不同应力对人牙周膜成纤维细胞细胞骨架影响的体外研究

目的:研究不同应力对体外培养的人牙周膜成纤维细胞微丝形态的影响。方法:分别给第3～5代的人牙周膜成纤维细胞施加静压力、周期性牵张力和流体剪切力,用相差显微镜和考马斯亮蓝染色方法观察加力后不同时间细胞及其微丝形态的变化特征。结果:流体剪切力作用6h后,部分人牙周膜成纤维细胞出现收缩、微丝排列等方面的变化;12h后,部分细胞死亡、脱落。较大的静压力(>100kPa)作用12h后,可引起细胞间隙增大等变化,细胞骨架改变较少。结论:一定性质和力量的外力可引起体外培养的人牙周膜成纤维细胞微丝的重排、细胞贴壁及细胞形态的变化。静压力与剪切力、动态张力相比,对体外培养的人牙周膜成纤维细胞微丝形态影响较轻。     

人胚胎成纤维细胞饲养层的制备

背景：极小胚胎样干细胞是近年来发现的一种具有类似胚胎干细胞生物学特性的非造血干细胞，但对其体外培养扩增的方法报道极少。有研究推测，人胚胎成纤维细胞能为人骨髓极小胚胎样干细胞体外培养扩增提供良好的微环境。
　　目的：从人胚胎躯干中分离、培养人胚胎成纤维细胞，制备人胚胎成纤维细胞饲养层用于人骨髓极小胚胎样干细胞的培养。
　　方法：利用胰酶消化法从孕5-9周龄人胚胎躯干中分离培养人胚胎成纤维细胞。制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理后，用于培养分选后的人骨髓极小胚胎样干细胞，以细胞形态、生长曲线作为胚胎成纤维细胞和饲养层的评价指标。
　　结果与结论：从人胚胎中成功分离培养出人胚胎成纤维细胞，该细胞可传代24代以上，且经过传代及冻存复苏后生物学特性无改变。丝裂酶素C低于12 mg/L时，人胚胎成纤维细胞增殖不能完全抑制；高于14 mg/L，人胚胎成纤维细胞可能死亡。12 mg/L丝裂霉素C作用3 h后能较好地抑制人胚胎成纤维细胞的增殖，并且保持其活力约2周，可以在很长一段时间内用作人骨髓极小胚胎样干细胞的饲养层。     

可溶性肿瘤坏死因子受体对炎性牙周膜细胞的作用

目的：分析可溶性肿瘤坏死因子受体及T淋巴细胞对炎性牙周膜细胞的作用。 方法：实验于2005-03／09在解放军第四军医大学口腔医学院口内实验室完成。免疫磁珠分离CD3^＋T淋巴细胞于解放军第四军医大学唐都医院骨科实验室完成。CD3^＋T淋巴细胞取自正常人的外周血，牙周膜成纤维细胞和淋巴细胞培养液均购自美国Gbieo公司。大肠杆菌内毒素购自Sigma公司，质粒引物合成及目的基因检测均于Takara公司完成。正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T淋巴细胞共培养，加入大肠杆菌内毒素，实验组用PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养，对照组用转染空质粒的细胞培养液培养。空白组为正常牙周膜成纤维细胞加CD3^＋T淋巴细胞、正常牙周膜成纤维细胞加内毒素、正常牙周膜成纤维细胞。噻唑蓝法检测各组细胞24h和48h的活力变化；PeDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞后，免疫组化染色强阳性表达，转染培养液培养实验组细胞24h和48h后，噻唑蓝法检测实验组牙周膜细胞的活力变化。 结果：①正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T淋巴细胞共培养，内毒素刺激正常牙周膜成纤维细胞后，细胞活性降低；培养24h和48h后。噻唑蓝法检测各组的A值：正常牙周膜成纤维细胞和CD3^＋T淋巴细胞共培养组，加入内毒素刺激，24h为4．6&;#177;0．2，48h为3．7&;#177;0．1；用PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养，24h为7．8&;#177;0．3，48h为6．9&;#177;0．5；正常牙周膜成纤维细胞用内毒素刺激，24h为9．0&;#177;0．4；48h为8．7&;#177;0．3；单纯正常牙周膜成纤维细胞与CD3^＋T细胞共培养，24h为10．1&;#177;0．2，48h为9．8&;#177;0．5；单纯培养牙周膜成纤维细胞，24h为10．0&;#177;0．5，48h为9．2&;#177;0．1。②转染空质粒PcDNA3．1（&;#177;）的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达不明显，而转染质粒PcDNA3．1（＋）-可溶性肿瘤坏死因子受体的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达增强。 结论：内毒素与T淋巴细胞刺激正常牙周膜成纤维细胞可以引起肿瘤坏死因子α水平升高；可溶性肿瘤坏死因子受体对于炎症牙周膜成纤维细胞有抑制肿瘤坏死因子α作用的功能。     

