CD95基因抑制胃癌细胞生长的体外抑瘤效应

目的　将CD95基因导入胃癌细胞 ,建立CD95基因表达株 ,并比较转导前后mRNA与蛋白的表达水平。观察CD95蛋白对体外培养胃癌细胞的抑制作用。方法　采用分子克隆技术将CD95基因插入真核表达载体pBK CMV的多克隆克隆位点之间 ,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞SGC790 1,用G418筛选克隆细胞 ;以Northernblot,Westernblot检测CD95基因的表达。MTT法检测转导株对化疗药物的敏感性 ;直接记数法描述转导株的细胞生长曲线 ;软琼脂集落形成实验观察基因转导前后细胞的克隆形成力。结果　成功地构建了真核表达载体pBK CD95cDNA。转导细胞后 ,从 1× 10 5细胞中筛选出 10 0个抗性克隆以上 ,转导率大于 0 1% ,随机挑选 2个克隆扩增培养 ,获得了 1株稳定的抗性细胞 ,从而有效地建立了CD95基因表达株 (SGC790 1CD95cells)。杂交结果表明 ,转导株在mRNA及蛋白水平的表达均明显高于非转导株。转导细胞的细胞倍增时间、对数生长期等均体现了比非转导株更为缓慢和处于抑制状态 ,集落形成能力低下 ,而对VCR、5 FU等化疗药物的敏感性明显增强。结论　CD95基因在胃癌细胞中处于低表达状态 ;通过真核表达载体的介导 ,CD95基因导入胃癌细胞后 ,能有效地表达CD95mRNA及其蛋白。CD95基因转导株的表达蛋白能有效地抑制体外培     

CD95抑制大肠癌细胞生长的实验研究

诱导肿瘤细胞凋亡治疗肿瘤 ,是肿瘤治疗上的一个突破。将凋亡基因ＣＤ95ｃＤＮＡ导入大肠癌细胞 ,观察ＣＤ95基因在转导株的表达及在ＣＤ95抗体作用下的体外抑瘤效应 ,可望为大肠癌的ＣＤ95核酸免疫治疗提供理论依据。材料与方法一、材料大肠癌细胞ＨＴ 2 9及ＤＨ5α菌株、ｐＢＫ ＣＭＶ真核表达载体为本所保存。ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ等内切酶及Ｔ4ＤＮＡ连接酶、探针标记试剂盒与异硫氰酸胍等试剂均购于华运生物技术公司。脂质体购于ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司。蛋白酶Ｋ及硝酸纤维膜购于Ｓｉｇｍａ产品。 [α 3 2 Ｐ]ｄＡＴＰ购于北京亚辉公司…     

CD95抑制大肠癌细胞生长的实验研究

目的建立表达外源性CD95基因的大肠癌细胞株,观察CD95表达细胞株在CD95抗体作用下对体外培养的大肠癌细胞的抑制效应。方法采用分子克隆技术将CD95基因插入真核表达载体pBK-CMV的多克隆位点之间。以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞的HT-29,用G418筛选克隆细胞。以Northern blot,Western blot检测转导细胞CD95基因的表达。MTT法和直接记数法以及软琼脂集落形成实验检测转导株在CD95抗体作用下的细胞增殖水平、生长曲线及细胞克隆形成率。结果成功地构建了真核表达载体pBK-CMV/CD95 cDNA。转导细胞并经筛选后,获得了2株稳定的抗性细胞,从而建立了CD95基因表达株(HT-29 CD95 cells)。杂交结果表明、转导株CD95mRNA及其蛋白水平的表达均明显高于非转导株,转导细胞增殖速度、倍增时间、对数生长期等均比非转导株更为缓慢和处于抑制状态,集落形成能力低下,但差异无显著性意义,而在CD95抗体作用下效果更为显著,差异有非常显著性意义。结论 CD95基因在大肠癌细胞中处于低表达状态;通过真核表达载体的介导,CD95基因导入大肠癌细胞后,能有效地表达CD95mRNA及其蛋白。CD95表达细胞株在CD95抗体的作用下可明显抑制体外培养的大肠癌细胞的生长增殖,其作用机制与CD95诱导细胞凋亡有关。     

WWOX基因转染抑瘤效应的实验研究

目的建立肿瘤抑制基因WWOX真核表达载体，观察其瞬时转染对肿瘤细胞凋亡的影响。方法采用RT-PCR方法，从正常人胚肾细胞HEK-293中钓取WWOX基因，将其克隆至pMD18-T载体上，测序正确后克隆到真核表达载体pcDNA4／myc-His中；采用脂质体介导法体外瞬时转染人肺腺癌A549细胞；RT—PCR法和Western印迹法分别检测WWOX基因mRNA和蛋白表达水平；流式细胞术检测细胞凋亡率；克隆形成试验观察肿瘤细胞克隆形成能力的变化。结果成功构建了WWOX的真核表达载体，体外转染的A549细胞凋亡率明显高于未转染和空载体转染细胞，且细胞克隆形成能力下降，形成率为35．43％，明显低于未转染细胞和空载体转染细胞。结论所构建的pcDNA4／myc-WWOX真核表达载体转染肿瘤细胞能够抑制肿瘤生长并诱导细胞凋亡。     

