降钙素基因相关肽与心血管疾病的关系

降钙素基因相关肽与心血管疾病的关系湖南医科大学附属第二医院向伟，彭淑梅，赵树本综述　熊正东　审校降钙素基因相关肽（Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｐｅｐ－ｔｉｄｅ．ＣＧＲＰ），为一生物活性多肽，１９８３年为Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等人应用基因工程...     

基因工程及其在医学上的应用第七讲基因工程技术在医学检验中的应用

基因工程及其在医学上的应用第七讲基因工程技术在医学检验中的应用中山医科大学生物化学教研室伍新尧问：基因工程技术是生命科学的前沿技术。前面的介绍使我们了解到，在诊断疾病方面，基因工程技术正起着越来越显著的作用。在医学检验的其他领域是否同样可以应用这一技...     

重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因工程菌的构建

目的：构建稳定、高效表达重组人心肌肌钙蛋白Ⅰ（cTnI）的基因工程菌株,为临床检测心肌损伤及预后提供诊断试剂材料,促进cTnI诊断标准化的研究。方法：采用RT-PCR方法从人心肌组织总RNA中克隆出全长的人cTnI基因,将其插入到pMD19-T克隆载体中,经酶切和测序对目的基因分析,再插入到pET-21a（＋）表达载体中,转化BL21（DE3）,对诱导表达的目的蛋白行SDS-PAGE和采用锐普心梗仪检测重组蛋白的抗原性并准确定量。连续传代试验验证基因工程菌稳定性。结果：克隆了全长的cTnI基因,目的蛋白表达量达菌体总蛋白的38％,重组蛋白抗原性良好,基因工程菌具有较高的稳定性。结论：功构建了稳定、高效表达重组人cTnI的基因工程菌。     

基因工程及其在医学上的应用：第六讲 应用基因检测技术诊断疾病

基因工程及其在医学上的应用第六讲用基因检测技术诊断疾病中山医科大学生物化学教研室伍新尧间：前面几讲介绍了基因工程技术的基本概念和基本理论。我们想进一步了解这一高新技术在医学中具体应用的情况，比如在疾病诊断方面，基因工程技术能发挥什么作用？答：这是一个...     

葡萄糖脱氢酶基因的重组和表达研究

目的 为获得较高活力的葡萄糖脱氢酶.方法 根据枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因两端序列设计引物,以枯草芽孢杆菌WB600基因组DNA为模板,通过聚合酶链反应(PCR)获得该基因,与表达载体pET 22b连接后转化至大肠杆菌JM109(DE3)进行表达,并在半自动生化分析仪上用速率法测定其活性.结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,重组菌能表达单体分子量为31.5 kD的特异性蛋白.通过对重组基因表达条件的研究发现,诱导剂(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)浓度为0.5 mmol/L,诱导2.5～3 h后用240 W超声破碎细胞,可实现该基因的较高表达.结论 运用基因工程手段获得了葡萄糖脱氢酶基因,重组基因经大肠杆菌诱导表达,获得了较高活力的葡萄糖脱氢酶,经纯化后可为临床服务.     

肺表面活性物质结合蛋白C的cDNA合成,克隆及测序

目的：应用基因工程手段获得重新设计的肺表面活性物质结合蛋白Ｃ（ＳＰＣ）的ｃＤＮＡ克隆。方法：根据发表的ＳＰＣ基因序列，重新设计适宜在大肠杆菌中表达的目的基因片段，该基因双链分８个小片段合成，经退火、复性连接成目的片段后，克隆到经过ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎＤⅢ双酶切的质粒载体ｐＵＣ１１８中并转化大肠杆菌ＴＧ１，碱裂解法抽提重组子测序。结果：测序证明获得的基因序列与实验设计完全符合。结论：正确设计并合成了ＳＰＣ的ｃＤＮＡ，为进一步在大肠杆菌中表达奠定了基础。     

结核分支杆菌16000抗原基因在大肠杆菌中的高效表达及其产物

目的：获得高效表达结核分支杆菌16000抗原的大肠杆菌工程菌，将培养物纯化后得到重组16000蛋白抗原纯品，并检测其免疫学特性。方法：用聚合酶链反应（PCR）方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）分析重组蛋白抗原的相对分子质量大小及表达形式。DEAE及PEI凝胶纯化重组蛋白。Western印迹及酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析重组蛋白的免疫原性。结果：构建了具有正确基因序列的重组表达载体，在大肠杆菌Bk。（DE3）中诱导表达，重组蛋白占菌体总蛋白的40％，Westem印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分支杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中，该纯化的重组抗原能区别抗结核抗体阳性患者血清及正常人血清。结论：实验中获得了能高效表达16000蛋白抗原的大肠杆菌工程菌，以可溶性形式存于胞浆内。该重组蛋白具有特异的免疫原性。结核病仍为危害全球健康的主要疾病之一，为了改进目前诊断试剂的特异性和研究筛选有价值的亚单位基因工程菌苗，近年来人们对其致病菌的基因及相关蛋白质进行更深入的研究，以期寻找到有应用价值的特异性蛋白质或相关基因，有目的地利用基因工程技术获得重组蛋白抗原为以上研究提供极大的便利。使用结核分支杆菌单克隆抗体TB68筛选出来的16000蛋白抗原，为结核分支杆菌主要的膜蛋白，对其天然提取物的研究结果表明，该蛋白不仅携带有结核分支杆菌特异性的B细胞表位，并能诱导细胞介导的免疫应答反应，具有潜在的诊断应用价值。大量获得重组16000蛋白抗原就为更深入研究该蛋白的生物学、免疫学活性，开发其应用价值提供便利。     

