O139群霍乱弧菌毒力岛区域分子特征分析

目的 比较O139群霍乱弧菌国际标准株M045和O1群E1 Tor型霍乱弧菌国际标准株N16961基因组中毒力岛区域分子特征.方法 从MO45基因组中筛选含有毒力岛上游的VC0815基因及其上游基因片段并克隆到pNEB193中命名为pNEBVC081545,绘制pNEBVC081545的限制性酶切图谱并与N16961同段序列限制性酶切图谱进行比较.在pNEBVC081545中选择VC0815基因上游的一段侧序列进行亚克隆,测序后与N16961同段序列比较.结果 pNEBVC081545限制性酶切图谱中VC0815基因上游序列图谱中第1个碱基位置是限制性内切酶位点为KpnⅠ,第732位为Sal Ⅰ,第819位为Hpa Ⅰ,第1578位为Bgl Ⅱ,第1600位为Hind Ⅱ,第1943位为Xba Ⅰ,第3247位为EcoR Ⅰ,此段序列限制性内切酶图谱与N16961同段序列限制性酶切图谱完全相同.对Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ之间的序列进行亚克隆,并对该段序列测序,测序结果表明该段核酸序列与N16961中同段序列完全相同.结论 O139霍乱弧菌可能是E1 Tor霍乱弧菌O抗原突变而产生的菌群.     

霍乱弧菌4种新类型tcpA基因发现及序列分析

目的研究中国霍乱弧菌（VC）毒力协同调节菌毛A亚单位基因（tcpA）的多态性.方法分别进行聚合酶链反应及限制性片段长度多态性分析、型特异引物PCR分型、基因测序及序列分析.结果 200株O1群埃尔托型（EVC）产毒株和100株O139群VC产毒株的tcpA基因均与EVC国际标准株N16961株为同一类型（t2型）.50株EVC非产毒株中只有3株携带tcpA基因,1株为t2型,另2株为2种新类型.20株O139群VC非产毒株均不携带tcpA基因.20株非O1非O139群VC中只有2株携带tcpA基因,且为2种新类型.4种新类型tcpA基因与国外发现的4种类型比较,基因序列及推测的氨基酸序列同源性分别为58.3%～77.5%和61.0%～85.5%;5′端约102bp基因序列基本一致,推测的氨基酸序列完全一致;3′端约210bp基因序列变异最大,推测的氨基酸序列变异也最大.抗原表位分析,C末端差异最大.结论建立快速准确区分不同类型tcpA基因的方法,并发现4种新类型.     

利用比较基因组学研究河弧菌和霍乱弧菌在阿拉伯糖代谢试验中不同表型的分子遗传基础

目的利用比较基因组学研究河弧菌与霍乱弧菌阿拉伯糖发酵实验差异的分子遗传机制。方法比较河弧菌EF85003和霍乱弧菌N16961在以L-阿拉伯糖或葡萄糖为单一碳源的M9培养基中的生长曲线。对河弧菌EF85003进行基因注释,预测阿拉伯糖操纵子区域,利用比较基因组学两两比较河弧菌EF85003、弗尼斯菌NCTC11218和霍乱弧菌N16961序列。结果河弧菌EF85003可在以L-阿拉伯糖或葡萄糖为单一碳源的M9培养基中生长,而霍乱弧菌N16961仅在以葡萄糖为单一碳源的M9培养基中生长。比较基因组学研究发现河弧菌EF85003序列中VFL-003620基因至VFL-003628基因为阿拉伯糖操纵子区域,而霍乱弧菌N16961全基因组序列中不含完整的阿拉伯糖操纵子。结论河弧菌EF85003基因组上存在阿拉伯糖操纵子区域,霍乱弧菌N16961基因组序列中不含完整的阿拉伯糖操纵子,造成了河弧菌EF85003和霍乱弧菌N16961在阿拉伯糖发酵实验中的不同表型。     

