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相似文献
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1.
目的 克隆弓形虫RH株次黄嘌呤-黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HXGPRT)基因,构建原核表达载体,并表达该重组蛋白。方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子,提取总RNA,在设计合成的引物中引入BamHI和XhoⅠ酶切位点。应用RT-PCR扩增弓形虫HXGPRT基因片段,插入克隆载体pMD18-T,提取重组质粒,双酶切获得目的基因,插入原核表达质粒pET28a,重组子双酶切、PCR和测序鉴定,转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株cD-NA中扩增出693bp的HXGPRT基因片段;含pET28a/HXGPRT的宿主菌经诱导后,获得与预期分子量相符的表达产物,Western blotting提示重组蛋白能够被弓形虫患者血清中的IgG抗体识别,获得纯化的重组蛋白。结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取HXGPRT基因,构建pET28a/HXGPRT重组质粒,并高效表达.为进一步研究提供了条件。  相似文献   

2.
[目的] 构建和表达乙型肝炎病毒x基因原核表达载体,获得重组HBx蛋白。[方法] 用PCR方法扩增含有EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列,分别以pMD18-T载体和pET32a(+)载体构建pMD18-T-HBX克隆载体和pET32a-HBX原核表达载体,随后把pET32a-HBX转化大肠杆菌BL-2l进行诱导表达和纯化,Western blot检测原核表达的HBx蛋白的免疫活性。[结果] 经IFFG诱导后可见分子量约38KD的融合蛋白表达;表达的蛋白主要以包涵体形式存在;Western blot结果表明HBx融合蛋白具有较好的免疫活性。[结论] HBVX基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化。为研究HCC患者血清中HBx蛋白和抗-HBx抗体滴度水平奠定了坚实的基础。  相似文献   

3.
目的 原核表达获得大量人regucalcin(RGN)蛋白。方法 用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从人。肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)中扩增RGN全长cDNA,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T,测序鉴定准确后,进行酶切,将正确的RGN全长cDNA与原核表达载体pET42b(+)构建成重组质粒pET42b(+)-RGN。将pET42b(+)-RGN先转化入大肠杆菌DH5α,提取质粒经双酶切鉴定正确后,再转化入表达宿主大肠杆菌DE3菌株。对转化菌株进行诱导、破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹分析,鉴定RGN融合蛋白质表达的正确性。RGN重组融合蛋白经Ni^2+亲和层析纯化,达电泳纯。结果 构建了重组质粒pET42b(+)-RGN并获得高效表达,RGN重组融合蛋白经异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后以包涵体形式存在,表达的蛋白质相对分子质量为34000。结论 人RGN蛋白在pET42b(+)原核表达载体可获得高效表达,为进一步了解RGN蛋白质的结构、功能及其抗体的制备等奠定了基础。  相似文献   

4.
目的 克隆表达抗线粒体抗体二亚型(AMA-M2)的二个靶抗原侧链2-氧酸脱氢酶复合体E2(BCOADC-E2)、丙酮酸脱氢酶复合体E2(PDC-E2)及其连接形成的二联体BP-E2融合蛋白,用于人原发性胆汁性肝硬化(PBC)的早期临床诊断.方法 根据BCOADC-E2,PDC-E2的cDNA序列设计引物,从正常人的琳巴细胞中提取RNA,通过RT-PCR方法 扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达栽体pET28a( ),构建重组表达裁体pET28a( )-BCOADC-E2,pET28a( )-PDC-E2,pET28a( )-BP-E2,转化大肠杆茵BL21(DE3)后诱导表达蛋白质.表达蛋白经SDS-PAGE,Western-blot等鉴定.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了三种重组质粒.IPTG诱导表达后,获得三种融合蛋白.经免疫学鉴定,重组抗原片段具有AMA-M2的免疫原性.结论 重组表达的BP-E2融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的实验室诊断.  相似文献   

