杆状病毒splt MNPV S1136基因的克隆，表达及其产物功能

计算机分析斜纹夜蛾核多角体病毒 (ＳｐｌｔＭＮＰＶ)基因组序列 ,发现第 136个读码框基因表达产物具有病毒囊膜蛋白的基本特征 .计算机预测的ＳＬ136蛋白氨基酸序列Ｎ端具有信号肽 ,Ｃ端具有跨膜区 ,Ｎ端区还有一个许多病毒融合蛋白共有的卷曲螺旋结构 .通过ＰＣＲ扩增 ,我们克隆了Ｓ1136基因并分别构建了原核表达载体ｐＢＶＳ1136及重组病毒表达载体 .ＳＤＳ -ＰＡＧＥ结果表明Ｓ1136基因在大肠杆菌和昆虫细胞中均获得了较高的表达 .另外 ,我们还构建了一个瞬时表达载体ｐＵＣＳ1136 ,单独转染Ｓｌ-ｚｓｕ - 1细胞后 ,低ｐＨ值环境可诱导…     

6种真核表达质粒作为HBV-DNA疫苗免疫小鼠的研究

将编码ＨＢＶ表面抗原的Ｓ基因分别克隆到 6种不同的真核表达质粒上 ,包括两种真核质粒载体 (ｐｃＤＮＡ3.1,ｐＣＩ ｎｅｏ) ,两种逆转录病毒载体 (ｐＸＴ1,ｐＬＸＳＮ)和两种ＥＢ病毒载体 (ｐＣＥＰ4,ｐＭＥＰ4) ,构建不同的真核表达重组体 ,经酶切鉴定符合要求。将重组体用电转染法导入人肝癌细胞系ＨｅｐＧ2获得稳定分泌ＨＢｓＡｇ的抗性细胞系。不同重组体表达ＨＢｓＡｇ的滴度 ,以逆转录病毒重组基金项目 :国家自然科学基金资助项目(36930 2 80 ,3957660 )作者单位 :重庆医科大学肝病研究所通信作者 :叶珈 30 0 0 70天津医科大学免疫教…     

乙肝病毒X基因真核表达载体的构建及其表达

目的　为探讨 Ｈ Ｂ Ｖ Ｘ 基因在肝细胞癌（ Ｈ Ｃ Ｃ） 中的致瘤机理提供实验模型。方法　用限制性内切酶从ｐ Ｅｃｏｂ６ 上切下 Ｘ 基因读码框,克隆到ｐ Ｂ Ｋ Ｓ＋ 上,再将 Ｘ 片段插入ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ 的 Ｈｉｎｄ Ⅲ和 ＮｏｔⅠ位点间。将重组载体（ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ Ｘ） 和空载体（ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４） 导入肝癌细胞株 Ｈｅｐ Ｇ２ 中,潮霉素选择培养, Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 鉴定其稳定表达。结果　构建的ｐ Ｃ Ｅ Ｐ４ Ｘ 质粒在 Ｈｅｐ Ｇ２ 细胞中有稳定表达。结论　本实验为进一步探讨 Ｈ Ｂ Ｖ Ｘ 基因在 Ｈ Ｃ Ｃ 中的致瘤机理提供了理想的实验细胞株。     

中国株HGV NS3 区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的研究ＨＧＶＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法将中国株ＨＧＶＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴＢ和ｐＲＳＥＴＣ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ、Ｐ３和Ｐ４的分子量分别为４２０００,３００００和２４０００,在Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ反应中均可被ＨＧＶ阳性血清识别,其中ＨＧＶＮＳ３区Ｎ端的基因产物抗原性较强。结论中国株ＨＧＶＮＳ３区的Ｎ端存在优势的抗原决定簇,其基因产物有较好的抗原性。     

丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

目的 从感染ＨＣＶ的中国患者血清中扩增编码ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶的ｃＤＮＡ,在大肠杆菌中进行表达。方法 从血清中提取ＨＣＶ ＲＮＡ,应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶ｃＤＮＡ,Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终引法测定其序列,与ｐＢＶ２２０载体构建重组粒,在大肠杆菌中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ分析重组蛋白。结果 用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增得到了ＨＣＶ丝氨酸蛋白酶基因,序列分析表明其读码框架     

中国株HGV NS3区基因的原核表达及其产物的抗原性分析

目的 研究ＨＧＶ ＮＳ３区基因产物的抗原性,并探讨ＮＳ３蛋白在血清学检测中的应用。方法 将中国株ＨＧＶ ＮＥ３区的３个基因片段分别克隆到ｐＲＳＥＴ Ｂ和ｐＲＳＥＴ Ｃ质粒载体中,构建成原核表达载体。ＩＰＴＧ诱导下,在大肠杆菌ＢＬ２１中高效表达,获得３个重组蛋白,用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和ＥＬＩＳＡ法分别对表达产物进行分析。结果 所构建的表达载体均得到高效表达,得到的重组蛋白ＰＡ,Ｐ３和Ｐ４的分子     

