组FasL和TIA-1的表达水平与组织损害的严重程度呈正相关。结论FasL和TIA-1的异常表达在靶细胞凋亡中具有一定作用,其定量检测可能有助于移植肾急性排斥的早期诊断。     

慢性移植排斥反应诱导的小鼠肾炎发生因素的初步探讨

目的探究慢性移植排斥反应诱导小鼠肾炎的发生机制,为下一步药物治疗提供实验依据。方法建立DBA/2→B6D2F1（DBA/2J×C57BL/6）移植小鼠模型,通过尿蛋白检测以及组织病理学分析确定小鼠肾炎的发生;利用直接免疫荧光标记技术以及实时定量PCR分析慢性移植排斥反应诱导小鼠肾炎发生过程中T、B淋巴细胞的活化情况,以及靶组织器官中各种因子或蛋白的变化。结果与同系基因型移植对照组（B6D2F1→B6D2F1）小鼠相比,异体移植实验组（DBA/2→B6D2F1）小鼠脾细胞中CD4＋CD69＋、CD8＋CD69＋双阳性细胞百分比均明显增加,B220＋I-Ab＋双阳性细胞的I-Ab表达显著增强,提示T、B淋巴细胞的活化;另外,在实验组小鼠肾组织中,趋化因子如单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、受激活调节正常T细胞表达和分泌因子（RANTES）、B淋巴细胞趋化因子（BLC）以及淋巴细胞趋化因子（Ltn）表达上升;炎性细胞因子（如IL-6、IL-1β）表达显著增强;促纤维生长因子如转化生长因子β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）以及纤维增生相关蛋白如Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ）的mRNA表达水平明显上升,提示组织炎症以及纤维化的发生。结论慢性移植排斥反应诱导肾炎发生可能与激活淋巴细胞以及炎症因子、趋化因子和促纤维生长因子的分泌表达有关。     

基于循环血miRNAs评估空间铁离子辐射暴露的新方法

目的寻找具有作为空间铁离子辐射生物标志物潜力的循环血microRNAs(miRNAs)分子,并探索基于这些分子的辐射暴露风险评估新方法。方法利用重离子加速器产生的高能铁离子束对小鼠进行全身照射,通过定制miRNA PCR array芯片检测了13种辐射相关的循环血miRNAs表达水平,筛选出4种miRNAs作为候选标志物进行验证。利用实时定量PCR技术检测了候选miRNAs在铁离子束照射下的剂量效应和时间效应关系。此外,利用多元线性回归的方法建立了结合4种辐射敏感miRNAs预测辐射暴露程度的数学模型,并通过受试者工作特征曲线对模型准确性进行了评估。结果铁离子束照射后,循环血中miR-21a、miR-200b表达水平上调,miR-574、miR-342表达水平下调,且具有较强的剂量效应关系,在6～72h内,其表达差异能稳定维持。结合4种候选miRNAs建立的多元线性回归方程在预测不同程度的辐射暴露方面具有很好的特异性和敏感性。结论循环血辐射敏感miRNAs具有作为空间铁离子辐射生物标志物的潜力,而基于这些循环血miRNAs的多元线性回归模型可应用于评估空间辐射暴露风险。     

60Co γ射线照射致小鼠肝脏的miRNAs表达改变

目的 应用miRNA芯片筛选4 Gy60Co γ射线照射后小鼠肝脏中差异表达的miRNAs,生物信息学方法探索差异表达miRNAs调控的主要功能.方法 SPF级C57BL/6J小鼠接受4 Gy60Co γ射线单次全身照射后,进行外周血白细胞计数和骨髓嗜多染红细胞微核计数.应用miRNA芯片筛选照射后小鼠肝脏中差异表达的miRNAs,用miRNA特异引物对部分差异表达miRNA进行实时定量PCR(real time PCR)验证.运用生物信息学方法,对差异miRNAs靶基因及调控功能进行预测.结果 4 Gyγ射线照射后,外周血白细胞总数与对照组相比显著减少(t=2.87,P＜0.05),而骨髓嗜多染红细胞微核率与对照组相比显著增加(t=-2.91,P＜0.05).miRNA芯片结果显示,照射组与对照组差异表达的miRNAs共17个,其中9个表达上调,8个表达下调.miR-124和miR-34a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片结果一致.GO分析发现,与黏附、细胞周期相关的通路被抑制,一些免疫相关通路被激活.结论 miR-34a和miR-194参与了急性辐射损伤的调控,起主要调控作用的miRNAs还有miR-124、miR-382和miR-92a*.

