ROS/GADD153蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导心肌细胞凋亡中的作用

目的 探讨活性氧簇(ROS)/GADD153蛋白在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌细胞凋亡中的作用.方法 体外培养乳鼠心肌细胞,随机分为9组(n=5),Ⅰ组(C组)常规心肌细胞培养,不予其他处理;Ⅱ组(AngⅡ6组)给予100 nmol/L AngⅡ,孵育6 h;Ⅲ组(AnsⅡ12组)给予100 nmol/L AngⅡ,孵育12 h;Ⅳ组(ArtsⅡ24组)给予100 nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;V组[N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)+AngⅡ组]预先给予抗氧化剂NAC 5 mmol/L,2 h后给予100 nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;Ⅵ组(NAC组)仅给予NAC 5 mmol/L,孵育24 h;Ⅶ组(anti-ODN组)GADD153反义寡核苷酸10 μmol/L转染24 h后,加入100nmoFL AngⅡ,孵育24 h;Ⅷ组(mis-ODN组)GADDl53错义寡核苷酸10 μmol/L转染24 h后,加入100nmol/L Ang Ⅱ,孵育24 h;Ⅸ组(脂质体对照组)加入等容量转染试剂,孵育24 h.检测细胞活力、细胞内ROS产量、细胞凋亡率及GADD153蛋白表达水平.结果 与C组相比,AngⅡ6组、AngⅡ12组、AngⅡ24组细胞活力降低,细胞凋亡率、ROS产量及GADD153蛋白表达升高,且呈时间依赖性(P＜0.05);与AngⅡ24组比较,NAC+AngⅡ组和anti-ODN组细胞活力升高,细胞凋亡率、ROS产量及GADD153蛋白表达降低(P＜0.05).结论 AugⅡ通过增加ROS产量,诱导GADD153蛋白表达上调,从而导致心肌细胞凋亡的发生.     

二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时NF-κB mRNA和fractalkine mRNA表达的影响

目的 探讨二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时NF-κB mRNA和fractalkine(FKN)mRNA表达的影响.方法 培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml的密度接种于96孔板(100μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),随机分为4组(n=24).正常对照组(C组)不作任何处理,缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)、二氮嗪预先给药+线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸组(DZ+5-HD组)均进行缺氧2 h、复氧2 h.DZ组和DZ+5-HD组在缺氧前2 h分别加入100 μmol/L二氮嗪、100 μmol/L二氮嗪+100μmol/L 5-羟葵酸.于复氧2 h时测定细胞活力、细胞凋亡率、NF-κB mRNA和FKN mRNA表达水平.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,NF-κB mRNA和FKN mRNA表达上调(P＜0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,NF-κB mRNA和FKN mRNA表达下调(P＜0.05);5-羟葵酸可抑制二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05).结论 二氮嗪预先给药可下调NF-κB和FKN表达,从而减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤,其机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关.     

结缔组织生长因子介导血管紧张素Ⅱ诱导的人肾近端小管细胞肥大机制

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)介导血管紧张素(Ang)Ⅱ致肾小管上皮细胞肥大的可能作用机制。方法用AngⅡ刺激体外培养的人肾近端小管上皮细胞株(HK-2),以流式细胞仪观察抗CTGF抗体(0.5μg/ml)对AngⅡ(10-7mol/L)诱导的细胞周期分布改变的影响。用RT-PCR观察不同浓度AngⅡ(0、10-9、10-7、10-5mol/L)刺激细胞48h,和AngⅡ(10-7mol/L)在不同时间点(0、24、48、72h)时HK-2细胞p27kip1mRNA表达情况;同时观察抗CTGF抗体(0.5μg/ml)对AngⅡ(10-7mol/L)诱导p27kip1mRNA表达变化的影响。用免疫细胞化学法观察抗CTGF抗体(0.5μg/ml)对AngⅡ(10-7mol/L)诱导的细胞p27kip1蛋白表达的影响。结果AngⅡ使G0～G1期细胞百分比明显增加(P<0.01),抗CTGF抗体可显著抑制AngⅡ诱导的细胞周期阻滞(P<0.05)。AngⅡ呈时间和浓度依赖性刺激p27kip1mRNA表达上调(P均<0.05),抗CTGF抗体可以显著抑制AngⅡ诱导的p27kip1mRNA表达的增加(P<0.05),免疫细胞化学显示AngⅡ可显著增加肾小管上皮细胞p27kip1蛋白表达,此作用可被抗CTGF抗体抑制。结论CTGF在AngⅡ诱导HK2细胞肥大中可能发挥重要的作用,其机制可能与抑制细胞表达p27kip1,并逆转细胞增殖周期阻滞有关。     