5.
摘要:目的:克隆烟曲霉硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TR)基因并构建原核表达载体,获得烟曲霉TR重组蛋白,并鉴定其抗原性。 方法:用RT-PCR方法从烟曲霉总RNA中扩增出TR cDNA片段,克隆至pMD18-T载体,并转化E.coli JM109。经序列分析证实后,提取重组克隆质粒双酶切获得目的基因,与表达载体pET28a(+)连接,转化E.coli BL21(DE3),筛选重组表达质粒。用异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白表达,用SDS-PAGE及免疫印迹法分析重组蛋白质,并用亲和层析柱进行纯化。 结果:构建了含TR全长基因的重组表达质粒,IPTG诱导后可高效表达。免疫印迹结果表明该重组蛋白质可被侵袭性曲霉病患者血清识别。 结论:成功构建了重组表达质粒pET28a(+)/TR,并在大肠埃希菌中获得了高效表达,重组蛋白质具有良好的抗原性,为进一步研究奠定了基础。  相似文献   

6.
目的采用分子克隆技术,构建肠道病毒71型(EV71)VP1全长基因大肠杆菌原核系统表达载体,诱导重组VP1融合蛋白表达。方法自EV71感染患者血清中提取病毒总RNA,进行一步法RT-PCR,扩增编码VP1蛋白的全长基因片段(891 bp),以pET32(a)为表达载体,构建重组表达质粒pET32(a)-VP1,转化E.coli.Rosseta感受态细胞,获得重组工程菌株。经诱导培养,SDS-PAGE电泳,免疫印迹鉴定表达产物。结果获得了含重组表达质粒pET32(a)-VP1的正相阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1融合蛋白。结论重组工程菌可表达VP1融合蛋白,对研究EV71发病机制及疫苗研制具有重要意义。  相似文献   

7.
目的构建风疹病毒E1基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达。方法通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)风疹病毒E1基因高活性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后连接于原核表达载体PET-28a(+),并于大肠杆菌中诱导目的重组蛋白表达。结果成功扩增出399bp的目的基因,有效表达出E1重组蛋白。结论在大肠杆菌中成功表达风疹病毒E1基因重组蛋白,为风疹病毒的血清学检测提供了一种新的抗原。  相似文献   

8.
目的 重组表达人核包膜蛋白自身抗原gp210融合蛋白,以用于原发性胆汁性肝硬化(PBC)的临床诊断和病情监测。方法 针对基因库中人gp210的cDNA序列设计引物,从正常人的淋巴细胞中提取RNA,通过反转录PCR方法扩增得到相应的基因片段,经测定序列验证后插入表达载体PET28a(+),构建重组表达载体PET28a(+)-gp210,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导表达蛋白质,并经SDS-PAGE、Western-blot鉴定重组表达的gp210融合蛋白,进一步经Ni2+亲合层析柱纯化。应用重组gp210融合蛋白建立间接ELISA,检测PBC患者血清中的抗gp210抗体。结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了PET28a(+)-gp210重组质粒。经SDS-PAGE、Western-blot鉴定,获得了具有免疫原性的重组gp210融合蛋白。经ELISA检测,PBC患者中抗gp210抗体的阳性率为40.5%,与疾病对照组及正常对照组比较有显著性差异(P〈0.05)。PBC患者临床资料分析表明,抗gp210阳性患者中IgM浓度显著高于抗gp210阴性患者;经UDCA治疗后,28位PBC患者中,3例抗gp210抗体由阳性转为阴性,9例抗gp210抗体持续阳性,1例抗gp210抗体由阴性转为阳性,16例抗gp210抗体持续阴性;其他临床症状与抗gp210抗体无显著相关。结论 应用重组gp210融合蛋白建立ELISA检测自身抗体,对PBC诊断具有较好的特异性,为PBC的临床诊断和病情监测提供了有力依据。  相似文献   

