COL 2A1基因突变致SEDC的产前分子诊断

目的本研究对COL2A1基因（typeⅡcollagen gene）G504S突变导致的先天性脊柱骨骺发育不良（SEDC）家系的1例中期妊娠者进行产前分子诊断,从而预防SEDC的发生。方法患者妻于20孕周在B超下进行羊膜囊穿刺,抽取羊水10ml,提取羊水细胞基因组DNA。选择3个多态性STR位点,即D3S1358、D16S539和D21S11,排除母体细胞污染。在此基础上,对COL2A1基因外显子23进行扩增,PCR产物进行正、反向测序。结果该例胎儿COL2A1的外显子23测序结果显示,胎儿未带有与父亲同样的COL2A1基因突变。胎儿产前基因诊断结果与B超监测结果一致。结论对于有SEDC风险的胎儿进行产前分子诊断非常重要,可以在B超诊断前了解胎儿基因型并明确诊断。     

X-连锁无汗性外胚层发育不良一家系产前诊断

目的基因诊断方法及连锁分析对一X连锁无汗性外胚层发育不良（XLHED）家系进行产前诊断。方法提取患儿、患儿母亲外周血以及胎儿脐血中的基因组DNA,PCR扩增该疾病相关基因EDA的五个外显子,并直接测序;选择与该基因连锁的STR位点,位于基因上游的一个（CA）n进行家系内的连锁分析。结果患儿的基因突变未发现,连锁分析提示胎儿为男性未携带风险X染色体,出生后证实胎儿正常。结论基因检测及多态性连锁分析在XLHED家系中进行产前诊断是一种较好的方法。     

STR基因在胎儿21三体异常中的表达

目的探讨应用短串联重复序列（STR）基因对胎儿细胞进行21三体定性诊断的可行性。方法选择31例高风险胎儿及其双亲为对象，抽提羊水细胞基因组DNA，用聚合酶链反应扩增D21S1 411、D21S1414、D21S1412和D21S11位点的STR片段，并对其进行单链构象多态性分析，通过DNA密度扫描定量分析特征诊断21三体。以脐带血染色体G显带核型分析为对照。结果本法可以通过检测STR片段DNA密度扫描定量分析来诊断21三体。应用谊基因诊断方法鉴别出21三体的胎儿9例，其诊断结果与细胞遗传学核型分析结果相符。结论STR基因的聚合酶链反应一单链构象多态性分析技术是一种简单、快速和可靠的21三体定性基因诊断技术，可应用于21三体的微创基因诊断和遗传筛查。     

应用绒毛细胞进行汉族胎儿9个STR基因座遗传多态性研究

目的了解应用绒毛细胞进行D3S1358、D13S317、vWA、D21S11、D18S51、FGA、D5S818、D7S820、D8S1179等9个STR基因座在汉族胎儿的遗传多态性分布及其在法医学和产前基因诊断的应用价值.方法采用复合荧光标记扩增技术,用绒毛细胞和部分蜕膜细胞对上述9个STR基因座进行分型;扩增产物用ABI-310DNA序列分析仪电泳检测;数据分析统计采用ABI-GeneScan3.1、ABI-Genotype4.0软件和χ2检验.结果(1)所有绒毛和蜕膜样本复合扩增成功,没有相互间的污染.(2)获得了绒毛细胞上述9个STR基因座的基因频率分布资料.(3)绒毛细胞和外周血细胞的9个STR基因座的等位基因频率无显著性差异(P＞0.05).结论用绒毛细胞进行上述9个STR基因座的多态性分布研究是可行的,所得到的基因频率数据可为产前亲子鉴定和产前基因诊断提供依据.     