原位转导胞嘧啶脱氨酶自杀基因对大肠肿瘤的杀伤作用

目的通过胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因对接种于裸鼠肿瘤的直接杀伤作用研究，探索原位转自杀基因抑制大肠肿瘤的治疗方法。方法 将含ＣＤ基因的逆转录病毒载体进行包装，收获病毒上清后，将含ＣＤ基因的重组病毒上清直接注射到患病部位。结果 在给予前药５－ＦＣ后，观察到明显的肿瘤杀伤作用。结论ＣＤ基因直接转导到肿瘤部位的治疗结果，提示其可以做为大肠癌综合治疗的有效手段之一。     

IL—6基因转导大肠癌细胞的表达

目的:IL-6基因导入大肠癌细胞,建立能有效表达IL-6的转导株HT-29IL-6.方法:采用酶切与连接技术构建重组IL-6基因逆转录病毒载体,基因转染包装细胞,C418筛选克隆,常规制备重组病毒液并感染HT-29细胞,筛选抗性细胞,Southern blot和Northem blot分析基因的整合与mRNA转录水平,MTT显色法及ELISA法检测表达产物的量与活性.结果:成功地构建了重组载体pZIPIL-6cDNA,制备了高滴度的重组病毒液(5.1×10~5cft/ml),其感染率达80%以上,建立了HT-29IL-6表达株,杂交结果证实具有目的基因的稳定整合和相应mRNA的有效转录,表达IL-6的量与活性分别为1132.5pg/ml和15OU/ml.结论:逆转录病毒载体介导的IL-6基因通过转染及筛选能稳定整合在大肠癌细胞染色体,并进行有效的转录与表达,为IL-6转基因治疗大肠癌的研究奠定了基础.     

肝脏病中CD95介导的细胞凋亡

一、ＣＤ９５业已证明,ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ－１,ＣＤ９５受体）通过与其自然配体ＣＤ９５Ｌ或可溶性ＣＤ９５Ｌ或特异性活性抗体结合而激发细胞凋亡。与肿瘤坏死因子受体（ＴＮＦ－Ｒ１）、ＴＮＦ－Ｒ２、低亲和性神经生长因子（ＮＧＦ）受体、ＣＤ４０和ＣＤ３０等细胞外结构域中存在２～５个半胱氨酸而统归于ＴＮＦ／ＮＧＦ受体超家族。ＣＤ９５还与ＴＮＦ－Ｒ１,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（ＴＲＡＩＬ）－Ｒ１,ＴＲＡＩＬ－Ｒ２和死亡受体３（ＤＲ３）在胞内有一段同源区域而被命名为“死亡区域”。ＣＤ９５凋亡路径是通过…     

乙型肝炎慢性肝病中的肝细胞表达CD95L提示能自行凋亡

乙型肝炎慢性肝病中的肝细胞表达ＣＤ９５Ｌ提示能自行凋亡骆抗先，朱幼芙，何海棠，王新生，王晋豫作者单位：５１０５１５广州第一军医大学附属南方医院ＣＤ９５是介导凋亡的细胞表面分子，慢性肝病时肝细胞可有强表达。ＣＤ的是受体，与其配体（ＣＤ９５Ｌ）相互作用从...     

表达CD95L的HepG_2细胞自分泌和旁分泌的细胞毒效应

目的阐明乙型肝炎时肝细胞可表达细胞毒效应分子ＣＤ９５Ｌ的效应机制。方法ＨｅｐＧ２细胞诱导表达ＣＤ９５Ｌ,与ＨｅｎＧ２．２．１５细胞共培养;或以其培养上清液加于另一份未经诱导的ＨｅＰＧｚ细胞中,以流式细胞仪检测后者的凋亡率;以单个ＨｅｐＧ２细胞培养试验自体凋亡。结果表达ＣＤ９５Ｌ的ＨｅｐＧ２细胞致表达ＣＤ９５的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞的凋亡率为：２４小时时１６．５％,４８小时时４３．０％;培养上清液引起的凋亡率：２４小时时３８．７％,４８小时时７３．３％,单个ＨｅｐＧ２细胞经诱导的自杀率２４小时为４３．８％,均高于各自的对照。结论ＨｅｐＧｅ细胞以ＣＤ９５Ｌ的膜性或可溶性分子、经旁分泌或自分泌发生“自杀”或“同胞相杀”。     