机械牵张对缺血缺氧离体培养心肌细胞形态的影响

目的：在严重缺血缺氧时，细胞形态已受损的基础上，细胞接受力学刺激其形态变化如何?探讨机械牵张对缺血缺氧心肌细胞形态学的影响。方法：建立离体培养的心肌细胞机械牵张模型，以缺氧加无糖培养模拟烧伤早期缺血缺氧损害，心肌细胞形态变化采用F-actin荧光染色，利用图像分析系统分析细胞面积、长度。结果：缺氧3h后微丝破坏，失去正常网络状结构；缺氧12h部分微丝断裂，细胞收缩变形，细胞失去正常铺展外观。牵张3h细胞形态完好，与周边界限清楚，细胞面积增加，微丝沿细胞受力方向排列，局部呈增强趋势；牵张12h可见微丝沿受力方向排列，核周明显增强，胞体宽大。缺氧牵张3h微丝破坏明显，细胞形态不规则，胞浆内见空泡；缺氧牵张12h细胞形态严重受损，微丝结构几乎完全破坏，细胞铺展面积变小，细胞完整性严重受损。牵张12h细胞面积增加达22.4％，长度增加19．59％，缺氧牵张12h后细胞面积则减少22．1％。结论：机械牵张加重了缺血缺氧对心肌细胞的破坏。     

碱性成纤维细胞生长因子对牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达的影响(英文)

目的:研究己证实,碱性成纤维细胞生长因子刺激牙周膜细胞后可促进人牙周膜细胞的增殖,以利于重建丧失的牙周组织.利用不同质量浓度碱性成纤维细胞生长因子刺激体外培养的人正常牙周膜细胞,观察牙周膜细胞内核心蛋白多糖基因表达.方法:采用胰酶消化法分离培养牙周膜细胞.取第3代对数生长期的细胞,加入含有10%二甲基亚砜和含体积分数20%胎牛血清冻存液的DMEM中进行冻存,第2天移入液氮中保存.免疫组织化学方法行抗波形丝蛋白、角蛋白染色鉴定.取第6代人牙周膜细胞,分为实验组和空白组.实验组分别用含质量浓度为0.1,1,10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子的DMEM培养液标准条件下培养24 h;空白组用DMEM培养液标准条件下培养24 h.RT-PCR法检测细胞内核心蛋白多糖基因表达变化.结果:镜下观察空白组细胞未见明显变化,实验组可见细胞增殖,刺激前瓶底细胞较稀疏的区域变得密集了.加入碱性成纤维细胞生长冈了的牙周膜细胞内核心蛋白多糖的mRNA表达水平明显下降了,而且随着碱性成纤维细胞生长因子质量浓度的增加,抑制作用逐渐减弱,在0.1 μg/L时抑制作用最强,在10 μg/L时抑制作用最弱.结论:碱性成纤维细胞生长凶子刺激可促进牙周膜细胞增殖,呈剂量依赖性抑制核心蛋白多糖的合成,0.1 μg/L时抑制作用最强.     