狂犬病毒3aG株糖蛋白基因在人5型重组腺病毒中的表达研究

目的 构建表达狂犬病毒糖蛋白基因（ＧＰ）的重组人腺病毒。方法 克隆狂犬病毒疫苗株ＧＰ基因并测序，将其插入Ｅ３区缺失的Ａｄ５载体，置于Ｅ３区早期启动子的控制下，通过同源重组，蚀斑纯化，筛选表达ＧＰ的重组人腺病毒。用ＥＬＩＳＡ法检测表达的糖蛋白，快速荧光灶抑制试验（ＲＦＦＩＴ）法测定此重组病毒免疫小鼠后产生的中和抗体。结果 获得的３ａＧ株基因的开放读码框为１５７５个核苷酸，编码５２４个氨基酸；经同源重     

HMGI高表达促进单核细胞PDGF-B链基因转录

血管内皮细胞与循环血细胞 ,如单核细胞之间的相互作用 ,在动脉粥样硬化等重要心血管疾病发生和发展过程中具有极其重要的意义。众多的动脉粥样硬化相关因素也同时作用于这些细胞。我们曾发现高迁移率蛋白Ⅰ (ＨＭＧⅠ )能促进ＥＣＶ30 4细胞核转录因子ＮＦ -κＢ与ＰＤＧＦ -Ｂ链基因上游切应力反应元件 (ＳＳＲＥ)的结合。目的 :观察在整体细胞水平 ,ＨＭＧＩ对单核细胞系Ｕ937细胞ＰＤＧＦ -Ｂ链基因转录的影响及蛋白激酶Ｃ磷酸化的调节作用。方法 :( 1 )利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ重组技术构建正义和反义ＨＭＧＩ表达载体 ;( 2 )脂质体法将…     

抗CD3嵌合抗体片段Fab′突变体的表达和生物活性研究

本实验室已构建的抗ＣＤ3单抗片段表达量较低 ,不利于今后的研究和应用。为此我们参照ＰＤＢ文库和有关文献 ,对抗ＣＤ3单链抗体 (ＳｃＦｖ)重链基因第 6位 (Ｇｌｕ Ｇｌｎ)和第 10 5位 (Ｃｙｓ Ｓｅｒ)氨基酸进行定点突变 ,同时轻链第 5位发生随机掺入的同义突变 (Ｔｈｒ Ｔｈｒ) ,使产量有了显著提高。以该ＳｃＦｖ表达载体为模板 ,ＰＣＲ扩增抗ＣＤ3单抗重链可变区 (ＶＨ)和轻链基金项目 :国家“863”高科技基金资助项目 (863 1 0 2 0 9 0 3 0 3)作者单位 :30 0 0 2 0天津 ,中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重…     

蓝舌病毒两外壳蛋白VP2和VP5在昆虫细胞中的表达 …

目的 研究蓝舌病毒（ＢＴＶ）ＶＰ２与ＶＰ５的免疫学特性,为ＢＴＶ基因工程疫苗研究和病毒样颗粒装配打下基础。方法 将ＢＴＶ１０ ＶＰ２和ＶＰ５基因分别插入杆状病毒表达载体ｐＦａｓｔＢａｃ１,转染昆虫细胞获得重组杆状病毒。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测重组杆状病毒对ＶＰ２和ＶＰ５的表达,运用组织培养中和试验和直接血凝试验检测表达产物的生物学活性。     

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达 …

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦＣＤＮＡ克隆到ＰＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ＰＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免     

BPI23-Fcγ1重组融合蛋白在E.coli中的表达

目的 构建ｐＢＶ－ＢＰＩ６００－Ｆｃγ１７００重组表达载体,转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１抗菌重组蛋白。方法 采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从ＨＬ－６０细胞和正常人白细胞ｍＲＮＡ中扩增编码ＰＢＩ２３和ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｆｃγ１）的基因;通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体;转化感受态Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α细胞,通过温控诱导表达ＢＰＩ２３－Ｆｃγ１重组蛋白。结果 （１）ＲＴ－ＰＣＲ     

逆转录病毒载体介导乙型肝炎病毒反义基因的转录表达

为了探索在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）反义核酸的方法，用基因重组技术将ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因（ＰｒｅＣ／Ｃ）和前Ｓ／Ｓ基因（ＰｒｅＳ／Ｓ）片段反向插入逆转录病毒载体质粒，再将重组体分别转染ＰＡ３１７包装细胞，进而获得能够介导ＨＢＶ反义基因向小鼠ＮＩＨ３Ｔ３细胞转移表达的重组逆转录病毒。经分子杂交试验表明，含有ＨＢＶ反义基因的重组逆转录病毒序列已经整合到转染的ＰＡ３１７细胞染色体上；转导的ＮＩＨ３Ｔ３细胞内有ＨＢＶ反义ＲＮＡ转录表达。结论：逆转录病毒载体包装细胞系统能够介导ＨＢＶ反义基因在真核细胞中转录表达，因而有可能利用反义技术和基因转移方法进行抗－ＨＢＶ基因治疗     