Abstract：

Objective To investigate the differential expression profiles of microRNAs in the liver of 60Co γ-ray irradiated mice using microRNA microarray and to explore their main functions by bioinformatic analysis.Methods After SPF C57BL/6J mice expose to 4 Gy-single whole body radiation,total number of peripheral WBC and the fMNPCE were measured at 3 d.The differentially expressed miRNAs in mouse liver were detected with miRNA microarray,miRNA-124 and miR-34a were confirmed by real time RT-PCR assay.Bioinformatic analysis was applied to explore target genes and the main functions of the differential expressed miRNAs.Results Compared with control group,the total number of peripheral WBC decreased( t = 2.87,P ＜ 0.05 ) ,while the fMNPCE in bone marrow increased ( t =-2.91,P ＜0.05) after 4 Gy γ-ray irradiation.miRNA microarray revealed that 17 miRNAs were differentially expressed,in which 9 up-regulated,8 down-regulated.The expression levels of miR-124 and miR-34a were coincident with the result of real time RT-PCR.GO analysis showed that some pathways including adherens junction and cell cycle were suppressed,while some immune-related pathways were activated.Conclusions miR-34a and miR-194 were involved in the regulation of acute radiation damage,some other miRNAs including miR-124、miR-382 and miR-92a* also played important roles in radiation process.     

两种造模方式对COPD大鼠肺泡巨噬细胞microRNA表达的影响

目的 通过烟熏加气管内注入内毒素法与单纯烟熏法制备大鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型,比较两种造模方式的大鼠肺泡巨噬细胞微小RNA(miRNAs)的表达差异.方法 60只雌性Wistar大鼠随机均分为对照组(Ⅰ组、Ⅱ组)、烟熏加气道内内毒素滴注组(模型Ⅰ组)、单纯烟熏组(模型Ⅱ组),采用肺部CT、肺功能检测和肺组织病理学方法进行模型鉴定.分离肺泡巨噬细胞提取总RNA,行微阵列基因芯片分析,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)验证,比较两种造模方式中大鼠肺泡巨噬细胞miRNAs的表达差异.结果 模型Ⅰ组、Ⅱ组胸部CT、肺功能检测结果和肺组织病理均符合COPD的特征.与对照Ⅰ组相比,模型Ⅰ组肺泡巨噬细胞let-7b-3p、miR-675-5p、miR-376c-3p表达显著下调,未发现有miRNAs显著上调.与对照Ⅱ组比较,模型Ⅱ组let-7b-3p、miR-675-5p表达显著下调,miR-200b-3p、miR-665、miR-344b-1-3p、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-99b-5p、miR-129-1-3p、miR-3557-5p、miR-331-5p、miR-493-5p、miR-200a-3p共11种miRNAs表达显著上调.结论 两种方法均造模成功,但其肺泡巨噬细胞miRNAs表达差异显著.单纯烟熏后miRNAs表达变化趋势与人类肺泡巨噬细胞miRNAs表达变化趋势相近,进行COPD肺泡巨噬细胞相关炎症机制研究时推荐选择单纯烟熏模型.     

整合素连接激酶在抗体介导的慢性排斥反应患者肾组织中的表达及意义

目的研究移植肾组织中整合素连接激酶（ILK）及Ⅳ型胶原、转化生长因子β1（TGF-β1）表达和抗体介导的慢性排斥反应的关系。方法 用免疫组织化学技术和计算机真彩色图像分析系统半定量检测46例抗体介导的慢性排斥反应（Chronic active antibody-mediated rejection,ABMR）患者移植肾组织中ILK、Ⅳ型胶原和TGF-β1的表达情况,分析3者间及与ABMR的间质纤维化与肾小管萎缩（IF/TA）的病理分级之间的关系。15例正常肾组织作为对照。结果 ABMR移植肾组织中ILK、Ⅳ型胶原、TGF-β1的表达比正常肾组织明显增加（P〈0.001）,并随ABMR中IF/TA病理分级呈逐渐递增的趋势。移植肾组织中ILK的表达与TGF-β1、Ⅳ型胶原呈正相关（r分别为0.830、0.707,P〈0.001）。结论 ILK可能是介导TGF-β1促进移植肾间质纤维化细胞外基质（extracellular matrix,ECM）异常沉积的发病机制,Ⅳ型胶原的异常沉积是ABMR中IF/TA患者移植肾纤维化的重要表现。转化生长因子β1已经证明了与移植肾纤维化显著的相关性,ILK在抗体介导的排斥反应的移植肾纤维化进程中起重要作用。     

乙型肝炎病毒基因组转染HepG2细胞的microRNA表达研究

目的 检测乙型肝炎病毒(HBV)全基因组转染对人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞中microRNA(miRNA)表达的影响,为进一步探讨肝细胞中HBV复制的分子生物学机制提供平台.方法 分别提取HepG2.2.15细胞(转染HBV全基因组的HepG2细胞,实验组)和其亲本HepG2细胞(对照组)的总RNA并分离miRNA,采用含509条探针的哺乳动物miRNA表达谱芯片对两组之间差异表达的miRNA进行分析.用SAM软件针对差异miRNA筛选的标准为在两组之间荧光强度差异4倍以上,差异miRNA的整体假阳性率为0.选择其中2个miRNA,应用实时荧光定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果 HepG2.2.15细胞与HepG2细胞间差异表达的miRNA共27个(占5.3%),其中7个表达上调,20个表达下调.miR-181d和miR-15a的实时荧光定量RT-PCR验证结果与芯片表达结果基本一致.结论 肝细胞中存在着与HBV复制相关的miRNA,这些上调和下调表达的miRNAs可能参与了HBV在肝细胞中的复制.