基因工程技术在创面修复中的应用

烧伤创面是引发机体病理生理变化的基础 ,早期切削痂、及时封闭创面是提高大面积深度烧伤伤员成活率最关键、最有效的措施之一 〔1〕。但是 ,如何修复大面积深度烧伤创面仍是医学界的棘手问题〔2〕。近年来 ,随着分子生物学的发展 ,基因工程技术在皮肤创面修复应用中的研究越来越广泛 〔3〕。现对基因工程技术在创面修复中的应用予以综述。1　基因工程技术的基本情况基因工程是指在体外条件下 ,人工将 DNA分子“剪切”并重新“拼接”形成一个新的杂合 DNA分子 ,然后将其导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖 ,使该基因在细胞中表达得到人…     

基因工程及其在医学上的应用（第二讲 基因工程技术的工具酶,载体及其连接）

基因工程及其在医学上的应用第二讲基因工程技术的工具酶、载体及其连接中山医科大学生化教研室罗超权问：基因工程技术常用哪些工具酶？答：古云：工若善其事，必先利其器。基因工程技术在７０年代能得到迅速发展，亦与相应技术的发展及工具酶的发现和使用密切相关。常用...     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的利用基因工程方法表达人巨细胞病毒pp65基因片段,并对表达的目的蛋白进行鉴定。方法根据genebank所查的HCMV PP65基因和相关文献选取特异性反应的基因片断,PCR扩增目的基因,将PCR产物切胶回收后与pET-28a载体连接,转化BL21,筛选。对重组质粒进行诱导表达,采用ELISA间接法鉴定纯化的GST/pp65融合蛋白的抗原性进行鉴定。结果目的蛋白经诱导后表达于上清液中,经鉴定目的蛋白具有预期的抗原活性。结论 GST/pp65融合蛋白的获得,为进一步研制以重组蛋白代替传统的全病毒作为检测抗原的新型人巨细胞病毒特异性免疫学检测试剂盒奠定了基础。     

HPV6晚期表达基因L1的克隆并在杆状病毒表达系统的表达及其抗血清制备

目的 获得具有正确序列的人乳头瘤病毒HPV6型晚期表达基因L1，并获得其高活性表达L1基因特异性抗血清，为进一步研究及临床检验应用奠定物质基础。方法 用PCR法从感染人乳头瘤病毒患者尖锐湿疣组织中获得HPV6晚期表达基因L1，测序验证后，将正确的HPV6晚期表达基因L1序列，插入Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，转洒昆虫细胞Sf9，表达外壳蛋白L1，并以之作为抗原免疫兔，获得特异性抗血清。结果 获得了正确序列HPV6晚期表达基因L1，在Bac-to-Bac杆状病毒系统活性表达并获得其特异性抗血清。结论 获得HPV6晚期表达基因L1，及有抗原活性的表达和相应抗血清。     

血液病基因检测临床应用认知程度调研报告

目的调查医务工作者对血液病基因检测临床应用的认知程度。 方法对参加2018年6月29-30日在北京举办的"第六届陆道培血液病高峰论坛"的209名学者进行以微信为平台的调查研究，调查内容涉及被调查者的基本信息、对血液病基因检测的认知程度以及基因检测的应用现状及反馈。对3个年份（2015年、2016年、2018年）间获得研究生学历的被调查者人数应用行×列表χ²检验，应用四格表χ²检验分别对这3个年份进行两两比较。 结果调查对象的年龄主要分布在40岁及40岁以下，学历分布以本科和硕士研究生为主。3个年份（2015年、2016年、2018年）间获得研究生学历的被调查者人数差异有统计学意义（P<0.05）；对这3个年份进行两两比较，2015年和2016年获得研究生学历的被调查者人数差异无统计学意义（P>0.05），2018年获得研究生学历的被调查者人数较前两个年份均有所增加，差异有统计学意义（P均<0.05）。被调查者中血液科临床医生比例最高，为44.50%；50.24%具有中级以上职称。有接近80%的医务工作者会在临床中应用血液病基因检测。基因检测在三甲医院、高水平专科医院以及其他三级和三级以下医院应用频度较高。基因检测临床应用的主要限制因素包括费用过高、医保不能报销和有明确意义的基因检测项目太少等。73.08%的调查对象可以接受基因检测报告在5~10个工作日出具。对于基因突变检测报告有56.52%临床医生认为报告结果太复杂。 结论医务工作者对血液病基因检测有一定的认知程度，费用过高、医保不能报销和有明确意义的基因项目过少等为基因检测在临床应用中的限制因素，检测报告的回报周期及结果意义可读性还有待提高。     