一个中国家族性低钾型周期性麻痹家系中的CACNA1S基因R1239H突变

目的筛查家族性低钾型周期性麻痹（hypokalaemic periodic paralysis，HOKPP）相关基因突变位点，总结该病基因型和临床表型的相关性。方法应用PCR和DNA测序技术，对1个HOKPP家系（包括2例患者共11名成员）进行候选基因CACNA1S和SCN4A的筛查，并总结该家系患者的临床特点。结果此家系的2例患者符合HOKPP的诊断标准，突出特点为：儿童期发病，青春期加重，成年后病情减轻；女性在月经前期好发，而妊娠期无发作；钾剂和乙酰唑胺治疗有效。DNA测序结果发现2例患者的CACNA1S基因第30外显子上均存在3716（G→A）杂合突变，导致氨基酸序列改变R1239H，家族其他成员未见此突变。结论中国家族性HOKPP存在CACNA1S基因R1239H突变。     

五个脊肌萎缩症高风险胎儿的产前诊断

目的对5名生育过脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)患儿的妇女当前所怀胎儿进行产前诊断。方法超声监视下行羊膜腔穿刺术抽取羊水。离心后直接从沉渣中提取胎儿基因组DNA。采用短串联重复序列位点检测法排除母体基因组DNA污染。常规PCR扩增胎儿SMN基因第7外显子。PCR产物经DraⅠ酶切后,行琼脂糖凝胶电泳。通过位点特异性PCR扩增SMN1和SMN2的第7外显子。结果比较各胎儿与父母的16个短串联重复序列位点,未见羊水DNA受母体DNA污染迹象。常规PCR中,胎儿A、C、D的PCR产物(189bp)仅有部分可被DraⅠ切割,而胎儿B、E的PCR产物全部被DraⅠ切割。在位点特异性PCR中,胎儿A、C、D既有SMN1、也有SMN2的第7外显子扩增产物,而胎儿B、E只有SMN2的第7外显子扩增。结论胎儿A、C、D未见SMN1纯合性缺失,出生后患SMA的风险极小;胎儿B、E为SMN1纯合性缺失,出生后患SMA的风险极大。     

葡萄糖6磷酸酶基因热点突变检测结合1176多态位点连锁分析快速产前诊断Ia型糖原累积病

目的探讨中国人Ⅰa型糖原累积病简便、快速、准确的产前诊断方法。方法通过限制性内切酶图谱分析了葡萄糖6磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)基因727G→T和R83H的突变，并结合1176位点单核苷酸多态性连锁分析，对3个Ⅰa型糖原累积病家系进行了基因诊断和产前诊断。对发现的突变及1176位点多态性用DNA测序证实。结果3个家系先证者G6Pase基因的2个等位基因均携带727G→T突变，分别来自其父母。家系1和3胎儿为727G→T突变杂合子；家系2胎儿不携带该突变。1176位点单核苷酸多态性分析显示，3名胎儿1176位点单核苷酸多态性与3名先证者不同。DNA直接测序结果与限制性内切酶图谱分析结果相符。家系1和家系2胎儿已出生，井证实与产前诊断结果相符。结论通过限制性内切酶酶切法筛查727G→T和R83H突变结合1176位点单核苷酸多态性连锁分析可简便、快速、准确地诊断和产前诊断Ⅰa型糖原累积病。     

一个遗传性痉挛性截瘫家系的全外显子测序分析及产前诊断

目的对一个常染色体显性遗传性痉挛性截瘫(hereditaryspasticparaplegia,HSP)家系进行全基因组外显子测序分析,找出致病的基因突变位点。方法收集一个遗传性痉挛性截瘫家系,提取先证者、先证者父母的DNA进行全外显子组捕获和测序,锁定候选基因致病位点,针对变异位点在该家系6名患者和9名正常人中进行Sanger测序验证,然后通过羊水穿刺和Sanger测序进一步对1例胎儿羊水进行产前诊断。结果该家系中6例病人均在ATL1基因的同一位点处发生突变(c.715CT,p. R239C),家系中9例正常人和1例胎儿羊水中均未发现该突变。结论应用全外显子测序技术对遗传性痉挛性截瘫家系进行诊断,明确致病位点,有助于该家系的遗传咨询和产前诊断。     