p38丝裂素活化蛋白激酶与周期性张应力介导牙周膜成纤维细胞的增殖

背景:体内环境的复杂多变,使得在体外研究机械应力对细胞的作用存在着一定难度。目的:探讨p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞增殖中所产生的影响及其机制。方法:构建人牙周膜成纤维细胞体外培养-力学刺激模型,利用多通道细胞牵张应力加载系统,分别对细胞加以1,6,12,24h的周期性张应力,不加力组作为对照组,并在对照组和加力12h组分别加入p38丝裂素活化蛋白激酶特异性抑制剂SB203580。细胞计数试剂8检测细胞增殖情况;RT-PCR检测细胞和增殖细胞核抗原的表达。结果与结论:加力1h时细胞增殖得到促进,6h时继续上升,12h时达到高峰,24h增殖受到抑制;SB203580可抑制细胞增殖和增殖细胞核抗原mRNA的表达。说明在一定时间范围内,周期性张应力可促进人牙周膜成纤维细胞增殖,但随时间延长,增殖受到抑制;p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在周期性张应力介导的人牙周膜成纤维细胞增殖中发挥重要作用。     

可溶性肿瘤坏死因子受体对炎性牙周膜细胞的作用

目的:分析可溶性肿瘤坏死因子受体及T淋巴细胞对炎性牙周膜细胞的作用。方法:实验于2005-03/09在解放军第四军医大学口腔医学院口内实验室完成。免疫磁珠分离CD3 T淋巴细胞于解放军第四军医大学唐都医院骨科实验室完成。CD3 T淋巴细胞取自正常人的外周血,牙周膜成纤维细胞和淋巴细胞培养液均购自美国Gbico公司,大肠杆菌内毒素购自Sigma公司,质粒引物合成及目的基因检测均于Takara公司完成。正常牙周膜成纤维细胞与CD3 T淋巴细胞共培养,加入大肠杆菌内毒素,实验组用PcDNA3.1( )-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养,对照组用转染空质粒的细胞培养液培养。空白组为正常牙周膜成纤维细胞加CD3 T淋巴细胞、正常牙周膜成纤维细胞加内毒素、正常牙周膜成纤维细胞。噻唑蓝法检测各组细胞24h和48h的活力变化;PcDNA3.1( )-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞后,免疫组化染色强阳性表达,转染培养液培养实验组细胞24h和48h后,噻唑蓝法检测实验组牙周膜细胞的活力变化。结果:①正常牙周膜成纤维细胞与CD3 T淋巴细胞共培养,内毒素刺激正常牙周膜成纤维细胞后,细胞活性降低;培养24h和48h后,噻唑蓝法检测各组的A值:正常牙周膜成纤维细胞和CD3 T淋巴细胞共培养组,加入内毒素刺激,24h为4.6±0.2,48h为3.7±0.1;用PcD-NA3.1( )-可溶性肿瘤坏死因子受体转染细胞的培养液培养,24h为7.8±0.3,48h为6.9±0.5;正常牙周膜成纤维细胞用内毒素刺激,24h为9.0±0.4;48h为8.7±0.3;单纯正常牙周膜成纤维细胞与CD3 T细胞共培养,24h为10.1±0.2,48h为9.8±0.5;单纯培养牙周膜成纤维细胞,24h为10.0±0.5,48h为9.2±0.1。②转染空质粒PcDNA3.1( )的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达不明显,而转染质粒PcDNA3.1( )-可溶性肿瘤坏死因子受体的牙周膜成纤维细胞其可溶性肿瘤坏死因子受体表达增强。结论:内毒素与T淋巴细胞刺激正常牙周膜成纤维细胞可以引起肿瘤坏死因子α水平升高;可溶性肿瘤坏死因子受体对于炎症牙周膜成纤维细胞有抑制肿瘤坏死因子α作用的功能。     

血小板衍化生长因子β对体外人牙周膜细胞增殖分化的影响

背景：牙周支持组织破坏及附着丧失是导致失牙的最主要原因,细胞因子能促进牙周组织再生形成新附着。目的：观察血小板衍化生长因子β在人牙周膜成纤维细胞增殖过程中的作用。方法：体外利用组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,对传代后细胞进行组织来源鉴定,通过波丝蛋白、角蛋白免疫组化染色进行定性分析,并加入生物因子血小板衍化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞进行增殖诱导,采用MTT法测定吸光度值。结果与结论：加入质量浓度为10μg/L的血小板衍化生长因子β后,细胞增殖加速,在加入生长因子血小板衍化生长因子β后,实验组的吸光度显著高于对照组,说明血小板衍化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞的增殖具有明显的促进作用。     