霍乱弧菌VPI毒力岛的tcpI-P和tcpH-A间隔区序列在不同菌株中的差异分析

目的：TcpA是霍乱弧菌主要定居因子毒素共调菌毛的主要亚单位，基因位于VPI毒力岛上。古典生物型和EI Tor生物型霍乱弧菌菌株的tcpA序列有较大差异，同时毒力岛上其他一些区域，主要包括部分基因的间隔区序列也存在差异。我们已在不同EI Tor流行株与非流行株以及非01／非O139菌株中又发现4种新的tcpA序列。笔拟探明这4种不同类型tcpA序列的菌株中，VPI毒力岛上其他几个差异片段(tcpI—P间隔区和tcpH—A间隔区)是否与相应tcpA序列有平行的变异关系、进而分析毒力岛和菌株分化的多样性。方法：在tcpI—P和tcpH—A间隔区外侧保守区中设计引物，扩增包含这两个间隔区的片段并进行测序，计算比较序列差异。结果：基因tcpH与tcpA之间的间隔区序列两两间比较的一致性在63．3％至95．3％之间；基因tcpI与tcpP之间的间隔区序列两两间比较的一致性在26．7％至100％之间。这些间隔区序列并没有像tcpA序列在这些菌株中的差异那样显示出类似的变异水平，甚至一些菌株的tcpA序列有较大差异时、某些区域反而高度一致。结论：在不同tcpA序列的菌株中tcpI—P间隔区和tcpH—A间隔区及tcpA这三个片段分化变异的速率不同，并不具有平行性。这些序列的多样性反映了霍乱弧菌VPI毒力岛以及菌株分化的多样性。这种分化也提示可能与这些区域具有结合一些调控因子、从而对环境信号产生不同方式或程度的应答的功能有关。     

霍乱弧菌主要毒力和管家基因序列分析

目的分析广东霍乱弧菌（VC）代表菌株主要毒力基因和管家基因序列。方法PCR扩增霍乱弧菌的主要毒力基因（ctxAB和tcpA）和管家基因（dnaE、hlyA、mdh和recA）、基因测序、对序列进行生物信息学分析。结果不同年代分离的2株埃尔托型（EVC）产毒株和1株0139群VC产毒株的主要毒力基因序列与国内外相关报告比较，ctxA基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为99．7％～100％和98．8％～100％．ctxB基因及推测的氨基酸序列的同源性分别为98．8％～100％和96．8％～100％，tcpA基因序列与EVC国际标准株N16961 100％同源。3株产毒株的dnaE、hlyA、mdh和recA基因序列同源性分别为99．8％～100％，100％，99．5％～99．8％和100％，氨基酸序列同源性分别为100％．100％，98．5％～99．3％和100％；3株产毒株和O139群VC非产毒株的管家基因序列同源性分别为97．0％～97．2％，91．8％，94．1％～94．4％，96．9％，氨基酸序列同源性分别为100％，94．6％，94．3％～98．5％和99．7％。结论广东省不同年代EVC产毒株和O139群VC产毒株的群体遗传学关系高度密切，而与O139群VC非产毒株较远，O139群VC产毒株可能起源于EVC产毒株。     

副溶血弧菌RIMD2210633与霍乱弧菌N16961中超级整合子结构差异分析

目的确定副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)RIMD2210633与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)N16961菌株中超级整合子结构特点差异。方法 (1)使用Perl脚本搜寻RIMD2210633和N16961中superintegron(SI)中核心序列(core segment,CS)和反向核心序列(inverted core segment,ICS);(2)配对核心序列和反向核心序列,获得副溶血弧菌重复序列(V.parahaemolyticus repeat,VPR)及霍乱弧菌重复序列(V.cholerae repeat,VCR)基因组位置信息;(3)使用Perl语言脚本获得副溶血弧菌RIMD2210633以及霍乱弧菌N16961的SI中重复序列,并获得基因盒的构成和分布信息;(4)使用全局比对软件Clustal W将上一步获得的所有VPR和VCR序列进行多序列比对,使用Perl语言脚本处理比对结果以获得一致性序列;(5)使用MEGA 4.0查看多序列比对结果,并使用Perl脚本计算各位置的变异频率,据此结果来分析副溶血RIMD2210633和霍乱弧菌N16961中的弧菌重复序列以及基因盒分布的特点。结果在RIMD2210633的超级整合子鉴定了69个VPR,其核苷酸长度在91～125bp之间。在包含128个核苷酸的一致性序列中,15个为保守核苷酸位点,113个为可变核苷酸位点。在副溶血弧菌的SI中,共确定了64个基因盒,基因盒的长度范围是420～1 709bp,中位数是648bp。在霍乱弧菌N16961的超级整合子中鉴定了158个VCR,长度在117～124bp之间。在包含126个核苷酸的一致性序列中,37个为保守核苷酸位点,89个为可变核苷酸位点。N16961的SI中共存在146个基因盒,基因盒的长度范围是390～5924bp,中位数是1 518bp。结论与霍乱弧菌的VCR相比,副溶血弧菌的VPR可变区序列变异更大,与弧菌重复序列之间序列一致性高的特点不相吻合。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因的扩增、克隆及序列分析