老年人外周血淋巴细胞的凋亡及CD28和CD95的表达

目的通过对健康老年人与健康成年人外周血淋巴细胞的凋亡率及CD28和CD95表达水平的比较性研究,观察衰老对淋巴细胞凋亡的影响,以及CD28和CD95与淋巴细胞凋亡的关系。方法将实验对象分为2组：成年组（25～59岁）与老年组（60～90岁）各20例,采用免疫荧光标记流式细胞术检测外周血淋巴细胞CD28和CD95的水平;Annexin-v-FITC／PI双染色流式细胞术测定地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡。结果老年组：淋巴细胞凋亡率[（14．90±4．12）％]显著高于成年组[（8．12±3．12）％];CD28^＋CD95[（8．80±4．86）％]及CD28^＋[（36．31±10．38）％]均明显低于成年组[（23．09±3．48）％、（52．29±4．90）％],而CD28^-CD95^＋[（53．23±8．28）％]、CD95^＋[（80．25±7．19）％]及CD28^-[（63．69±10．38）％]明显高于成年组[（33．58±4．72）％、（63．18±4．12）％、（47．71±4．90）O];CD28^＋CD95^＋在两组间差异无统计学意义。淋巴细胞凋亡率与CD28（CD28^＋）呈负相关,与CD95（CD95^＋）呈正相关。结论老年人淋巴细胞凋亡率上升;CD28^＋表达下降,CD28^-、CD95^＋表达上升;淋巴细胞的凋亡率与CD28^＋、CD95^＋有相关性。提示老化导致老年人淋巴细胞凋亡增加,CD28和CD95的变化与淋巴细胞凋亡密切相关。     

慢性乙型肝炎患者外周血CD8~+T细胞CD95表达的研究

目的检测慢性乙型肝炎患者外周血CD8+T细胞CD95分子的表达水平,了解CD95分子表达与炎症进展的关系。方法采集37例慢性乙型肝炎患者及健康对照者外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs),用流式细胞术检测外周血CD8+T细胞CD95分子的表达情况。结果高病毒载量组和低病毒载量组CD8+T细胞CD95的表达均显著高于健康对照组(P0.05);CD95的表达及CD8+T细胞频率之间存在负相关关系(r=-0.3486)。结论慢性乙型肝炎患者CD95的高表达可能促进了CD8+T细胞的凋亡,使CD8+T细胞的抗病毒作用减弱,可能与HBV持续感染、慢性乙型肝炎的形成机制有关。     

胸腺瘤伴重症肌无力患者瘤组织中Bcl-2和Fas的表达水平

目的 探讨凋亡相关基因bcl-2、Fas在胸腺瘤伴重症肌无力患者瘤组织中的表达状况及其临床意义。方法经手术治疗的25例胸腺瘤伴重症肌无力患者的肿瘤组织标本为病例组，25例先天性心脏病患者手术时切取的正常胸腺组织标本为对照组，通过免疫组化的方法检测两组标本中Bcl-2和Fas蛋白的表达水平。结果胸腺瘤中Bcl-2及Fas表达水平均显著高于对照组，经Ridit分析两者差异均有统计学意义（U值分别为2．645、3．200，P均〈0．05），但Bcl-2和Fas的表达水平与胸腺瘤患者的重症肌无力Ossermen分型、术前病程、年龄及性别等临床因素均无显著相关。结论 Bcl-2和Fas在胸腺瘤伴重症肌无力的发病中可能具有重要作用。     

转铁蛋白受体介导的自杀基因转移系统的建立及其体外抗瘤效应

目的 构建转铁蛋白受体介导的自杀基因系统并观察其对肝癌细胞的体外杀伤效应。方法 SPDP法制备抗转铁蛋白受体与多聚赖氯酸(PLL)的复合物并用分子筛层析纯化。根据DNA阻断试验结果，pEBAF／tk重组质粒与Ab-PLL按1：6混合使二者结合形成PEBAF／tk—Ab PLL复合物。将此复合物转入人肝癌细胞株SMMC7721、HepG2和肺癌细胞株A549，并以脂质体转移为对照。加入不同浓度的更昔洛韦(GCV)以观察细胞的自杀效应。结果 加入GCV后HepG2／tk的增殖受抑制最明显。100mg／L和1mg／L时抑制率分别为60．5％和24．3％。SMMC7721／tk受抑制较低，而A549的增殖不受抑制。结论 本基因治疗体系具仃很好的靶向性和杀肿瘤效果。     

p27kip1基因诱导食管癌细胞凋亡实验研究

目的　探讨p2 7基因诱导人食管癌细胞凋亡的作用。方法　构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1,转移到培养的人食管癌细胞EC 970 6 ,用流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法观察Ad p2 7kip1诱导EC 970 6细胞凋亡的作用。 结果　成功构建重组体腺病毒Ad p2 7kip1,病毒滴度为 1.2 4× 10 12 CFU/ml,在感染倍数≥ 5 0感染强度时 ,即可达到 10 0 %的转导效率。Ad p2 7kip1转染食管癌细胞后 ,流式细胞术检测在G1期前出现亚倍体凋亡峰。细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯度。TUNEL法检测凋亡指数分别为 37.3± 3.4 (Ad p2 7kip1组 )及 1.3± 0 .2 (空白对照组 ) ,差异有显著性(P <0 .0 1)。结论　p2 7可有效诱导食管癌细胞凋亡 ,这一发现将在探索食管癌的基因治疗方面具有重要意义     