机械牵张人牙周膜成纤维细胞钙离子通道的变化

背景:当机械牵张力作用到细胞上,通过激活钙离子通道以改变胞内Ca2+浓度,引发细胞功能的相应改变.目的:应用激光共聚焦显微成像技术观察钙通道阻滞剂对机械牵张力下,钙离子浓度变化的影响.设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-03/2008-08在哈尔滨医科大学药理学院完成.材料:硝苯地平、氯化镉购自美国SIGMA公司.12～16岁青少年因正畸目的拔除的双尖牙.方法:以酶消化组织快法培养人牙周膜成纤维细胞,采用体外细胞加力装置给细胞加力,按弹力形变8%、12%加力2,4 h后,分别加入10,20 μmol硝苯地平及10 μmol氯化镉,同时设单纯加力和正常对照组,共17组.经Fluo-3/AM负载后,在激光共聚焦显微镜下观察人牙膜成纤维细胞在不同加力时间以及弹性形变的荧光强度变化.主要观察指标:激光共聚焦显微镜下观察人牙周膜成纤维细胞荧光强度变化及钙离子浓度变化.结果:单纯加力人牙周膜成纤维细胞中钙离子浓度升高明显,细胞亮度明显增强,加入硝苯地平10,20 μmol后,随着药物浓度增高,细胞亮度逐渐减弱,加入氯化镉后,细胞亮度减弱更加明显.人牙周膜成纤维细胞弹力形变8%,细胞加力2 h后,细胞内钙离子浓度明显升高(P＜0.01),加入10,20 μmol硝苯地平后,随着药物浓度的增加,细胞内钙浓度逐渐降低(P＜0.01),但高于正常对照组,加入氯化镉后,细胞内钙浓度下降比硝苯地平组更加明显(P＜0.01),但高于正常组.弹力形变8%+细胞加力4 h组、弹力形变12%+细胞加力2 h组、弹力形变12%+细胞加力4 h后与弹力形变8%,细胞加力2 h组结果一致.结论:单纯加力可以提高人牙周膜成纤维细胞中钙离子浓度,与弹性形变、加力时间无关.硝苯地平和氯化镉可以降低人牙周膜成纤维细胞内钙离子浓度,氯化镉作用更强.     

机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞表达白细胞介素6与p38丝裂原激活蛋白激酶阻断剂的影响

背景：牙周膜细胞对于维持牙周组织的形态和功能起着关键作用，不良应力可能引起其合成过量炎症因子从而最终引起牙周组织破坏。 目的：分析p38丝裂原激活蛋白在压力诱导人牙周膜成纤维细胞合成炎症因子白细胞介素6过程中所起的作用。 设计：观察对比实验。 单位：解放军第四军医大学口腔生理实验室。 材料：牙周膜成纤维细胞：取自因正畸需要拔除的20颗健康恒前磨牙的12～16岁青少年牙根中1／3牙周膜组织。试剂和仪器：白细胞介素6ELISA试剂盒（第四军医大学免疫学教研室）；酶联免疫检测仪（华东电子管厂）；p38p38丝裂原激活蛋白阻断剂特异阻断剂SB203580（Biochemical公司生产，第一军医大学病理生理教研室姜勇教授惠赠）。 方法：采用常规组织块法将牙周膜组织细胞进行原代培养至第4、5代，将细胞随机分为4组：加压对照组：不对细胞加压及预处理；加压组：以200kPa持续加压细胞，不加预处理；预处理对照组：细胞加压前1h上清中加入10g/L二甲基亚砜，加压方式、时间同加压组；预处理组：细胞加压前1h预处理，即在上清中加入p38丝裂原激活蛋白阻断剂的特异阻断剂SB203580，浓度为1μmol／L，加压方式、时间同加压组。各组分别在持续加压后16．24h采集标本，通过酶标记免疫吸附测定法测定不同时间点各组细胞中白细胞介素6表达量。 主要观察指标：压力对人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6的量的影响结果及p38丝裂原激活蛋白阻断剂对压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6量的影响结果。 结果：加压组细胞经持续加压16，24h后的白细胞介素6表达量分别为（143．1&;#177;0．42），（49．46&;#177;1．01）ng／L，明显高于加压对照组[（18．36&;#177;0．43），（18．78&;#177;0．50）ng／L，P〈0．05]；预处理组经持续加压16，24h后的白细胞介素6表达量分别为（56．39&;#177;0．72），（21．52&;#177;1.39）ng／L明显低于预处理对照组【（137．96&;#177;0．54），（48．74&;#177;0．79）ng／L．P〈0．05】。 结论：p38丝裂原激活蛋白是机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生白细胞介素6的重要环节。     

