可调控性鼠PLP-Ig嵌合体重组腺病毒载体的构建和表达

目的 :构建和表达可调控鼠蛋白脂质蛋白 (PLP) 免疫球蛋白重组腺病毒载体。方法 :采用常规分子生物学方法 ,从WT 1杂交瘤细胞中抽提总RNA ,克隆小鼠Ig重链Fc基因。将编码PLP13 9-151的DNA与信号肽设计在引物上 ,经两次克隆可形成可分泌型PLP Ig。经穿梭载体与可调控性腺病毒载体骨架连接 ,鉴定后在HEK2 93细胞中包装。获得高滴度病毒后 ,用Westernblot鉴定目的基因的表达。结果 :PLP Ig重组腺病毒经测序、限制性内切酶酶切分析及PCR等鉴定 ,同预期结果相一致。Westernblot检测病毒感染的细胞 ,发现目的基因得到特异性表达且可被四环素调节。结论 :构建了可调控的小鼠PLP Ig重组腺病毒载体并得到正确表达 ,为进一步基因治疗实验性变态反应性脑脊髓炎 (EAE)和诱导免疫耐受奠定了基础     

人IL-1RⅡ基因腺病毒载体的构建及在子宫内膜异位症细胞中的表达

目的：利用AdEasy XL系统，构建并鉴定IL-1RⅡ基因重组腺病毒载体，并在子宫内膜异位症（EM）细胞中表达。方法-PCR扩增含有IL-1RⅡ全长cDNA的片段，亚克隆到pShuttle—CMV穿梭质粒，经酶切和测序验证无误后，再经电转化与pAdEasy-1质粒在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组产生腺病毒载体质粒。经过抗性筛选、酶切鉴定以及再次测序验证无误后得到阳性的重组质粒，经PacⅠ酶切线性化再在293细胞中进行包装扩增，用ELISA检测IL-1RⅡ蛋白的表达。利用Adeasy XL系统的对照载体pShuttle-CMV-LacZ同上操作作为对照。收集的重组腺病毒感染原代培养的EM基质细胞，并以免疫组化法鉴定IL-1RⅡ表达。结果：测序证实连接后IL-1RⅡ序列完全正确；抗性筛选及酶切鉴定均表明重组腺病毒载体构建成功；pShuttle-CMV-LacZ转染293细胞3d后x-gal染色阳性，回收病毒可以重复感染293细胞，ELISA鉴定表达IL-1RⅡ可溶性蛋白，证明病毒包装成功。重组的腺病毒感染EM基质细胞后，免疫组化法证实IL-1RⅡ表达。结论：成功地构建了IL-1RⅡ基因重组腺病毒载体，并且在EM基质细胞中表达，为进一步研究IL-1RⅡ基因在EM中的作用乃至生物治疗都奠定了基础。     

携带HSP70-HBsAg嵌合基因复制缺陷型重组腺病毒的制备

目的 构建表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和热休克蛋白70(HSPT0)嵌合基因的复制缺陷型重组腺病毒载体.方法扩增结核分枝杆菌HSP70基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV-HBsAg上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠埃希菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBsAg-HSP70嵌合基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹Pac Ⅰ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装.体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达.结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBsAg-HSP70.重组质粒pAd-HBsAg-HSP70导入293细胞,经包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBsAg-HSP70,其病毒滴度达2×1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论成功构建表达HBsAg-HSP70复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.     

大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

背景：研究表明,神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子,因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰,有可能将成体细胞转分化为神经细胞,为视神经再生治疗提供新策略。 目的：构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体,获得重组腺病毒pAd-rat-ASCL1-EGFP,以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。 方法：用XhoⅠ和 EcoRⅠ将目的基因 ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体 pYr-adshuttle-4进行双酶切;回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至 DH5α感受态;提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pAd/PL-DEST腺病毒表达载体,PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度,荧光显微镜观察病毒感染效率。 结果与结论：通过酶切鉴定和DNA测序鉴定,证实重组腺病毒载体pAd-rat-ASCL1-EGFP构建正确,PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带,TCID50法测定病毒滴度为2×1010 pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功,获得的病毒具有高滴度,高效感染率,为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