应用二代测序对成骨不全家系进行基因突变检测和产前诊断

目的应用全外显子测序技术对一个成骨不全(Osteogenesisimperfect,OI)家系进行分子遗传学检测,确定致病基因,实现该家系的基因诊断及产前诊断。方法对1个成骨不全家系先证者进行全外显子检测,采用生物信息软件对变异位点进行过滤和注释,利用SIFT和Polyphen-2软件对突变位点进行致病分析,预测致病性,结合临床特征,确定患者的致病突变。对先证者及家系其他成员进行Sanger测序验证。抽取脐血,进行产前基因诊断,采用STR法,进行母血污染鉴定,避免因母血污染而导致的误诊。结果通过数据的对比过滤,最终选定COL1A2基因的杂合突变c.4048GA(p.Gly1350Ser)为可疑致病突变,经SIFT和Polyphen-2预测,该突变位点为有害。经Sanger测序证实,该家系的患者均携带该突变位点,家系中正常成员则无此突变。对脐血进行检测,胎儿亦携带该突变位点。结论应用全外显子测序技术对成骨不全家系进行诊断,明确了该家系的基因致病位点,有助于家系的遗传咨询及产前诊断。本研究结果也进一步丰富了COL1A2的突变谱。     

应用短串联重复序列快速诊断21三体

目的　采用聚合酶链反应 -单链构象多态性技术 ,对短串联重复序列 (short tandem repeat,STR)进行分析 ,探讨应用串联重复序列信息进行 2 1三体定性诊断的可行性。方法　以染色体 G显带核型分析为对照 ,选择 19例 2 1三体阳性患儿和 3例高风险胎儿及其双亲为对象 ,抽提基因组 DNA,用聚合酶链反应扩增 D2 1S14 11和 D2 1S11位点的 STR片段 ,并对其进行单链构象多态性分析 ,通过电泳带型特征诊断 2 1三体。结果　本法可以通过检测三条染色体的 STR片段电泳带型来诊断 2 1三体。应用该基因诊断方法分析了 2 2例 2 1三体患儿 ,除 1例患儿的 D2 1S11电泳谱带与父母的电泳条带完全相同不能诊断外 ,其他病例的 D2 1S14 11和 D2 1S11位点的诊断结果与细胞遗传学核型分析结果相符 ,其中 3例孕中期高风险胎儿的分析结果被流产样品的核型分析所证实。结论　基于短串联重复序列的聚合酶链反应 -单链构象多态性分析技术是一种简单、快速和可靠的 2 1三体定性基因诊断技术 ,可应用于 2 1三体的基因诊断和遗传筛查。     

Rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 by real-time quantitative polymerase chain reaction with amplification of small tandem repeats and S100B in chromosome 21

Trisomy 21 (Down syndrome) is the most common congenital anomaly, and it occurs in one out of 700-1000 births. Current techniques such as amniocentesis and chorionic villi sampling (CVS) require lengthy laboratory culture procedures and high costs. This study was undertaken to establish a rapid prenatal diagnosis of trisomy 21 using real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) of fetal DNA from amniotic fluid. Real-time quantitative PCR was performed with DNA templates obtained from 14 normal blood samples, 10 normal amniotic fluid samples, 14 Down syndrome blood samples, and 7 Down syndrome amniotic fluid samples. Primers for D21S167 and S100B of chromosome 21 were used. Primers that direct the amplification of the 165-bp fragment of the insulin-like growth factor (IGF)-1 gene on chromosome 12 using a PCR primer were included to generate an internal standard for quantitation. The relative levels of D21S167 and S100B were 2.6 and 2.4 times higher in the blood of Down syndrome patients than those in the control group. The differences between these two groups were statistically significant (p-values were 0.0012 and 0.0016, respectively). The relative levels of D21S167 and S100B were 2.1 and 2.7 times higher in the amniotic fluid of Down syndrome fetuses than those in the control group. The difference between these two groups was statistically significant (p-values were 0.0379 and 0.0379, respectively). Prenatal diagnosis of trisomy 21 by real-time quantitative PCR using STR (small tandem repeats) amplification of D21S167 and S100B is a useful, accurate and rapid diagnostic method. Furthermore, it may also be useful for prenatal diagnosis with fetal DNA from maternal blood, and for preimplantation genetic diagnosis and prenatal counseling.     