含有丙型肝炎病毒核心基因表达质粒的构建及其基因免疫

目的：研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫诱生特异性免疫应答的可行性。方法：将ＨＣＶ Ｃ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ,分别转染小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０和人肝癌细胞７７２１进行瞬时表达,用免疫荧光法和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测表达产物,将重组质粒注射,ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠股四头肌,ＥＬＩＳＡ法检测血清中抗体产生水     

含日本脑炎病毒pre—M／E蛋白基因真核表达质粒的构建及…

本文作者将日本脑炎病毒（ＪＥＶ）的前膜蛋白和囊膜蛋白（ｐｒｅＭ／Ｅ）的基因插入到真核表达载体ｐＳＧ５中，构建了重组表达载体ｐＳＧＪＥ。用其体外转染地鼠肾细胞ＢＨＫ－２１，经间接免疫荧光法（ＩＦＡ）检测，证实了ＪＥＶ－Ｅ的瞬时，大量制备和纯化重组质粒，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，结果显示该重组质粒可明显促进小鼠在受到ＪＥＶ活病毒攻击中特异性抗体的产生。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 …

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶ Ｃ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表达的核心抗原     

AngⅡ、mm-LDL和TNFα对ECV304细胞 PDGF-B链基因转录调控的影响

目的 :从基因转录水平探讨ＡｎｇⅡ、ｍｍ -ＬＤＬ及ＴＮＦα对ＥＣＶ30 4细胞ＰＤＧＦ -Ｂ链基因表达的影响。方法 :( 1 )以ＧＡＰＤＨ为内参照 ,用反转录 -多聚酶链反应 (ＲＴ -ＰＣＲ)方法检测 1 0 - 6 ｍｏｌ/ＬＡｎｇⅡ、1 0 0 μｇ/ｍＬｍｍ -ＬＤＬ及 2 0 0Ｕ/ｍＬＴＮＦα作用于ＥＣＶ30 4细胞 1 8ｈ后各实验组ＰＤＧＦ -Ｂ链基因ｍＲＮＡ水平 ,分别为对照组的 1 5倍、2 0倍和 1 3倍 ,提示ＡｎｇⅡ、ｍｍ -ＬＤＬ及ＴＮＦα在转录水平对ＥＣＶ30 4细胞ＰＤＧＦ -Ｂ链基因的表达有促进作用。 ( 2 )构建一系列含人ＰＤＧＦ -Ｂ链基…     

表皮生长因子与假单胞菌外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的表达研究

目的和方法：应用基因工程技术，将ＥＧＦｃＤＮＡ克隆到ｐＬＹ５／ＩＬ２－ＰＥ４０载体的ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ位点之间ＩＬ２基因位置上，再将重组融合基因亚克隆到表达载体ｐＢＶ２２０的ＥｃｏＲⅠ、ＰｓｔⅠ位点上，以探索ＥＧＦ－ＰＥ４０融合基因在大肠杆菌ＤＨ５ａ中的进行表达及其生理功能。结果：ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ表明：ＥＧＦ－ＰＥ４０融合蛋白获得表达，并且具有ＥＧＦ和ＰＥ４０的免疫学活性。结论：这为进一步研究该融合的蛋白功能和肿瘤治疗打下基础     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建包含丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白（Ｃ）基因片段的重组真核表达载体，并在肝细胞癌细胞株７７２１细胞中表达。方法：将从ｐＢＲＴＭＨＣＶ１－３０１１质粒切下的ＨＣＶＣ基因片段插入ｐｃＤＮＡ３质粒的ＣＭＶ启动子下游，构建真核表达质粒ｐｃＤＮＡＨＣＶ－Ｃ，然后，采用脂质体转染技术，转染７７２１细胞进行瞬时表达，转染细胞裂解煮沸后，通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表达的核心抗原。结果：用限制性内切酶酶切后，片段大小与计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实，表达抗原的Ｍｒ约为２２０００。结论：ＨＣＶＣ基因能够插入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，并使其在真核细胞中表达，为进一步ＨＣＶ基因疫苗的研制和探讨抗ＨＣＶ感染打下了基础。     

应用S基因转染的Sp2/0细胞作为靶细胞研究HBV基因疫苗的细胞免疫应答

构建编码ＨＢｓＡｇ 蛋白的重组真核表达质粒ｐＣＲ３－１Ｓ作为ＨＢＶ 基因疫苗, 免疫接种Ｂａ１ｂ／ｃ 小鼠。以重组质粒ｐＣＲ３－１Ｓ转染的Ｓｐ２／０ 细胞作为靶细胞, 采用５１Ｃｒ ４ｈ 释放法, 体外检测免疫小鼠的淋巴细胞杀伤功能。结果显示, 与空载体对照组相比较, ＨＢＶ基因疫苗可诱导Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠产生ＨＢＶ 特异性细胞毒性Ｔ 细胞应答（ Ｐ＞ ０－０５） , 提示以Ｓｐ２／０ 基因转染的细胞作为靶细胞, 检测免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠淋巴细胞的杀伤功能是可靠的。