狗牙周膜成纤维细胞的体外培养及其生物学活性

目的：建立一种简便、可靠的牙周膜成纤维细胞(PDLFs)原代分离培养方法，并探讨PDLFs作为牙周组织工程种子细胞的可行性。方法：采用改良组织块法，全麻下拔狗上颌第3切牙，刮取牙周膜，以玻璃片覆盖组织块贴壁替代传统的干燥贴壁法。细胞培养成功后传代，用四甲基偶氮唑蓝比色、免疫组化染色、Von Kossa染色等方法测定其生物学活性。结果：PDLFs原代培养成功率达到89％，免疫组化检测结果为波形丝蛋白阳性，角蛋白阴性，体外培养PDLFs可自然形成矿化结节。结论：采用改良组织块法可以简便、稳定获取原代PDLFs。体外培养PDLFs具有部分成骨样细胞表型特征，可作为牙周组织工程种子细胞来源。 细胞培养     

人牙周膜干细胞与牙周膜细胞生物学特性的比较

背景：牙周膜干细胞生物作用是目前牙周病治疗研究的热点,牙周膜成纤维细胞是其分化的终末功能细胞之一,也是其主要的支持细胞,两者生物学特性的差异研究鲜有报道。目的：比较牙周膜干细胞与牙周膜细胞生物学特性的差异。方法：用组织块法体外对牙周膜细胞以及单细胞克隆分离纯化后的人牙周膜干细胞两种细胞分别进行显微镜下形态观察,CCK8法检测并绘制2种细胞的生长曲线。流式细胞分析比较2种细胞的细胞周期以及细胞表面标记物的表达、实时PCR对2种细胞碱性磷酸酶、增殖细胞核抗原和Scleraxis基因进行检测。结果与结论：牙周膜干细胞与牙周膜成纤维细胞外观差别明显,人牙周膜干细胞的生长曲线培养前5d要低于牙周膜细胞,但在5 d后明显高于牙周膜细胞。人牙周膜干细胞与牙周膜细胞的细胞周期分别为41.1%和23.9%。表面标记物检测结果显示2种细胞虽有相似的表达,但在表达率差异有有显著性意义。实时荧光定量PCR结果显示,人牙周膜干细胞在碱性磷酸酶、增殖细胞核抗原以及Scleraxis基因的表达检测均高于牙周膜细胞。表明牙周膜干细胞在成骨增殖等生物学功能上比牙周膜细胞具有更强的潜能。     

丝蛋白应用于牙周组织工程的可行性

背景：丝蛋白是有利于表皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、胶质细胞黏附和生长的一种新型生物材料。目的：评估丝蛋白作为支架材料应用于牙周组织工程的可行性。方法：采用组织块法培养人牙周膜细胞,将第5代细胞悬液以2×107L-1的浓度接种到丝蛋白支架材料上复合培养,并以1%,10%,50%,100%的丝蛋白支架浸提液培养,观察人牙周膜细胞在丝蛋白上及在丝蛋白浸提液中生长状况,用MTT法测定浸提液培养人牙周膜细胞的活力。结果与结论：扫描电镜可见人牙周膜细胞在丝蛋白支架上伸展充分,生长旺盛,不同浓度丝蛋白支架浸提液培养对人牙周膜细胞的增殖与碱性磷酸酶活性均无影响。说明丝蛋白材料具有良好的生物相容性、独特的力学性能,可作为人牙周膜细胞黏附生长的理想支架材料较好地应用于牙周组织工程中。     

