小鼠诱导性多能干细胞向牙源性上皮细胞分化的实验研究

目的：探讨小鼠诱导性多能干细胞（iPS, induced pluripotent stem cell）向牙源性上皮细胞分化的可能性和诱导条件，为牙齿再生提供细胞来源。方法：以成釉细胞无血清条件培养液（ASF—CM）为诱导微环境，定向诱导小鼠iPS细胞向牙源性上皮细胞转化，观察培养后形态改变，细胞免疫荧光及RT—PCR检测成釉蛋白（AMBN，ameloblastin）、釉原蛋白（AMGN，amelogenin）、细胞角蛋白14（CKl4，cytokeratin 14）的表达。结果：小鼠iPS细胞在ASF—CM诱导微环境下，成功分化为牙源性上皮样细胞，呈典型的上皮样细胞形态，免疫荧光及RT-PCR结果显示：AMBN、AMGN、CK14表达阳性，对照组表达阴性。结论：ASF-CM提供了适宜的成牙微环境，能够促进小鼠jPS细胞向牙源性上皮细胞分化。     

胚胎干细胞上清液诱导Tca8113细胞发生上皮-间充质转化的实验研究

目的:采用胚胎干细胞培养上清液诱导口腔鳞癌细胞发生上皮-间充质转化,初步探讨其意义.方法:应用129小鼠胚胎干细胞培养上清液诱导培养舌鳞癌Tca8113细胞.分别在1周和2周后,采用免疫荧光和免疫细胞化学检测诱导前、后Tca8113细胞中Oct4、角蛋白(CK)和波形丝蛋白(vimentin)的表达情况.半定量反转录PCR检测snail、slug、E-cadherin和CD44、Bmi-1、hTERT表达随诱导时间的变化情况.结果:Tca8113细胞经条件培养基诱导后,细胞形状逐渐由铺路石样变为长梭形;Oct4集中表达在细胞核中,vimentin转变为阳性表达,CK表达无明显变化;上皮-间充质转化标记snail mRNA表达上调,E-cadherin下调,slug无明显变化.同时,癌干细胞标记CD44、Bmi-1和hTERT mRNA表达上调.结论:口腔鳞癌细胞经胚胎干细胞培养上清液诱导后,可发生上皮-间充质转化,从而可能具备部分干细胞特性.     

Apical bud上皮诱导脂肪间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的研究

目的:通过体外及体内实验探讨大鼠切牙Apical bud上皮细胞诱导大鼠脂肪来源间充质干细胞向成牙本质细胞分化的能力。方法:分离培养大鼠脂肪间充质干细胞、Apical bud上皮细胞,制备Apical bud上皮条件诱导液并体外对ADSCs诱导7d,通过实时定量PCR方法检测成牙本质关键基因DMP-1及DSPP的表达。制备ADSCs及Apical bud上皮重组细胞团进行大鼠肾被膜下移植,8W后取材,分别采用HE染色、Masson三色法和免疫组化方法对移植生成物进行组织学检测。结果:Apical bud上皮诱导ADSCs后DMP-1及DSPP m R NA表达水平显著高于对照组。体内移植8W后H E染色可见管样牙本质和骨样牙本质样结构,Masson三色法可以观察到有绿色的牙本质样结构,免疫组化检测中CK14染色阳性,DSPP染色阳性。结论:Apical bud上皮细胞在体外能够诱导ADSCs向成牙本质细胞分化,且细胞重组在体内可以构建出牙本质样结构。     

牙胚微环境对皮肤真皮多能干细胞特性的影响

目的:研究皮肤真皮多能干细胞诱导后成牙分化的可行性,以期为组织工程再生牙齿探寻一种可靠的成体干细胞.方法:使用大鼠胚胎期发育牙胚制备条件培养基,诱导皮肤真皮多能干细胞分化,检测诱导后细胞增殖变化、矿化能力以及体外检测基因表达和细胞表型.结果:大鼠胚胎期发育牙胚细胞条件培养基诱导皮肤真皮多能干细胞后,皮肤真皮多能干细胞增殖加快、矿化能力增强,同时,诱导组细胞中可检测到ALP、OCN、BSP mRNA以及DSP和DMP-1mRNA的表达,进一步细胞表型分析显示,诱导组皮肤真皮多能干细胞表达DSP、DMP-1以及ALP阳性.结论:利用发育早期牙胚细胞分泌的信号分子在体外模拟牙胚发育的微环境,使得皮肤真皮多能干细胞实现了向牙源性间充质细胞方向的表型转化.     

