免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定

目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫ｃＤＮＡ文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫ｃＤＮＡ文库基因的ＰＣＲ产物和ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接,转染大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ,经抗生素及呈色底物Ｘ－ｇａｌ粗筛,再用限制性内切酶及ＰＣＲ方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中４个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中,获得４个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。     

日本血吸虫混合DNA疫苗的构建

构建「日本血吸虫混合ＤＮＡ疫苗，为今后多抗原特异ＤＮＡ轩的研究打下基础。在克隆ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ－Ｓｊ２３，ｐＢｌｕｅｓｅｒｉｐｔ Ｓｊ２６，ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－３２的基础上，亚克隆构建了真核表达载体ｐＢＫ－２Ｊ２３，ｐＢＫ－Ｓｊ２６，ｐＢＫ－Ｓｊ３２。经过酶切鉴定，ＰＣＲ扩增鉴定及测序后，将此三种不同抗原质粒经不同组合后经肌肉注射免疫小鼠。３周后提取小凤四头肌ＤＮＡ，特异性引物扩增获得目     

人白细胞介素—2基因真核表达载体pDORIL—2的构建

构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体。方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆入表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ。结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆入ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲ     

人白细胞介素－2基因真核表达载体pDORIL－2的构建

目的：构建逆转录病毒载体介导的人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的聚合酶链式反应（ＰＣＲ）引物，用ＰＣＲ方法从质粒ｐＨＩＧ５３中扩增出人的ＩＬ－２ｃＤＮＡ，将其定向克隆人表达载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ．结果：ＰＣＲ扩增出的ＩＬ－２ｃＤＮＡ片段约４７５ｂｐ，酶切鉴定该片段已被克隆人ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的多克隆位点，构建成人ＩＬ－２基因真核表达载体ｐＤＯＲＩＬ－２．结论：用ＰＣＲ扩增目的基因片断，有快速、获得量大、可改变酶切位点等优点；ｐＤＯＲＩＬ－２的构建成功，为开展基因治疗的研究打下了基础。     

三种方法对日本血吸虫抗原cDNA克隆的筛选和鉴定

利用融源表达、平板裂解法和PCR扩增三种不同方法分别对日本血吸虫抗原cDNA基因进行鉴定和分析,8个免疫筛选阳性克隆均能在大肠杆菌中以融合蛋白的形式表达,表达蛋白分子量为140～150kDa,抗原cDNA基因经限制性内切酶EcoRI酶解后,琼脂糖凝胶电泳显示其大小为700～900bp,PCR能扩增出特异性条带。结果表明,上述三种方法能从蛋白质和核酸水平有效地鉴定血吸虫抗原cDNA基因。     

日本血吸虫铁蛋白基因的筛选,克隆与表达

采用Ｓｊ未成熟虫卵抗原超免疫兔血清对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行筛选，并对可能具有抗日本血吸虫生殖／卵胚发育潜能的抗原汾子进行克隆，表达。常规法免疫筛选Ｓｊ成虫文库，获得单个阳性克隆，ＰＣＲ扩增后琼脂糖电泳测定基因大小，ＤＮＡ测序，基因库搜索，找出同源基因。共鉴定出６个不同的基因克隆，选择其中的铁蛋白基因亚克隆于ｐＧＭＣ载体，重组蛋白以ＧＭＣＳＦ（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）－ＳｊＦｅｒ融合蛋白的形成     

人CD80基因的cDNA克隆及其在肿瘤细胞中的表达

采用巢式ＰＣＲ的方法从Ｒａｊｉ细胞中扩增出人ＣＤ８０ ｃＤＮＡ，并将这一ｃＤＮＡ克隆入载体ｐＵＣ１９中，经ＰＣＲ扩增和限制性酶切分析，进行初步鉴定后，再将入ＣＤ８０ｃＤＮＡ克隆到ｐｃＤＮＡ表达载体上，构建成ｐＣＤ－ＣＤ８０重组质粒。应用脂质本介导的基因转移技术将这一表达载体导入小鼠黑色素瘤Ｂ１６细胞后，用ＳＡＢＣ法进行瞬时表达的检测。结果表明，转染后４８ｈ就具有明显人ＣＤ８０基因的表达产物。     