Application of quantitative fluorescencet -PCR in the prenatal diagnosis of chromosomale aneuploidiesCSCD

Objective To assess the accuracy of quantitative fluorescence PCR (QF-PCR)for the detection of fetal chromosomal aneuploidies and its values for prenatal diagnosis. Methods QF-PCR and chromosomal karyotyping were used to analyze 6066 amniotic fluid samples derived from 6034 pregnant women. Results Both QF-PCR and karyotyping analysis have detected 135 cases of fetal aneuploidies involving chromosomes 21, 18, 13, X, and Y. The QF-PCR assay was also successful in 67 cases for which amniotic fluid culture has failed. Furthermore, it has identified maternal cell contamination in 7 cases. By determining the consistency of short tandem repeat (STR) sites, the QF-PCR assay has identified 22 dizygotic twins among 32 twins with double chorions and double amniotic sacs. In 12 cases, it has signaled numerical chromosomal aberration by critical or partial abnormal values for the fluorescence peak area ratio, which were verified by karyotyping analysis as mosaicisms of chromosome aneuploidies. Conclusion The QF-PCR can provide an useful supplement for chromosomal karyotyping and has an important role in rapid prenatal diagnosis. © 2018 West China University of Medical Sciences. All rights reserved.     

荧光定量PCR产前快速诊断唐氏综合征

目的探索荧光定量PCR方法在产前快速诊断唐氏综合征中的作用。方法收集65例妊娠20~24w,进行羊水穿刺胎儿细胞培养染色体核型分析的胎儿羊水,采用荧光定量PCR技术对标本D21S11位点进行PCR扩增、检测,并与染色体核型分析的结果进行对照分析。结果65例未培养羊水标本经过荧光定量PCR检测,发现2例唐氏综合征,显示1:1:1三条或2:1两条D21S11位点等位基因带,63例显示1:1两条带;与细胞培养染色体核型分析的结果基本一致。结论荧光定量PCR技术具有检测速度快、需要模板量少,检测结果准确等特点,可用于染色体异常的产前快速诊断。     

孕妇外周血中胎儿短串联重复序列基因型的检测

目的探讨利用孕妇血浆中胎儿DNA进行遗传病产前基因诊断的可行性。方法应用9个具有高度多态性的短串联重复序列（short tandem repeat，STR）位点，以多重荧光PCR方法对10名健康孕妇孕早、中、晚期共30份血浆标本和非孕期血浆标本中DNA进行STR等位基因扩增。同时检测孕妇丈夫的外周血本，然后进行基因扫描及对照分析，判断胎儿父源性等位基因在孕妇血浆中的检出情况。结果10名孕妇均足月分娩，男婴3名，女婴7名。10名孕妇血浆中均检出胎儿父源性等位基因，即胎儿DNA。30份孕期血浆标本中有23份检出胎儿DNA，其中孕早期标本6份（6／10）；孕中期标本8份（8／10）；孕晚期标本9份（9／10）。7份标本未见到胎儿DNA。结论应用多重荧光PCR方法对孕妇血浆中DNA进行SFR多态化点的复合扩增，可获得男性和女性胎儿DNA信息，可用于无创伤性产前诊断。     