人牙髓干细胞体外诱导分化为平滑肌细胞的研究

目的探究人牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSC)向人平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)分化的体外诱导方法。方法体外分离SMC,获取SMC的条件培养液(conditional medium,CM)。通过比较,筛选出SMC体外诱导培养液的最佳配方和浓度。体外诱导DPSC向SMC分化,通过形态学观察以及SMC表面标记物基因和蛋白表达进行检测。结果在含有转换生长因子β-1(transforming growth factorβ-1,TGF-β1)和SMC-CM的SMC体外诱导培养液作用下14 d,DPSC分化为成熟的SMC样细胞。结论 DPSC有潜能分化为成熟的SMC样细胞,为平滑肌组织工程再生种子细胞的选择提供了一种新的、无创伤、无伦理道德问题的细胞来源。     

不同细胞外基质对人胚胎干细胞体外定向诱导分化为角化细胞的影响

目的：探讨不同细胞外基质对胚胎干细胞源性角化细胞生长、增殖及分化的影响。方法：体外培养的人类胚胎干细胞经RA、BMP4、AA诱导后,分别接种到以Matrigel（A组）、Ⅰ型胶原（B组）、Ⅳ型胶原（C组）、明胶（D组）包被的培养皿中培养,E组为无包被培养皿作为空白对照组。通过倒置显微镜观察细胞生长情况;用CCK8法检测细胞的增殖能力;并通过Western Blot检测CK14表达量,测定各组灰度值。结果：A组生长的E－KCs细胞最快到达生长对数期,增殖能力最强,且细胞集落形成率最高,与其他组比较,差异具有统计学意义（P＜0．05）;A组与正常口腔黏膜组（阳性对照）CK14表达量条带灰度值差异无统计学意义,但与B、C、D组比较差异具有统计学意义（P＜0．01）。结论：Matrigel与其他3种细胞外基质相比能显著提高人类胚胎干细胞向角化细胞诱导分化的能力,并能促进E－KCs生长和增殖。     

成釉蛋白在小鼠牙胚发育不同时期的免疫组化定位

目的：观察成釉蛋白（ameloblastin,AMBN)在小鼠牙胚发育不同时期的表达和分布情况。方法：采用免疫组化的方法观察AMBN在小鼠牙胚不同时期的表达和定位。结果：蕾状期、帽状期和钟状早期牙胚中未见AMBN的表达；出生后1d钟状期，在成釉细胞和釉基质中呈强阳性表达，成牙本质细胞和牙本质基质中呈弱阳性表达；出生后3d，在成釉细胞胞浆中呈弱阳性表达，在成牙本质细胞中表达阳性，着色较成釉细胞深；出生后7d，AMBN在成釉细胞托姆氏突呈弱阳性表达，其余部位呈阴性表达。在牙胚发育的各个时期，AMBN在外釉细胞、星网层细胞、牙乳头细胞均呈阴性表达。结论：AMBN参与釉基质的形成，可能与牙胚发育中基质形成的信息传递有关。     

人牙周膜干细胞体外诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的体外定向诱导人牙周膜干细胞分化为神经元样细胞,探讨人牙周膜干细胞的多向分化潜能。方法体外分离、培养人牙周膜细胞,待细胞达一定量后用有限稀释法进行克隆化培养,筛选鉴定牙周膜干细胞（PDLSC）,用含10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的预诱导培养液诱导培养24 h,然后换用含5 mmol/L β-巯基乙醇（β-ME）的诱导培养液诱导培养6 h,光镜下观察诱导细胞形态学的改变,免疫荧光、RT-PCR等方法检测鼠抗人神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。同时以未诱导细胞为对照。结果体外诱导培养6 h细胞即发生形态学改变,可看到典型的神经元样细胞;免疫荧光、RT-PCR检测诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE、NF,未诱导细胞无表达。结论人牙周膜干细胞在体外可以诱导分化为神经元样细胞,具有多向分化的潜能。     