中药双黄补对体外培养人牙周膜细胞增殖活性的影响

背景:目前的研究大多为单味中药或单一中药成分对体外培养人牙周膜细胞的影响,而中药组方提取液对体外培养细胞影响的研究较少.目的:观察中药双黄补对体外培养的人牙周膜细胞增殖活性的影响.设计、时间及地点:对比观察实验,于2008-11/2009-02在河北医科大学第四医院科研中心完成.材料:人牙周膜细胞组织选自河北医科大学第四医院口腔科要求手术拔除的埋伏多生牙者.黄连、黄芩、骨碎补均购自河北医科大学第四医院中药房.方法:采用组织块法体外培养人牙周膜细胞.水提醇沉法制各双黄补提取液.以每1 Ml药液含生药1 g加入体积分数20%的胎牛血清培养液,稀释成质量浓度为10,25,50,100,150,200,250,500,750,1 000 mg/L,分别作用于体外培养的人牙周膜细胞,以不加双黄补提取液的培养细胞为对照.主要观察指标:采用四甲基偶氮唑蓝法测定培养细胞增殖活性的变化,应用流式细胞术检测100 mg/L的双黄补提取液对牙周膜细胞周期的变化和对成纤维细胞生长因子18水平的影响.结果:双黄补对人牙周膜细胞的增殖活性的影响存在质量浓度和时间效应,各质量浓度双黄补均能促进体外培养人牙周膜细胞的增殖活性,其中以100 mg/L质量浓度促增殖活性作用最明显(P<0.01),相同质量浓度不同作用时间对细胞促增殖活性作用也不同,以48 h作用最明显(P<0.05).与对照组相比,100 mg/L的双黄补促进牙周膜细胞成纤维细胞生长因子18水平增高,S期和G2M期细胞数目增多,在48 h最明显.结论:中药双黄补可增强人牙周膜细胞的增殖活性,具有明显的浓度效应和时间效应.     

机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞表达白细胞介素6与p38丝裂原激活蛋白激酶阻断剂的影响

背景:牙周膜细胞对于维持牙周组织的形态和功能起着关键作用,不良应力可能引起其合成过量炎症因子从而最终引起牙周组织破坏。目的:分析p38丝裂原激活蛋白在压力诱导人牙周膜成纤维细胞合成炎症因子白细胞介素6过程中所起的作用。设计:观察对比实验。单位:解放军第四军医大学口腔生理实验室。材料:牙周膜成纤维细胞:取自因正畸需要拔除的20颗健康恒前磨牙的12～16岁青少年牙根中1/3牙周膜组织。试剂和仪器:白细胞介素6ELISA试剂盒(第四军医大学免疫学教研室);酶联免疫检测仪(华东电子管厂);p38p38丝裂原激活蛋白阻断剂特异阻断剂SB203580(Biochemical公司生产,第一军医大学病理生理教研室姜勇教授惠赠)。方法:采用常规组织块法将牙周膜组织细胞进行原代培养至第4、5代,将细胞随机分为4组:加压对照组:不对细胞加压及预处理;加压组:以200kPa持续加压细胞,不加预处理;预处理对照组:细胞加压前1h上清中加入10g/L二甲基亚砜,加压方式、时间同加压组;预处理组:细胞加压前1h预处理,即在上清中加入p38丝裂原激活蛋白阻断剂的特异阻断剂SB203580,浓度为1μmol/L,加压方式、时间同加压组。各组分别在持续加压后16,24h采集标本,通过酶标记免疫吸附测定法测定不同时间点各组细胞中白细胞介素6表达量。主要观察指标:压力对人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6的量的影响结果及p38丝裂原激活蛋白阻断剂对压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生的白细胞介素6量的影响结果。结果:加压组细胞经持续加压16,24h后的白细胞介素6表达量分别为(143.1±0.42),(49.46±1.01)ng/L,明显高于加压对照组[(18.36±0.43),(18.78±0.50)ng/L,P<0.05];预处理组经持续加压16,24h后的白细胞介素6表达量分别为(56.39±0.72),(21.52±1.39)ng/L明显低于预处理对照组[(137.96±0.54),(48.74±0.79)ng/L,P<0.05]。结论:p38丝裂原激活蛋白是机械压力诱导人牙周膜成纤维细胞产生白细胞介素6的重要环节。     