骨缺损再生修复中人骨形成蛋白2基因的克隆和序列分析

目的：克隆人骨形成蛋白2（hBMP2)基因全长，用于临床难治性骨折和骨缺损的再生修复。方法：以成骨肉瘤细胞总RNA为模板，应用反转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)克隆hBMP2的cDNA全长；将获得的基因插入pGEM-T-Easy载体质粒，并转化至大肠杆菌后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切分析鉴定重组质粒。结果：通过质粒酶切分析和序列测定，获得的基因为hBMP2全长DNA序列。结论：克隆获得hBMP2的基因，为其进一步开发利用提供了前提条件。     

NK4基因在重组腺病毒中的表达与初步鉴定

目的 构建含有肝细胞生长因子(HGF)NK4基因的重组腺病毒载体，为应用HGF／NK4进行肿瘤基因治疗奠定实验基础。方法 应用AdEasy腺病毒载体系统，将PCR扩增所得的NK4基因片段与穿梭质粒pShuttle-CMV进行连接，获得重组质粒pShuttle-CMV-NK4，将该质粒与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5l83获得重组腺病毒质粒pAdCMV-NK4，用该质粒转染293细胞包装产生出重组腺病毒rvAdCMV-NK4。重组腺病毒分别经电子显微镜技术及RT-PCR、Western Blot等方法进行鉴定。结果 得到含有NK4基因的重组腺病毒rvAdCMV-NK4，电子显微镜下可见典型腺病毒颗粒形态，RT-PCR及Westem Blot分析显示rvAdCMV-NK4感染293细胞后NK4基因可有效转录并表达。结论 成功构建出含有NK4基因的重组腺病毒rvAdcMV-NK4，为下一步开展关于NK4基因的肿瘤治疗提供了基础。     

人β防御素-2基因的克隆及原核表达载体的构建

目的构建人β-防御素2的融合性原核表达载体，为今后基因工程手段表达纯化及生产人β-防御素-2奠定基础。方法体外基因合成人β-防御素2（HBD-2）的基因片段，并克隆人pMD18T中间载体中，经酶切鉴定后再克隆人pET32a原核表达载体中，与载体中所固有的TrX—A形成融合基因。结果构建的融合性原核表达载体经酶切鉴定无突变发生。结论成功地构建了pET-32a-（HBD-2）。     

核包膜蛋白gp210自身抗原基因的克隆、表达、纯化及其临床应用

目的研究核包膜蛋白gp210基因在大肠杆菌中的稳定表达、纯化和免疫学活性鉴定。方法从人外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增gp210蛋白中含优势表位的基因片段。将该段基因克隆入PET-30a表达载体并转化到大肠杆菌BL21中表达。融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE电泳及ELISA方法进行鉴定。结果在原核表达载体中成功构建了PET30a-gp210重组体。重组体诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子量大约69 kD处有gp210融合蛋白的高效表达,经纯化获得纯度达90%的表达蛋白。ELISA检测结果显示该重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论应用基因工程方法,获得了gp210重组蛋白,为检测抗gp210抗体提供了特异性抗原,也为临床将抗gp210抗体作为PBC的特异性诊断指标奠定了基础。     

Egr-1基因的辐射生物学效应研究进展

Egr-1(Early growth response-1)基因是一系列“立即早期基因（Immediate early gene)”中的重要一个,参与细胞的多种辐射生物效应,研究表明,Egr-1在多种正常细胞和肿瘤细胞受到电离辐射后的早期就能被激活,它的激活表达与辐照后细胞的生长,周期,凋亡等的改变密切相关,另外,Egr-1基因调控序列具有辐射可诱导特性,这一特点使其有了潜在的临床和基因工程生产应用前景。     

pEGFP-bFGF重组质粒转染成骨细胞的条件优化

目的：旨在优化碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)重组质粒转染成骨细胞的条件以获得较高效率，为进一步研究bFGF基因转移在骨组织工程的应用提供基础。方法；将带有EGFP的bFGF重组质粒转染成骨细胞，改变DNA，脂质体的量以及转染时间，在荧光显微镜下观察荧光并计算转染效率。结果：在24孔培养板中，2μL脂质体介导1μg重组质粒转染10h既可获得较满意的转染效率。结论：通过优化转染条件可提高转染效率，可炒下一步基因工程细胞移植提供基础。     

基因工程化Treg细胞对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病的作用

目的 探讨输注慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T淋巴细胞(Treg细胞)对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法 利用慢病毒载体介导,将鼠Foxp3基因转导入BALB/c小鼠的CD4+CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Treg细胞.建立小鼠异基因骨髓移植模型,在移植时联合输注基因工程Treg,通过受...     

基因检测的现状与未来

基因检测具有非常广泛的应用前景，在过去的十年中，该技术获得了长足的进步，人类的许多遗传缺陷可通过基因检测得到确认，然而，基因检测还存在着诸多技术上的难题，特别是对不应性突变的检测上，基因突变的检出率相当低，使基因检测的可信度受到怀疑，因此，对顺应性突变和不应性突变的检测，应当采取不同的方法，并通过加强基因研究探索更为敏感和特异的检测技术。