日本血吸虫铁蛋白基因的筛选、克隆与表达

采用Ｓｊ未成熟虫卵抗原超免疫兔血清（ＲＡＳｊＩＥＡ）对Ｓｊ成虫ｃＤＮＡ文库进行筛选，并对可能具有抗日本血吸虫生殖／卵胚发育潜能的抗原分子进行克隆、表达。常规法免疫筛选Ｓｊ成虫文库，获得单个阳性克隆，ＰＣＲ扩增后琼脂糖电泳测定基因大小，ＤＮＡ测序，基因库搜索，找出同源基因。共鉴定出６个不同的基因克隆。选择其中的铁蛋白（ＳｊＦｅｒ）基因亚克隆于ｐＧＭＣ载体。重组蛋白以ＧＭＣＳＦ（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）－ＳｊＦｅｒ融合蛋白的形式在细菌中高效表达。表达产物仅溶于８Ｍ尿素溶液中，分子量为４０ｋＤ。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

日本血吸虫表面膜抗原23KDa的克隆及其鉴定

根据已报道的２３ＫＤａ基因序列，设计了２个寡核苷酸引物，应用聚合酶链反应技术，将提取的日本血吸虫成虫的总ＲＮＡ逆转录成ｃＤＮＡ进行扩增（ＲＴ－ＰＣＲ）。扩增的基因克隆到质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中，重组质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１，在ＬＢ（Ａｍｐ＋）平板上挑阳性克隆经酶切分析，ＰＣＲ扩增及测序鉴定等含完整２３ＫＤａ基因的重组质粒     

人p27和p15基因表达重组体的构建

周期素依赖性激酶抑制蛋白（ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐｒｏ－ｔｅｉｎ，ＣＫＩ），如ｐ２７和ｐ１５基因是抑癌基因的候选基因。作者通过ＰＣＲ方法获得含人ｐ２７全部编码区域的ｐ２７ｃＤＮＡ片段，并用ＰＣＲ产物ＴＡ克隆法，将其构建在真核表达载体ｐＣＲＴＭ３中；用常规酶学方法，通过ＥｃｏＲＩ和ＸｈｏＩ双酶切位点，将人ｐ１５ｃＤＮＡ片段克隆入ｐＣＲＴＭ３载体。重组体的鉴定通过限制酶图谱分析进行。人ｐ２７和ｐ１５基因真核表达重组体的构建为进一步研究其功能打下基础。     

日本血吸虫26ku谷胱甘肽硫—转移酶基因的克隆及分析

目的 扩增日本血吸虫２６ｋｕ谷胱甘肽硫－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因片段,构建其重组原核载体,以研制ＳｊＧＳＴ重组克隆。方法 根据已知基因序列设计一对引物,运用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增Ｓｊ２６ＧＳＴ目的基因ｃＤＮＡ片段,将其克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）质粒中,并经酶切、ＰＣＲ和测序鉴定。结果 获得ＧＳＴ－ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＫＳ）重组克隆。结论 本实验获得Ｓｊ２６ＧＳＴ重组克隆,为进一步研     

尿激酶受体反义RNA表达质粒的构建

目的 构建能在哺乳动物细胞中表达尿激酶受体（ｕＰＡＲ）反义ＲＮＡ的表达质粒ｐＵＲＡＳ。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增并克隆尿激酶受体（ｕＰＡＲ）ｃＤＮＡ５’端－４６￣４５４ｂｐ一段为５００ｂｐ的顺序，利用ＤＮＡ重组技术将该片段反向插入表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游。结果 限制性内切酶分析和ＤＮＡ顺序分析证实ＲＴ－ＰＣＲ获得ｕＰＡＲ ｃＤＮＡ片段与文献报道相吻合；重组质粒ｐＵＲＡＳ转染肺癌细     