机械牵张对缺血缺氧离体培养心肌细胞形态的影响

目的:在严重缺血缺氧时,细胞形态已受损的基础上,细胞接受力学刺激其形态变化如何?探讨机械牵张对缺血缺氧心肌细胞形态学的影响。方法:建立离体培养的心肌细胞机械牵张模型,以缺氧加无糖培养模拟烧伤早期缺血缺氧损害,心肌细胞形态变化采用F-actin荧光染色,利用图像分析系统分析细胞面积、长度。结果:缺氧3h后微丝破坏,失去正常网络状结构;缺氧12h部分微丝断裂,细胞收缩变形,细胞失去正常铺展外观。牵张3h细胞形态完好,与周边界限清楚,细胞面积增加,微丝沿细胞受力方向排列,局部呈增强趋势;牵张12h可见微丝沿受力方向排列,核周明显增强,胞体宽大。缺氧牵张3h微丝破坏明显,细胞形态不规则,胞浆内见空泡;缺氧牵张12h细胞形态严重受损,微丝结构几乎完全破坏,细胞铺展面积变小,细胞完整性严重受损。牵张12h细胞面积增加达22.4%,长度增加19.59%,缺氧牵张12h后细胞面积则减少22.1%。结论:机械牵张加重了缺血缺氧对心肌细胞的破坏。     

血小板衍化生长因子β对体外人牙周膜细胞增殖分化的影响

背景:牙周支持组织破坏及附着丧失是导致失牙的最主要原因,细胞因子能促进牙周组织再生形成新附着。目的:观察血小板衍化生长因子β在人牙周膜成纤维细胞增殖过程中的作用。方法:体外利用组织块法培养人牙周膜成纤维细胞,对传代后细胞进行组织来源鉴定,通过波丝蛋白、角蛋白免疫组化染色进行定性分析,并加入生物因子血小板衍化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞进行增殖诱导,采用MTT法测定吸光度值。结果与结论:加入质量浓度为10μg/L的血小板衍化生长因子β后,细胞增殖加速,在加入生长因子血小板衍化生长因子β后,实验组的吸光度显著高于对照组,说明血小板衍化生长因子β对人牙周膜成纤维细胞的增殖具有明显的促进作用。     

P27基因转染对瘢痕成纤维细胞超微结构的影响

目的：观察P27基因转染对体外培养增生性瘢痕成纤维细胞超微结梅的影响，探讨P27基因抑制瘢痕的作用。 方法：实验于2001-06／2002-01在第四军医大学烧伤科实验室、第四军医大学电镜中心完成。pcDNA—p273真核表达质粒由第一作者构建，应用基因转染技术将所构建的pcDNA3-p27载体转染成纤维细胞，培养的增生性瘢痕成纤维细胞分为空白对照组（即未经转染的增生性瘢痕成纤维细胞）、转pcDNA3空载体组、转pcDNA3-P27组。获得稳定的P27表达后，用透射电镜观察成纤维细胞内细胞器形态和数量的变化。 结果：①空白对照组成纤维细胞核大而呈圆形，核仁明显，胞浆内具有较丰富的粗面内质网，较发达的高尔基复合体，较多的线粒体、微丝、微管，细胞表面微绒毛及突起较多。②转pcDNA3空载体组粗面内质网、线粒体较丰富。⑨转pcDNA3-P27组细胞胞浆内粗面内质网、线粒体、微丝、微管明显减少，大部分细胞出现染色体边聚，粗面内质网上的核糖体明显减少，部分细胞呈现凋亡，大部分细胞呈典型的生长抑制像。④P27明显抑制增生性瘢痕成纤维细胞的合成功能。 结论：P27可能通过抑制成纤维细胞的细胞合成、增殖功能来抑制瘢痕形成。     