抑瘤素M的研究进展

动脉粥样硬化(AS)是心血管疾病重要的发病基础,是涉及多方面的复杂病理过程,主要病理机制是慢性血管炎症反应、平滑肌细胞增殖与迁移、细胞凋亡及新血管形成等,许多与炎症相关的标志物已被作为监测AS和心血管疾病风险的新靶点,其中抑瘤素M(OSM)在AS中的作用逐渐受到重视。现已证实OSM除了在黑色素瘤、肝脏再生和慢性炎症如风湿性关节炎、肺和皮肤炎性疾病中具有生物效应,在AS疾病中也发挥作用,本文对OSM在AS发生发展中的作用进行了综述。     

Fas／Apo-1（CD95）系统与大肠癌

Fas／Apo-1(CD95)系统与机体免疫和细胞凋亡(apontosis)关系十分密切,其诱导细胞凋亡的作用早在1991年就已被肯定。细胞凋亡是多细胞机体为调控机体发育,维护内环境稳定,由基因调控的细胞主动死亡过程。目前发现细胞凋亡不仅调节着细胞生长与更新的平衡稳定,而且在相关基因参与下与大肠癌的发生发展密切相关。现对Fas／FasL诱导细胞凋亡功能以及其与大肠癌的关系综述如下。     

脂质体人肿瘤坏死因子α基因体外转导人肝癌细胞基因表达的研究

目的研究人ＴＮＦα治疗基因在人肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞株表达的情况。方法采用ＤＮＡ介导基因转移技术中的脂质体介导法，将从人肝癌浸润性单个核细胞中提取构建的ｐＳＶＫ３－ＴＮＦαｃＤＮＡ以阳离子脂质体为中介转导人肝癌ＳＭＭＣ７７２１细胞。结果及结论细胞上清液中的ＴＮＦα在转导后１２小时开始升高，６０～８４小时达到峰值，２４～９６小时维持一较高的平台状水平，１０８小时开始回落，至１２０小时降至正常水平。空载体转导组与阴性对照组均未测到增高的ＴＮＦα。同时发现ｐＳＶＫ３－ＴＮＦα与阳离子脂质体不同结合比例影响ＴＮＦα基因的表达。     

干扰素—γ基因转导前后人肝癌细胞HepG1表型变化及基因表达图谱差异的研究

目的：比较人肝癌细胞经干扰素（IFN）-γ基因转导前后细胞表型及基因型图谱的差异。方法：①用扫描电镜、流式细胞仪等方法观察IFN－γ基因转导前后人肝癌细胞HepG1表型的变化;②应用微阵列膜片分别与未转导及转导了IFN－γ基因的HepG1mRNA进行杂交,同时设一团支书地空白载体LXSN的HepG1 mRNA与膜片杂交作为对照,比较杂交信号,获得表达差异的基因。结果：①IFN-γ基因转导的HepG1细胞生长速度减慢,表面绒毛结构数量增多,绒毛变细 ,变长,HLA I和Ⅱ类分子表达增高;②IFN-γ基因转导后,HepG1细胞有多种基因的表达发生变化,其中一些基因较未转导的IFN－γ时表达增高,一些较未转导的IFN－γ时表达减低。表达发生变化的基因主要为与细胞周期和细胞凋亡相关的基因。结论：IFN－γ基因修饰HepG1细胞后使细胞表型发生变化,并且在基因表达上也发生改变。运用微阵列技术为进一步了解这些基因的相互关系及其与肿瘤生物学行为的关系奠定了基础,也可为优化肿瘤免疫基因治疗提供线索。     

调控CD95的锤头状核酶抑制小鼠T细胞凋亡及杀伤活性的作用研究

供者淋巴细胞输注(DLI)在诱导移植物抗白血病(GVL)作用,治疗异基因造血干细胞移植(Allo HSCT)后复发等方面取得了可喜效果。研究表明供者T淋巴细胞可通过CD95CD95L途径杀伤白血病细胞,以诱导DLI后的GVL效用[1]。但在体内异常微环境及一系列细胞因子的作用下,白血病细胞表面可高