9.
基因重组降钙素原蛋白在大肠杆菌中的克隆表达及纯化   总被引:1,自引:0,他引:1  
陈洁  张志萍  谢惠芳 《检验医学》2008,23(3):240-244
目的构建降钙素原(PCT)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行表达,以获取高产量、低成本、高纯度的PCT蛋白。方法按人的全长PCT cDNA序列,设计引物用标准的聚合酶链反应(PCR)法全基因合成步骤合成扣除信号肽外PCT的片段,应用基因重组技术将该片段克隆到质粒pET21a(+)中,进行限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定。将重组质粒转化大肠杆菌E.coli(DH5α),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用镍-氮三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化获取蛋白,用十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western blot)的方法鉴定。结果扩增出的人PCT片段于原核表达载体中克隆,经酶切和核酸测序鉴定,得到正确的重组质粒pET-PCT,并在大肠杆菌中得以表达。纯化后的蛋白经考马氏亮蓝染色呈单一条带;用抗PCT的抗体进行Western blot分析证明目的蛋白有反应性。结论本研究成功构建了表达基因重组人PCT的原核表达载体,基因重组人PCT蛋白在大肠杆菌中获得了表达和纯化,为进一步获取高纯度、高效价的单克隆抗体和开展临床检测提供了必要的条件。  相似文献   

10.
目的 构建含SARS病毒S蛋白编码基因片段的表达载体,并将其置于Vero细胞中表达。方法 设计1对PCR引物,在其下游引入Flag序列。通过PCR方法从质粒pGEX-6P-1-SARS-S中扩增出s蛋白编码基因,PCR产物经酶切后,插入表达载体peDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒peDNA3.1(+)-SARS-S。重组质粒经酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析后转染Vero细胞,用抗Flag单克隆抗体通过Westernblot检测S蛋白片段在Vero细胞中的表达。结果 酶切鉴定及核苷酸序列测定和分析示重组质粒构建完全正确;Western blot证实重组S蛋白片段能够在Veto细胞表达。结论 融合Flag序列的SAPS病毒S蛋白片段在Vero细胞中获得了正确表达。  相似文献   

11.
目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257~532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257~532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257~532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257~532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257~532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257~532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257~532融合蛋白并纯化。  相似文献   

12.
目的构建重组金属硫蛋白2A(MT-2A)原核表达质粒,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,为进一步研究MT-2A奠定基础。方法从人骨骼肌细胞cDNA文库中PCR扩增MT-2A基因DNA序列,构建重组表达质粒MT2A-pET32a,PCR与DNA测序法鉴定插入序列;重组细菌用IPTG诱导表达,His-bind亲和层析柱纯化MT-2A蛋白,Western blotting鉴定蛋白特性。结果扩增获得的MT-2A基因片段长186bp,DNA测序证实MT2A-pET32a重组质粒构建正确;表达的融合蛋白相对分子质量约为29×103,Western blotting证实为目的蛋白。结论成功构建了重组原核表达质粒MT2A-pET32a,在大肠埃希菌内诱导表达并纯化获得MT-2A。  相似文献   

13.
目的:在大肠杆菌中表达胰岛素抵抗受体底物-4(insulinreceptorsubstrate4,IRS4)与谷胱甘肽-S转移酶的融合蛋白,并制备抗IRS4的多克隆抗体(pAb)。方法:从肝癌细胞系HepG2提取总RNA,用RT-PCR扩增出IRS4PTB结构域的cDNA,克隆入表达载体pGEX-Teasy中,重组载体酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-IRS4蛋白,SDS-PAGE分析表达产物,包涵体经变性复性后,通过亲和层吸法纯化表达的GST-IRS4融合蛋白,并以此为抗原制备pAb。Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果:酶切及测序鉴定证明,IRS4基因已正确插入到pGEX-Teasy中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为44ku的融合蛋白。用Westernblot鉴定所制备的多克隆抗体可以与IRS4特异性结合。结论:IRS4片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到多克隆抗体,为检测IRS4及其在其他组织中的表达,进一步研究磷酸化酪氨酸结合结构域(PTB)的结构和生物学功能奠定基础。  相似文献   

14.
目的构建间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)融合表达载体,并表达PvLDH的GST融合蛋白。方法将PvLDH基因片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建PvLDH/pGEX-4T-1融合表达载体,IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PvLDH/pGEX-4T-1融合表达系统,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物能与恶性疟原虫和间日疟原虫感染患者血清反应,而不与正常人血清反应。结论间日疟原虫LDH蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有良好的抗原性。  相似文献   