人脑神经干细胞对不同储存方式及分离培养和诱导分化条件的要求

背景：近年来发现神经干细胞可于体外增殖并分化为神经细胞，是用来修复替代损伤神经组织的较为理想的来源，但是神经干细胞的培养中如何提高它的增殖能力，诱导分化成需要的表现型，尚处于研究探讨阶段。目的：探讨细胞冻存和非冻存方法分离培养人脑神经干细胞及诱导其向成熟神经细胞分化的培养条件。设计：以细胞为观察对象，单一样本研究。单位：江西医学院泌尿外科研究所，江西医学院第二附属医院神经外科。材料：实验于2003-12／2004-06在江西医学院泌尿外科研究所完成。取16周龄新鲜人胚脑组织。方法：用胰蛋白酶消化法从人胚脑中分离单个细胞，细胞冻存1个月后复苏或／和新鲜细胞用无血清培养基进行体外培养，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子刺激细胞生长，用血清诱导其分化；采用免疫荧光细胞化学染色方法检测培养的细胞神经巢蛋白抗原和分化后成熟神经细胞抗原神经元特异性烯醇化酶的表达。观察碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子及血清对分离培养的人脑神经干细胞增殖与分化的影响。主要观察指标：①冻存与新鲜细胞后续培养的生长状况。②细胞形态变化。③神经干细胞标志物神经巢蛋白及成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶的鉴定。结果：①从胚龄16周的新鲜人胚脑中成功分离出神经干细胞。人胚脑原代细胞为圆形亮球状，培养3d后可见细胞开始聚集成神经球，部分呈悬浮生长，2周后神经球增大，部分细胞增大数倍，具有极强折光性，可见分裂增殖。经传代后细胞仍保持原有特征，细胞形态不变。克隆细胞在有血清培养基中培养，24h后可见大部分细胞贴壁生长，细胞从神经球游出分散，形态不规则；48h后多数细胞分化为大量形态不一的、分散成片的多突起星状细胞和神经元样细胞，突起相互交织成网。②分离出的神经干细胞在体外培养条件下传代培养，并表达神经干细胞标志巢蛋白；含血清培养基培养48h分化后的细胞主要表达成熟神经细胞标志神经元特异性烯醇化酶。③冻存复苏的细胞95％，以上为活细胞，与新鲜细胞比较，细胞生长状况无明显差别。结论：用无血清培养条件下结合碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的作用，使干细胞体外得到了分离培养、增殖和纯化，证实其方法可行，同时冻存和新鲜细胞的比较，说明可用冻存方法保存人胚脑细胞，复苏后使用。     

体外培养诱导成人骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的实验

目的：以含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液对原代培养的成人骨骼肌干细胞进行诱导，探讨其转化为神经细胞的可行性。 方法：实验于2004-06／12在军事医学科学院基础医学研究所完成。实验所用3例成人正常颞肌标本取白于开颅手术患者，由北京协和医院神经外科提供，患者知情同意。机械分离加混合消化液处理分离单细胞，体外培养及克隆纯化，培养至第3代时加入含有碱性成纤维细胞生长因子二甲基亚砜的培养液诱导分化，进行反转录-聚合酶链反应分析和免疫荧光细胞化学染色．观察诱导后细胞形态变化，同时结合普通光线在100倍下随机计数6个视野（大于100个细胞），计算阳性细胞的百分比。 结果：①骨骼肌干细胞培养24h后见少量细胞贴壁呈短的梭形或棒状。培养第3天红细胞开始裂解成细胞碎屑并聚集、悬浮在培养基中．这些碎屑随着换液而逐渐消失。克隆培养的细胞大约于接种后两三周才能铺满孔底，胞体呈梭形．排列规整。②荧光显微镜下胞核蓝染，每个细胞都呈Desmin染色阳性，证明成人骨骼肌干细胞能够在体外进行克隆培养。③在含有碱性成纤维细胞生长因子和二甲基亚砜的培养液诱导下，骨骼肌干细胞可分化为形态上类似于神经元和星形胶质细胞的细胞。④反转录-聚合酶链反应分析证实诱导后的骨骼肌干细胞有神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白基因表达。⑤免疫荧光细胞化学检测到诱导后的骨骼肌干细胞呈神经丝蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫反应阳性。⑥诱导后骨骼肌干细胞分化为神经丝蛋白阳性细胞的比例为（35．9&;#177;6．3）％，分化为胶质纤维酸性蛋白阳性细胞的比例为（43．7&;#177;5．3）％。 结论：成人骨骼肌干细胞在体外经诱导分化后形态类似于神经元和星形胶质细胞，并且表达神经元标志物神经丝蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白，认为成人骨骼肌干细胞在体外可诱导分化为神经元和星形胶质细胞。