[目的]克隆周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease of periodic Brugia malayi,BmCP）基因到原核载体中,测定其序列,为进一步的研究奠定基础.[方法]从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA,以mRNA为模板,采用RT-PCR法体外扩增出BmCP基因序列,扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体,转化大肠杆菌（E. coli）DH5α,筛选阳性克隆,进行双酶切及PCR扩增签定,获得阳性重组质粒pMD18-T-BmCP,经测序验证,并进行同源性比较.[结果]RT-PCR扩增出一条约1 201 bp大小的特异性条带,重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符,DNA序列分析与GeneBank已知的基因序列同源性为99%.[结论]成功构建了周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶重组质粒pMD18-T克隆载体,为进一步研究该基因的功能提供了条件.     

霍乱弧菌含编码霍乱毒素基因的溶源性噬菌体转染检测

[目的]研究霍乱毒素基因（ctx)在霍乱弧菌O1群埃尔托型，古典型菌株和O139群菌株之间的传递现象。了解含编码霍乱毒素基因的溶源性噬力体（CTXφ）和ctx基因转移中的作用。[方法]从人工构建的供体菌中诱导出带有标记的CTXφ并转染至受体菌，用PCR扩增和Southern杂交等方法检测受体菌，转染子及其质粒的目的基因片段。[结果]从受体菌O395、569B（古典型）和80071（埃尔托型）的转染子中均检出带有供体菌标记的质粒，PCR和Southern杂交结果表明这些质粒是CTXφ的形式。[结论]ctx基因能通过CTXφ在不同霍乱弧菌间进行传递。     

小鼠抵抗素基因及其反义核酸真核表达体系的构建与鉴定

目的构建载有小鼠抵抗素（resistin）基因及其反义核酸的重组真核表达质粒,为下一步进行resistin生物功能研究打基础。方法用resistin基因mRNA编码区序列特异引物,从小鼠脂肪组织中．通过RT—PCR的方法合成resistin cDNA,T4DNA连接酶将resistin cDNA克隆于pGEM-T载体,经双酶切及测序鉴定克隆成功后再亚克隆于pcDNA3．1^（＋）或pcDNA3．1^（-）真核表达载体,并测序鉴定。结果PCR产物长度与resistin cDNA理论长度363 bp相符;重组pGEM—T被EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ内切酶切为约3000bp和355bp两个片段,测序结果表明插入pGEM-T的DNA片段的核苷酸序列与小鼠resistin基因mRNA编码区序列完全一致。重组pcDNA3．1^（＋）和pcDNA3．1^（-）测序结果表明插入的DNA片段分别与小鼠resistin基因mRNA编码区序列和反义resistin基因mRNA编码区核苷酸序列一致。结论成功克隆载有resistin基因和载有resistin基因反义核酸的重组真核表达质粒。     

实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌重组质粒标准的构建

[目的]构建蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS重组质粒，为实时荧光PCR检测蜡样芽胞杆菌提供质粒标准。[方法]选择蜡样芽胞杆菌16s-23s ITS特异基因作为目的靶序列，设计、合成引物和探针，采用普通PCR扩增特异靶序列，克隆到pGM—T载体后，转化感受态大肠埃希菌DH5α，经蓝白斑筛选，再分别用EcoRI酶切，普通PCR及测序3种方法证实目的片段已成功重组。建立荧光定量PCR检测蜡样芽胞杆菌的标准曲线。[结果]成功构建目的重组质粒，并以此为标准制作荧光定量PCR标准曲线，重组质粒标准具有较大的线性范围（10^2copies／ul～10^8 copies／ul）和灵敏度。[结论]该方法构建的16s-23s ITS基因重组质粒能满足实时荧光定量测定对参考标准的要求，为后续实时荧光PCR快速检测蜡样芽胞杆菌的推广应用提供了条件。     