牙本质非胶原蛋白诱导颅神经嵴干细胞向成牙本质细胞表型分化

目的探讨颅神经嵴干细胞(CNCSC)用于牙再生研究的可行性,观察牙本质基质非胶原蛋白(DMNCP)对CNCSC的成牙本质样细胞表型分化的影响。方法小鼠神经管组织块无血清条件培养法获取颅神经嵴干细胞,以DMNCP体外诱导CNCSC的分化,形态学、免疫细胞化学、茜素红特染等方法,分别从Ⅰ型胶原表达、牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙结节形成情况,鉴定CNCSC的成牙本质样细胞表型。结果诱导后的CNCSC呈现I型胶原、DSPP阳性表达,ALP活性增高,钙结节形成,具有成牙本质细胞表型特征。结论DMNCP具有诱导CNCSC向成牙本质细胞表型分化的作用,利用CNCSC开展牙再生研究是可行的。     

过表达骨形态发生蛋白-4对小鼠诱导性多能干细胞生物学活性的影响

目的 构建过表达骨形态发生蛋白-4（BMP4）基因的慢病毒载体,探讨其过表达后对小鼠诱导性多能干细胞（iPS）生物学活性的影响。方法 采用慢病毒转染建立稳定过表达BMP4的iPS细胞株（BMP4过表达组）,未作任何转染的细胞为空白组,转染慢病毒阴性对照组的细胞为空载体组。CCK8检测各组细胞增殖活性,碱性磷酸酶（ALP）活性检测细胞分化程度,荧光定量聚合酶链反应检测BMP4、成釉细胞蛋白（AMBN）、细胞角蛋白（CK）14、牙本质涎磷蛋白（DSPP）、骨唾液酸蛋白（BSP）及骨细胞特异转录因子Runx2的mRNA表达。结果 与空白组及空载体组相比,BMP4过表达组的细胞增殖活性及ALP活性升高（P<0.05）,Runx2、AMBN、CK14、DSPP、BSP mRNA的表达增加（P<0.05）。结论 BMP4基因能够促进iPS的牙向分化。     

GSK3beta inhibitor-induced dental mesenchymal stem cells regulate ameloblast differentiation

ObjectivesEpithelial-mesenchymal interactions are extremely important in tooth development and essential for ameloblast differentiation, especially during tooth formation. We aimed to identify the type of mesenchymal cells important in ameloblast differentiation.MethodsWe used two types of cell culture systems with chambers and found that a subset of debtal mesenchimal cells is important for the differentiatiuon of dental spithelial cells into ameloblasts. Further, we induced dental pulp stem cell-like cells from dental pulp stem cells using the small molecule compound BIO ( a GSK-3 inhibitor IX) to clarify the mechanism involved in ameloblast differentiation induced by dental pulp stem cells.ResultsThe BIO-induced dental pulp cells promoted the expression of mesenchymal stem cell markers Oct3/4 and Bcrp1. Furthermore, we used artificial dental pulp stem cells induced by BIO to identify the molecules expressed in dental pulp stem cells required for ameloblast differentiation. Panx3 expression was induced in the dental pulp stem cell through interaction with the dental epithelial cells. In addition, ATP release from cells increased in Panx3-expressing cells. We also confirmed that ATP stimulation is accepted in dental epithelial cells.ConclusionsThese results showed that the Panx3 expressed in dental pulp stem cells is important for ameloblast differentiation and that ATP release by Panx3 may play a role in epithelial–mesenchymal interaction.     

PLGA静电纺丝纳米纤维结合诱导培养基和BMP4诱导鼠胚胎干细胞向牙上皮分化

目的:检测聚羟基乙酸聚乳酸共聚物(PLGA)纳米支架材料结合诱导培养基和BMP4对胚胎鼠干细胞(mES)向牙上皮细胞分化的影响.方法:用PLGA作为基底材料,通过静电纺丝技术构建纳米纤维支架材料,结合不同时间点BMP4的干预,将鼠胚胎干细胞向牙上皮细胞诱导,构建mES向牙上皮分化的诱导体系,并进一步筛选出mES细胞向牙...     

Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line

Enamel is secreted as a protein matrix by the ameloblasts. These same cells then control the maturation of the enamel matrix, secreting proteinases that hydrolyze proteins as mineralization progresses, until mature enamel containing less than 1% protein by weight remains. Further understanding of the factors that control ameloblast function and differentiation requires an in vitro cell culture system. In this study, we report immortalization of enamel organ epithelial cells and the selection of a cell line with characteristics of ameloblasts. Porcine enamel organ cells were dissected from unerupted porcine molars, cultured in serum-free medium, and passaged twice. These cells were transfected with an origin-of-replication defective SV40 plasmid by calcium phosphate precipitation, and a cell line with mRNA expression characteristic of ameloblasts was cloned. This cell line (PABSo-E) expressed mRNA for amelogenin, matrix metalloproteinase-20 (enamelysin), and enamel matrix serine proteinase 1 (EMSP1), but not ameloblastin. PABSo-E cells have been passaged more than 55 times, while continuing to maintain characteristics of ameloblasts. These cells will be useful for future studies of ameloblast function.     

煅烧牙粉影响人牙周膜干细胞体外矿化的自噬机制研究

目的 探讨自噬在煅烧牙粉调节牙周膜干细胞体外矿化中的作用,为牙周膜干细胞的定向诱导分化和牙周病的治疗提供参考。方法 选用成人完整的牙齿在300 ℃的条件下煅烧后,研磨成粉,与α-MEM混合制备成20 μg/mL牙粉条件培养基,与人牙周膜干细胞共培养。采用流式细胞技术检测其对牙周膜干细胞凋亡的影响,通过Western blot检测、免疫荧光染色、茜素红染色和ALP染色观察检测其对牙周膜干细胞自噬活性及体外矿化的影响。结果 流式细胞技术结果显示牙粉对牙周膜干细胞的凋亡无明显影响（P＞0.05）;Western blot结果显示煅烧牙粉显著上调人牙周膜干细胞的自噬相关蛋白Beclin1,ATG5的表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值,以及明显下调了P62的蛋白水平（P<0.05）;免疫荧光染色显示牙粉促进人牙周膜干细胞中LC3在胞质内点状聚集;茜素红染色显示牙粉促进牙周膜干细胞的体外矿化;ALP染色显示自噬活性抑制剂氯喹降低牙粉对牙周膜干细胞体外矿化的促进作用。结论 煅烧牙粉通过激活自噬调节牙周膜干细胞的体外矿化作用。     

骨髓间充质干细胞对关节盘细胞的作用研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）对颞下颌关节盘软骨细胞的作用。方法大鼠骨髓来源的间充质干细胞三向分化鉴定其干性,大鼠关节盘软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色,收取BMSC培养24h上清液制作条件培养基。CCK-8检测条件培养基对关节盘软骨细胞细胞增殖影响,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析条件培养基培养7、14d关节盘软骨Ⅰ、Ⅱ、X型胶原基因表达。两组比较采用独立样本t检验,进行统计学分析。结果获取的大鼠BMSC具备三向分化能力．大鼠关节盘软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光表达。CCK-8结果显示,培养48h后条件培养基组细胞增殖速度明显加快,差异具有统计学意义（t=10．75,P〈0．05）;RT-PCR结果显示：条件培养基组7d时抑制X型胶原表达（t=2．586,P〈0．05）,14d时促进Ⅱ型胶原表达（t=6．501,P〈0．05）。结论大鼠BMSC分泌物促进关节盘软骨细胞增殖,抑制关节盘软骨细胞肥大发挥保护作用。     

诱导成体人牙周韧带干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的从成体人牙周组织中分离培养牙周韧带干细胞，研究其分化为软骨细胞的可行性。方法选取10～15岁的年轻患者因正畸拔除的健康牙齿，刮取根中1／3的牙周膜，采用组织块培养法得到牙周韧带细胞，待细胞达一定量后用有限元稀释法进行单细胞克隆，筛选牙周韧带干细胞（PDLSC），体外采用离心管聚集体诱导法进行软骨化诱导培养，光镜下观察诱导细胞形态学的改变，甲苯胺蓝染色、免疫组化、RT-PCR等方法检测胶原和糖蛋白的体外表达情况。结果体外离心管聚集体诱导培养3周后，实验组呈白色半透明状，甲苯胺蓝染色显示在外周区域有大量软骨基质成分沉积，组织学显示有较为明显的软骨陷窝。免疫组化及RT-PCR检测到Ⅱ型胶原表达，Ⅱ型胶原染色呈强阳性。对照组细胞团块逐渐收缩、崩解，组织学检测无软骨陷窝结构，Ⅱ型胶原免疫组化结果阴性。结论从成体人牙周组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分化状态，具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能，也为牙周组织工程的应用奠定了实验基础。