日本血吸虫大国大陆株副肌球蛋白编码基因的PCR扩增

根据已知的日本血吸虫菲律宾株的副肌球蛋白分子的部分ｃＤＮＡ序列，设计两对寡核苷酸引物（引物１／２和引物３／４），以聚合酶链式反应（ＰＣＲ），用引物１／２从本室两个日本血吸虫中国大陆株ｃＤＮＡ库中均扩增出与预期大小（９２７ｂｐ）一致的特定ＤＮＡ片断。巢式ＰＣＲ－以第一扩增产物为模板，用引物３／４扩增出约５０００ｂｐ的单一条带，与预期片段（４９４ｂｐ）大小一致。表明ＰＣＲ产物为编码副肌球蛋白的目的基因     

Epstein—Barr病毒DNA多聚酶基因扩增和表达载体构建

目的 扩增Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）ＤＮＡ多聚酶基因，构建高效表达载体。方法 根据ＥＢＶ全基因序列，在ＥＢＶ ＤＮＡ多聚酶基因的３’、５’端设计一对附加ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切位点的特异性引物，以Ｂ９５－８细胞ＤＮＡ为模板，采用改良ＰＣＲ方法扩增出ＥＢＶ ＤＮＡ多聚酶基因（３０４４ｂｐ）。用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切该基因片断并克隆有达载体ｐＭＡＬ－ｐ２，采用蓝白斑试验筛先阳性菌落。     

反转录—聚合酶链反应在呼吸道合胞病毒感染检测的应用

为呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）感染的临床诊断寻求敏感，特异的检测方法，采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增毒培养液和急性呼吸道感染患者鼻咽分泌物中的ＲＳＶ基因，并应用地高辛标记ｃＤＮＡ探针对扩增产物进行鉴定。结果成功地提取了ＲＳＶｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经扩增得到４７１ｂｐ左右ｃＤＮＡ区带。流感病毒Ｂ，副流感病毒２型，腺病毒７对照无扩增带，ＲＳＶ培养液１０倍连续稀释至１：１０００，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增仍可见４     

L—色氨酸酶基因工程菌的构建

应用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ－１２染色体ＤＮＡ中扩增出长约１．４ｋｂ的Ｌ－色氨酸酶基因，将其插入到高表达载体ｐＴｒｃ９９Ａ的Ｎｃｏｌ／ＨｉｎｄⅢ位占中，转化宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０５。经质粒大小比较和酶切鉴定，筛选出重组质粒。     

人神经营养素-4的克隆及其在原核细胞的表达

目的：体外扩增人神经营养素－４（ＮＴ－４）基因,经克隆后在原核细胞中表达并鉴定人重组ＮＴ－４,为研究其生物学特性及临床应用奠定基础。方法：以人类基因组ＤＮＡ为模板,扩增ＮＴ－４成熟活性蛋白ＤＮＡ编码序列,将此ＤＮＡ片段克隆到载体ＰＢＶ２２０中,对重组质粒进行ＰＣＲ筛选和限制性酶切分析,确定后将该重组质粒转化到大肠杆菌ＤＨ５α进行诱导表达。用抗ＮＴ－４抗体进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定重组蛋白。结果：体外成功扩增ＮＴ－４基因,转染的大肠杆菌经诱导后表达出能被抗ＮＴ－４抗体识别的重组蛋白,其表达量为１５％。结论：在原核细胞能成功表达ＮＴ－４。     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

乙肝病毒PCR产物的鉴定及单项抗HBc阳性血清的HBV基因扩增

本文报道ＨＢＶ基因扩增产物的限制性酶切分析和寡核苷酸探针杂交鉴定、应用血清ＨＢＶＤＮＡ的ＰＣＲ扩增产物制备基因探针和单项抗ＨＢｃ阳性血清的ＨＢＶ基因扩增。ＰＣＲ用ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ３种亚型ＨＢＶ的Ｃ基因区共有序列为内外两对引物分单次或套式扩增，产物为６６ａｂｐ或４２８ｂｐ，两者序列中段共含－ＢｇＩⅡ酶切点并与一寡核苷酸探针同源。４２８ｂｐ产物被用以缺口平移标记３２Ｐ探针作斑点和转印杂交检测。结合分子杂交的ＰＣＲ结果从单项抗ＨＢｃ阳性的８／４２例慢性肝炎和２／１２例无症状受测者血清中检出ＨＢＶＤＮＡ，证实病毒低度复制和传染性。