新疆地区2003-2004年麻疹野病毒分离株基因特征分析

目的了解新疆地区流行的麻疹野病毒基因型和亚型特征。方法对2003-2004年用健康产婴儿脐带血单个核细胞分离的麻疹野病毒进行分子流行病学分析。采用逆转录-聚合酶链反应对麻疹病毒N基因C末端676个核苷酸片段进行扩增，并对扩增产物进行核苷酸序列测定。通过分析C末端450个核苷酸序列构建基因亲缘关系树，并分析毒株变异情况。结果2003年和2004年各分离麻疹病毒3株（XJ03-26、XJ03-27、XJ03-74、XJ04-146、XJ04-150、XJ04-152），除XJ03-26株与沪191株核苷酸差异〈1％，属疫苗相关株A基因型外，其余5株均为H1基因型。其中XJ03-27、XJ03-74、XJ04-150和XJ04-152与H1a参考株China9322的核苷酸差异为0．5％～1．6％，同属于H1a亚型；XJ04-146与H1b参考株China9475的核苷酸同源性为98．7％，属于H1b亚型。4株H1a毒株分属两组（即XJ03-27与XJ04-150，XJ03-74与XJ04-152），每组内毒株N基因碳末端450个核苷酸序列几近相同无差异，但两组间毒株却存在较大变异，核苷酸差异达6．1％（27个核苷酸差异）。结论新疆地区2003-2004年流行的麻疹病毒以H1a亚型为主，亦存在H1b亚型。     

幽门螺杆菌napA基因的克隆及生物信息学分析

[目的]获取幽门螺杆菌NCTC11639中性粒细胞激活蛋白基因（napA），预测其编码蛋白作为幽门螺杆菌疫苗候选抗原的可行性，为耶疫苗研制奠定基础。[方法]提取幽门螺杆菌标准株NCTC11639的基因组DNA，参照GeneBank中幽门螺杆菌标准株22695的序列设计引物PCR扩增napA基因，克隆入pMD18-T载体中，对重组质粒测序后进行生物信息学分析。[结果]克隆的napA基因全长为435bp，在GenBank上登录（No．DQ341279），与Gen-Bank公布的其它Hp菌株的核酸同源性为94％～98％，与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97％。[结论]成功扩增Hp标准株NCTC 11639 napA基因，通过同源性检索分析表明Hp与人及其它哺乳动物的基因组DNA同源序列低，在不同耶菌株中高度保守，符合疫苗候选抗原的基本特征；抗原表位预测显示有4条高抗原性肽段，其中118-140肽段抗原指数最强，可能存在良好的抗原表位，结合Hp-NAP二级结构、亲水性分析认为Hp—NAP是很有前景的幽门螺杆菌疫苗候选抗原。     

南昌市2008～2009年性病监测流行病学分析

[目的]了解南昌市性病监测点报告的性病的流行病学特征,为制定防治对策提供科学依据。[方法]对2008～2009年性病疫情报告资料进行描述性流行病学分析。[结果]2008年性病报告病例数2936例,以梅毒、淋病、尖锐湿疣为主,男女性别比为1.27︰1;2009年性病报告病例数为2811例,以梅毒、淋病、尖锐湿疣为主,男女性别比为1.31︰1;总体呈下降趋势,报告发病数以20～40岁及60岁以上年龄段为主,职业分布以家务及待业和农民为主。[结论]今后性病防治重点人群为20～45岁及60岁以上年龄段,职业以工人及农民为主。防治措施以加强宣传性病防治知识及推广100%使用安全套为主。     

新疆维吾尔自治区2003～2004年麻疹野病毒分离株基因特征分析

目的了解新疆维吾尔自治区流行的麻疹野病毒的基因型或亚型特征,为消除麻疹提供科学依据。方法对2003~2004年用健康产婴脐血单个核细胞分离的麻疹野病毒进行分子流行病学分析。采用逆转录-聚合酶链反应对麻疹病毒核蛋白(N)基因羧基(COOH)末端676个核苷酸片段进行扩增,并测定扩增产物的核苷酸序列。通过分析COOH末端450个核苷酸序列构建基因亲缘关系树,并分析毒株变异情况。结果2003年和2004年各分离麻疹病毒3株(XJ03-26、XJ03-27、XJ03-74;XJ04-146、XJ04-150、XJ04-152),除XJ03-26株与沪191株核苷酸差异<1%,属疫苗相关株A基因型外,其余5株均为H1基因型。其中XJ03-27、XJ03-74、XJ04-150、XJ04-152与H1a参考株China9322的核苷酸差异为0.5%~1.6%,同属于H1a亚型;XJ04-146与H1b参考株China9475的核苷酸同源性为98.7%,属于H1b亚型。4株H1a毒株分属两组(即XJ03-27与XJ04-150,XJ03-74与XJ04-152),每组内毒株N基因COOH末端450个核苷酸序列几近相同或无差异。结论新疆维吾尔自治区2003~2004年流行的麻疹病毒以H1a亚型为主,亦存在H1b亚型。新疆维吾尔自治区流行的麻疹野病毒间存在较大基因变异,不同年份存在相同麻疹病毒的持续循环传播,需加强麻疹疫苗的预防接种及病毒学监测。     