15.
目的克隆、表达高迁移率族蛋白1A盒(HMGB1 A box)与LBPK95A的融合基因。方法经加端-PCR获得HMGB1A盒与LBPK95A的融合基因。该基因克隆到pGEX-4T-2载体中转化TOP10感受态细胞,测序鉴定。将A—LBP质粒转化E.coli BL21,30℃诱导表达4h,超声裂解后经GSTrapFF蛋白纯化柱纯化,进行SDS—PAGE分析。结果DNA测序证明,获得了HMGB1A盒与LBPK95A的融合基因。SDS—PAGE分析表明,A—LBP融合蛋白在原核中获得高效表达,表达量约占菌体总蛋白的28%,GSTrapFF纯化后获得目的蛋白。结论成功表达和纯化了HMGB1A盒与LBPK95A的融合蛋白。  相似文献   

16.
目的研究核包膜蛋白gp210基因在大肠杆菌中的稳定表达、纯化和免疫学活性鉴定。方法从人外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法扩增gp210蛋白中含优势表位的基因片段。将该段基因克隆入PET-30a表达载体并转化到大肠杆菌BL21中表达。融合蛋白经Ni-NAT树脂柱进行亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE电泳及ELISA方法进行鉴定。结果在原核表达载体中成功构建了PET30a-gp210重组体。重组体诱导培养后,SDS-PAGE电泳分析可见在相对分子量大约69 kD处有gp210融合蛋白的高效表达,经纯化获得纯度达90%的表达蛋白。ELISA检测结果显示该重组蛋白具有较好的抗原性和特异性。结论应用基因工程方法,获得了gp210重组蛋白,为检测抗gp210抗体提供了特异性抗原,也为临床将抗gp210抗体作为PBC的特异性诊断指标奠定了基础。  相似文献   

17.
目的用基因工程的方法获得乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)编码区的基因片段,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达抗原蛋白。方法用PCR法扩增HBcAg基因片段,构建含有HBcAg基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中以IPTG诱导重组蛋白的表达,并用Western blot对重组蛋白进行检测。结果重组HBcAg在大肠杆菌中得到表达,Western blot检测显示在预期位置出现特异性条带。结论成功构建HBcAg原核表达系统并获得重组HBcAg,为该重组蛋白的相关功能研究奠定了基础。  相似文献   

18.
曾涛  何德 《检验医学与临床》2013,10(12):1489-1490,1492
目的构建并表达携带谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的人泛素-核糖体蛋白S27a(UBRPS27a)原核表达载体。方法利用反转录聚合酶链反应从HL-60细胞中扩增RPS27A基因全长,克隆至pMD-19T载体中,酶切回收后插入原核表达载体pGEX4T-1,构建重组表达载体pGEX4T1-RPS27A,转化大肠埃希菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达GST-UBRPS27a融合蛋白。结果经测序与酶切鉴定,重组质粒pGEX4T1-RPS27A构建正确;经重组质粒转化的BL21细菌诱导4h后可高效表达UBRPS27a融合蛋白。结论成功构建UBRPS27a原核表达载体,为进一步研究其结构、功能及其在肿瘤发生发展中的作用奠定了基础。  相似文献   

19.
目的构建含截短的HCV核心蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的重组杆状病毒表达载体,探讨其在Sf9细胞中的表达和抗原性。方法用PCR法扩增截短的HCV核心蛋白基因片段(Ct)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将其插入转座子载体pFastBac1,构建成重组表达载体pFastCt-EGFP,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒穿梭质粒BacmidCt-EGFP,转染昆虫Sf 9细胞。结果SDS-PAGE和western blot鉴定表明成功表达了分子量约40 000的融合蛋白。以ELISA法检测发现该融合蛋白能与28份抗HCV抗体阳性血清中的15份发生反应,阳性率为53.6%。结论该融合蛋白在昆虫Sf 9细胞中成功表达并具有一定的抗原性。  相似文献   

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