以CⅡTA-pⅠ作为树突状细胞特异启动子构建腺病毒双表达载体

目的 构建CⅡTA-p Ⅰ启动子特异调控的鼠TGF-β1和PLP-Ig重组双表达载体，以期达到在树突状细胞中特异表达。方法 从鼠外周血单个核细胞克隆CⅡTA-p Ⅰ启动子，从ConA刺激的小鼠脾单个核细胞和WT-1杂交瘤细胞克隆TGF-β1基因和Ig重链Fc基因；体外经IRES序列连接后，通过穿梭载体与腺病毒载体骨架连接，鉴定后在HEK293包装。从小鼠骨髓造血细胞培养树突状细胞。流式细胞仪检测树突状细胞CD80、CD54和Ⅰ-A^d的表达，鉴定树突状细胞的成熟度和纯度。病毒转染后，采用ELISA方法鉴定该病毒在树突状细胞中TGF-β1基因的表达水平；Western blot鉴定PLP-Ig的表达。结果 该双表达重组腺病毒载体经测序、限制性内切酶分析、PCR等鉴定，与预期结果一致；病毒感染树突状细胞的培养上清液和细胞分别经ELIS和Western blot检测证实TGF-β1和PLP-Ig得到了独立表达，在HEK293细胞中则无表达，并随树突状细胞的成熟，表达量逐渐增高。结论 以CⅡTA-p Ⅰ作为树突状细胞特异启动子构建的重组腺病毒双表达载体，在树突状细胞中得到了特异、独立的表达，为靶向树突状细胞表达功能基因进行基因治疗奠定了基础。     

小鼠GITRL基因腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建重组腺病毒pAdEasy-GFP-GITRL,并测定病毒滴度。方法:从PIRES-GITRL载体上用BglⅡ和SalⅠ双酶切,回收目的基因GITRL,插入同样用BglⅡ和SalⅠ双酶切的穿梭质粒pAdtrack-CMV中,将线性化穿梭质粒骨架质粒pAdEasy-1共转染BJ5183菌,鉴定正确后,将重组腺病毒载体pAdEasy-GFP-GITRL转染HEK293细胞,以包装出完整腺病毒。TCID50法测定重组腺病毒滴度,Western blot法检测GITRL蛋白表达。结果:成功构建小鼠GITRL基因的重组腺病毒载体(pAdEasy-GFP-GITRL),经包装后获得高滴度表达GITRL基因的重组腺病毒,病毒滴度为2.0×109pfu/mL。Western blot结果显示重组病毒载体能表达GITRL蛋白。结论:重组腺病毒表达载体(pAdEasy-GFP-GITRL)的成功构建及重组腺病毒的获得为GITRL基因干预治疗奠定了基础。     

pri-miR-21重组腺病毒载体构建及其对TLR4基因调控的研究

目的:构建能高效表达成熟miR-21小分子的腺病毒载体,探讨其对TLR4基因的靶向调控关系。方法:以正常小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增pri-miR-21基因,克隆至穿梭载体pAdTrack-CMV中经PCR、酶切及基因测序分析正确无误后,与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒进行同源重组,并利用293A细胞,包装成pri-miR-21重组腺病毒感染HeLa细胞,通过Western blot检测TLR4的蛋白表达水平,验证miR-21与TLR4靶向调控的关系。结果:经PCR、酶切、测序及GFP表达证实,成功构建携带pri-miR-21基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。Western blot证实,miR-21可抑制TLR4蛋白的表达。结论:所制备的小鼠pri-miR-21重组腺病毒,可以高效表达成熟miR-21小分子,能够抑制靶基因TLR4的表达。     

表达人B7-1的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的构建表达B7-1基因的重组腺病毒载体,制备相应的复制缺陷型重组腺病毒并检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建携带人B7-1基因的重组穿梭载体pAdtrack-B7-1,PmeI线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-B7-1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株,RT-PCR检测感染细胞中B7-1基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrackB7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。制备的Ad-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6d高水平的B7-1的表达,整体表达可持续两周。结论成功构建了同时表达B7-1的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的B7-1基因,为进一步研究B7-1的功能及应用B7-1进行基因治疗奠定基础。     

弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体的构建、鉴定与表达

目的：构建elafin基因高效表达重组腺病毒载体Ad-elafin。方法：抽提人肺总RNA进行逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）扩增elafin基因，PCR产物双酶切后亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上；在BJ5183细菌内与pAdEasy-1同源重组，筛选阳性克隆，酶切、PCR及测序鉴定；PacⅠ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装，获得腺病毒载体Ad-elafin；继之在293细胞内扩增，利用报告基因GFP监测病毒滴度和感染效率，Western blot检测elafin蛋白的表达，ELISA鉴定elafin蛋白对弹性蛋白酶活性拮抗作用。结果：酶切、PCR、蛋白表达测定及拮抗弹性蛋白酶活性初步鉴定证实弹性蛋白酶特异性抑制因子elafin基因重组腺病毒载体Ad-elafin构建成功。结论：成功构建了重组腺病毒载体Ad-elafin，为进一步深入研究慢性阻塞性肺疾病的发病机制奠定了技术基础。     

人Qki-5基因重组腺病毒的制备

目的:构建针对Qki-5人重组腺病毒表达载体,并在能在转染该病毒的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中观察到该基因过表达效果.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-Qki-5-IRES-EGFP与骨架载体共转化到大肠杆菌BJ5183中,同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染Qki-5表达较低的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western blot方法检测细胞中基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对Qki-5基因的重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western blot方法证实,在MDA-MB-231细胞中,Qki-5基因在mRNA和蛋白水平均有上升.结论:Qki-5腺病毒载体够建成功并且可以在乳腺癌细胞MDA-MB-231内表达.     

小鼠HAX-1基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的构建小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体，以期进一步进行系统性红斑狼疮模型BXSB小鼠的体内实验研究。方法用RT-PCR方法扩增小鼠全长Hax-1基因，经T／A克隆后，亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上，在BJ5183细菌中和AdEasv-1进行同源重组，筛选阳性克隆，酶切、测序鉴定正确后，脂质体法转染AD-293细胞进行包装，扩增，氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度。RT-PCR鉴定重组腺病毒转染AD-293细胞后Hax-1的表达，同时进行野生型腺病毒的检测。结果经酶切及测序证实Hax-1基因重组腺病毒载体构建成功。PCR检测转染后AD-293细胞内Hax-1基因水平的表达，且无野生型腺病毒的产生。结论成功构建了含小鼠Hax-1基因的重组腺病毒载体，为探讨Hax-1的生物学功能奠定了基础。     

1人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建并鉴定人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体.方法 以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增TLR4胞外区目的 基因片段,片段回收后经酶切连接穿梭质粒pAdTrack-CMV上,获得重组腺病毒质粒pAdTrack-CMV-TLR4.通过Kpn Ⅰ和HindⅢ双酶切,测序鉴定后,将鉴定正确的质粒经PmeⅠ酶切线性化后,转化到含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183中,进行同源重组,卡那抗性筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR技术,Western blot等方法鉴定重组腺病毒,并进行病毒滴度测定.结果 人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体构建正确,病毒滴度为3.2×109pfu/mL.结论 成功构建了人TLR4胞外区基因重组腺病毒载体,为下一步实验奠定基础.     

共表达人B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的构建能同时表达B7—1和HGF／NK4基因的重组腺病毒载体，同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒，检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建以串联方式携带人B7-1和HGF／NK4基因的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1。Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd—NK4-B7—1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒，应用病毒悬液感染人喉癌细胞株。用RT-PCR检测感染细胞中B7-1和NK4基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrack—NK4-B7—1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF／NK4，同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体，该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装，转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达并逐渐增多、增强。制备的Ad—NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞，感染后可维持6d高水平的B7—1和NK4基因的表达，整体表达可持续2周。结论成功构建了同时表达B7．1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒，该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因，为进一步研究B7—1和NK4基因的功能及应用B7—1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材。     

人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 ,为进一步实现其在雪旺细胞中可调控的高效表达奠定了基础     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。 目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。 方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达。 结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×10¹¹ pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒

目的：利用大肠杆菌细菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度重组病毒。方法：自细胞周期相关激酶真核表达载体pCR31-CCRK中酶切出CCRK基因，亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中，形成转移质粒pAdTrack-CMV-CCRK，采用电穿孔或化学转化法在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组，得到重组腺病毒载体pAd-CCRK。以pAd-CCRK为模板，经DNA测序正确后，用Pac Ⅰ酶切线性化pAd-CCRK，转染293细胞，包装成重组病毒颗粒，荧光显微镜观察转染细胞EGFP的表达，采用PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。将重组病毒上清感染RAW细胞，荧光显微镜下观察感染细胞重组病毒的表达。结果：成功地构建了携带CCRK基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒，重组病毒能在体外高效表达。结论：应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体，可高效制备均一的高滴度重组病毒，为CCRK基因功能的研究奠定了基础.     

共表达人B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的 构建能同时表达B7-1和HGF/NK4基因的重组腺病毒载体,同时制备相应的复制缺陷型重组腺病毒,检测其在喉癌细胞中的表达.方法 构建以串联方式携带人B7.1和HGF/NK4基凶的重组穿梭载体pAdtrack-NK4-B7-1.Pme I线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-NK4-B7-1.将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株.用RT-PCR检测感染细胞中B7.1和NK4基因mRNA表达.结果 酶切鉴定证实阳性pAdTrack-NK4-B7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1和HGF/NK4,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3 d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强.制备的Ad-NK4-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6 d高水平的B7-1和NK4基因的表达,整体表达可持续2周.结论 成功构建了同时表达B7-1和NK4基因的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的NK4和B7-1基因,为进一步研究B7-1和NK4基凶的功能及应用B7-1和NK4进行喉癌的联合基因治疗提供了依据和素材.     

人转化生长因子β1基因重组腺病毒的构建与鉴定

背景：转化生长因子β1能促进多种细胞的生长增殖,是调控骨髓间充质干细胞向成骨方向定向分化的主要生长因子。 目的：利用AdMax系统构建人转化生长因子β1(hTGF-β1)基因的重组腺病毒表达载体。 方法：采用PCR方法克隆人转化生长因子β1基因cDNA后,插入线性化表达载体pAV-MCMV-EGFP-3FLAG中,转化E.coli DH5α感受态细胞,构建pAV-MCMV-hTGF-β1重组质粒。 结果与结论：含目的基因的重组腺病毒质粒共转染293细胞进行病毒包装、扩增后, 经PCR、Western Blot检测得到转化生长因子β1重组腺病毒,其滴度约为1.25×10¹⁰ pfu/mL。表明利用AdMax系统成功可构建人转化生长因子β1腺病毒载体,并可满足进一步的转化生长因子β1成骨作用的研究。     

人NRAGE基因重组腺病毒载体的构建及其对293细胞细胞周期的影响

目的构建hNRAGE基因的重组腺病毒载体,并研究其对293细胞细胞周期的影响。方法采用PCR方法扩增hNRAGE基因片段,并亚克隆至腺病毒穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中,构建穿梭质粒pAdTrack-CMV/hNRAGE。经测序检测后,用PmeI酶切使pAdTrack-CMV/hNRAGE被线性化,然后与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1用电穿孔法共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组。经PacI酶切鉴定后,用磷酸钙法转染QBI-293A细胞,包装成重组体腺病毒Ad-hNRAGE颗粒。利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中GFP报告基因的表达,观察重组腺病毒的产生,测定病毒颗粒的浓度。用Western blot检测目的基因的表达。采用MTT法检测293细胞的活力,用流式细胞术分析hNRAGE基因对293细胞周期的影响。结果成功地构建hNRAGE重组腺病毒载体。Western blot检测结果证实,hNRAGE基因可在293细胞中表达。收获病毒后,经测定病毒颗粒的浓度大约为6.5×109个/μL。转染了重组腺病毒Ad-hNRAGE的293细胞与正常细胞相比较,增殖率显著降低,G0-G1和G2-M期的细胞增多,S期的细胞明显减少。结论hNRAGE基因可能有抑制293细胞生长的作用。     

表达Cre酶复制缺陷型重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择。方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;W estern b lot方法鉴定Cre蛋白的表达。结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白。结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础。