78例胎传梅毒血清学检测分析

[目的]探讨新生儿胎传梅毒的血清学检测特点。[方法]对78例疑为胎传梅毒新生儿(其母亲已在怀孕时被确诊梅毒)于出生时及6个月时采用甲苯胺红不加热血清实验(TRUST)、梅毒螺旋体颗粒凝集实验(TPPA)和抗体捕捉酶免疫测定技术(Tp-IgM-Cap-ELISA)进行血清学检测,并进行分组比较(Tp-IgM阳性者为A组,阴性者为B组)。[结果]78例新生儿在出生时检测TRUST、TPPA均为阳性,Tp-IgM抗体阳性33例为A组,经过治疗6个月后TPPA仍均为阳性,Tp-IgM抗体阳性率为24.2%,TRUST阳性率为84.8%;Tp-IgM抗体阴性45例为B组,未经治疗6个月后仅1例幼儿TPPA及TRUST仍为阳性。[结论]TRUST、TPPA阳性不能作为新生儿胎传梅毒的诊断,Tp-IgM抗体阳性者可确诊并需治疗,Tp-IgM抗体阴性者无需治疗TPPA及TRUST也可转阴。     

对45株不动杆菌的鉴定结果及耐药性分析

[目的]了解不动杆菌的感染及耐药情况,为临床合理用药提供依据。[方法]按革兰阴性杆菌的临床常规鉴定方法,用K-B法对16种抗生素的药敏进行测定。[结果]在分离的45株不动杆菌中以洛菲不动杆菌为主,占51.1%,其次为醋酸钙不动杆菌,占35.6%。临床分离出的不动杆菌主要来源于痰标本（71.1%）。药敏结果显示,不动杆菌对亚胺培南最为敏感（89.7%）,其次为头孢他啶/克拉维酸（64.4%）、头孢噻肟/克拉维酸（64.4%）。[结论]不动杆菌的耐药谱广,且有多重耐药现象。临床医师必须遵守抗生素使用原则,严格掌握其适应证,合理使用抗生素,控制和预防耐药菌感染的发生和流行。     

广东省佛山市疾病负担研究

[目的]在佛山市人群的健康研究中首次引入DALY指标体系,对佛山市的疾病负担进行综合性测量,确定主要卫生问题。[方法]以伤残调整生命年—DALY为疾病负担的测量单位,采用直接法计算死亡损失寿命年(YLL),采用间接法计算伤残损失寿命年(YLD),结合人力资本法计算疾病经济负担。[结果]从佛山市疾病分类看,恶性肿瘤、循环系统疾病、呼吸系统疾病居于疾病负担前3位;从具体疾病看,脑血管病、支气管肺癌、慢性下呼吸道疾病居于疾病负担前3位。2004年疾病直接、间接经济负担分别占GDP百分比为0.47%与7.08%,间接经济负担到2010年将上升为9.07%。年龄45岁以上人群是恶性肿瘤疾病负担主要年龄;15～45岁是交通事故疾病负担的主要年龄。[结论]佛山市的疾病模式类似欧美等发达国家,但有其特殊性。     

检测SARS冠状病毒的套式RT-PCR方法的建立与初步应用

[目的]建立套式RT-PCR检测SARS冠状病毒的方法。[方法]从广东地区SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及本实验室分离的SARS冠状病毒（SAPS—CoV）组织培养上清中提取RNA，利用针对SARS冠状病毒多聚酶基因的特异性引物，进行逆转录及套式PCR扩增。扩增出的阳性片段连接入pGEM—T载体中，测序后比较其与其他已知SARS冠状病毒的同源性。[结果]从SARS患者尸解肺组织、咽拭子、嗽口水及SARS冠状病毒组织培养上清中均可扩增出阳性片段，经测序后证实是SARS冠状病毒特有序列。[结论]针对SARS冠状病毒多泵酶基因所建立的套式RT—PCR方法适用于临床标本及组织培养标本中SARS冠状病毒的检测。     

羟氯喹治疗对视网膜电图的影响

[目的]通过观察视网膜电图(ERG)变化,评估羟氯喹(HCQ)对视网膜损害。[方法]对45例系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和原发性干燥综合症用HCQ治疗的患者进行为期1年的前瞻性研究。在服药前后分别进行视力、视野、眼底和ERG的检查并给予比较。[结果]治疗期间视力,眼底和视野的检查均无异常。但有3位患者分别在服药3个月和6个月时出现了ERG的a波和b波振幅下降。[结论]ERG能较早的观察到HCQ对视网膜的毒性,对视功能损伤有早期诊断价值。