QF-PCR技术应用于孕早期宫颈脱落滋养细胞产前诊断的研究

目的探讨采用定量荧光PCR技术复合扩增多个短串联重复序列(STR)对孕早期妊娠妇女宫颈管内的胎儿脱落滋养细胞进行染色体异常无创性产前诊断方法的价值。方法收集80例人工流产孕妇宫颈内口冲洗液,提取冲洗液中的DNA,分别针对21号、X、Y染色体上7个位点和13号、18号染色体上8个位点应用QF-PCR方法进行复合扩增检测并分析结果。对人流后的绒毛采用常规染色体核型分析确定染色体状态。结果 80例滋养细胞样本中,69例扩增成功,并准确检出样本的性别及染色体。20例检出核型正常,其他样本存在母体细胞污染。结论应用QF-PCR扩增对经宫颈获取的胎儿滋养细胞进行染色体异常的诊断,为孕早期无创性产前诊断提供了一个可能途径,但应采取更有效的措施富集胎儿滋养细胞,避免母体细胞污染。     

STR新位点产前诊断21、18、13三体综合征

目的短串联重复新位点D13S252、D13S305、D13S628、D13S325,D18S390、D18S819、D18S978、D21S1409、D21S1435在产筛高危孕妇中产前诊断21、18、13三体。方法选择产前血清学筛查高危和或胎儿B超异常100例孕妇羊水和脐血样本为研究对象,包含上述位点的单管多重体系检测21、18、13三体,PCR产物测序检测,Gene MapperID3.2软件分析处理。计算体系中各位点杂合度和多态信息含量。结果 97例扩增,检测出25例染色体非整倍体,包括18例21-三体,6例18-三体,1例13-三体,和72例正常二体,3例扩增失败。所有结果与染色体核型分析相符。体系中各STR位点的等位基因数4～14个,H为0.61～0.88,PIC为0.556～0.870。新位点的PIC为0.575～0.793,均0.5。21号染色体联合使用4个以上STR位点,18号染色体5个以上位点检出率才能达100%。结论上述STR新位点杂合度和多态信息含量高,可用于21、18、13三体产前诊断。     

COL1A1/COL1A2基因突变分析与成骨不全的产前基因诊断

目的对有成骨不全(Osteogenesis Imperfecta,OI)孕史的患者,进行系统B超及COL1A1/COL1A2基因检测,希望建立OI患儿产前诊断方案,为OI患儿进行产前诊断提供技术保障。方法对于有OI孕史的孕妇,进行系统B超监测;根据胎儿股骨、长骨的超声影像学表现,初诊为成骨不全。抽取羊水,采用直接测序法对羊水DNA的COL1A1和COL1A2基因全编码外显子及启动子区域进行突变位点检测。检出的新突变,对孕妇夫妇及家系其他成员直接测序证实。产前诊断标本均需做母血污染鉴定。结果胎儿超声影像学表现为股骨短小,胫腓骨弯曲成角,颅骨变薄且发现多处骨折,考虑OI。STR法鉴定,羊水无母血污染。DNA序列分析结果显示COL1A1基因鉴定出19个SNP位点,没有鉴定出突变位点;COL1A2基因鉴定出13个SNP位点及第36外显子的第2180位置碱基发生错义突变位点(c.2180G>A,p.Gly727Asp)。孕妇在COL1A2基因的第36外显子亦存在错义突变位点(c.2180G>A,p.Gly727Asp),但其临床特征不一致。其他成员均未检测到Gly727Asp突变。结论有OI孕史的孕妇,采取B超和COL1A1/COL1A2基因诊断技术,可以快速、有效对高危胎儿做出确诊,为预防患病胎儿出生提供技术保障。     

Tissue typing amniotic fluid cells: potential use for detection of contaminating maternal cells.

The presence of contaminating maternal cells in amniotic fluid is an important, though infrequent, cause of error in karyotyping the fetus. A method of detecting contaminating maternal cells in amniocentesis specimens by determining the HLA phenotype of the cells of amniotic fluid and the mother is described. Tissue typing of 15 amniocentesis specimens was performed, and in 14 cases the fetal origin of the cells was established. In one case, the results of tissue typing suggested maternal cell contamination, though this had not been suspected from chromosome studies of the amniotic fluid cell cultures. Other possible uses for tissue typing of amniotic fluid specimens for prenatal diagnosis are also described.