氟伐他汀对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞核因子κB活性的影响

目的 观察氟伐他汀对血管紧张素（Ang）Ⅱ诱导的大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）内核因子（NF）κB活性的影响。 方法 将NRK-52E细胞分为（1）对照组;（2）不同浓度及时间AngⅡ组;（3）AngⅡ（10-6 mol/L）+SB203580（10 μmol/L）组;（4）AngⅡ（10-6 mol/L）+不同浓度氟伐他汀（10-7、10-6、10-5 mol/L）组;(5)AngⅡ（10-6 mol/L）+氟伐他汀（10-5 mol/L）+甲羟戊酸（10-4 mol/L）组。电泳迁移率变动分析法（EMSA）检测NF-κB活性变化。Western印迹方法检测p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)磷酸化水平。RT-PCR方法检测单核细胞趋化因子（MCP-1）mRNA表达。 结果 AngⅡ呈剂量依赖性上调NF-κB DNA结合活性、p38MAPK的磷酸化水平以及MCP-1 mRNA表达（P < 0.01）。AngⅡ(10-6 mol/L) 刺激5 min即可增加p38MAPK蛋白磷酸化水平（P < 0.01）。AngⅡ刺激30 min后NF-κB活性显著升高（P < 0.01）,2 h达高峰（P < 0.01）。p38MAPK 特异性抑制剂SB203580可阻断AngⅡ对NF-κB的激活作用（P < 0.01）。氟伐他汀可呈剂量依赖性下调AngⅡ诱导的NRK-52E细胞内p38MAPK磷酸化和NF-κB活化,以及其下游趋化因子MCP-1表达（P < 0.05）。甲羟戊酸（10-4 mol/L）可逆转氟伐他汀的作用（P < 0.05）。 结论 氟伐他汀可能通过抑制p38MAPK信号转导通路,下调AngⅡ诱导的NRK-52E细胞内NF-κB的活化。甲羟戊酸可部分逆转氟伐他汀的作用。     

血管紧张素Ⅱ诱导Toll样受体4在腹膜间皮细胞的表达及其对脂多糖诱导CD40表达的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）对原代培养大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）Toll样受体4（TLR4）表达的影响及其在脂多糖（LPS）诱导的核转录因子κB （NF-κB）活化及CD40表达中的作用。 方法 分离及培养RPMC。用不同浓度AngⅡ（10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L）刺激细胞及用10-7 mol/L AngⅡ刺激细胞不同时间（mRNA为1、2、4、8、12、24、48 h和蛋白为6、12、24、36、48 h），观察血管紧张素1型受体（AT1R）阻滞剂洛沙坦（10－5 mol/L）和血管紧张素2型受体（AT2R）阻滞剂PD123177（10-5 mol/L）对AngⅡ诱导TLR4表达的影响。将细胞随机分为下列4组：对照组、AngⅡ (10－7 mol/L)组、LPS(1 mg/L)组、AngⅡ (10－7 mol/L)+LPS(1 mg/L)组，观察AngⅡ对LPS诱导的NF-κB激活和CD40表达的影响。RT-PCR检测TLR4、CD40 mRNA表达；Western印迹检测TLR4、IκBα、磷酸化IκBα（p-IκBα）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白表达；免疫荧光检测细胞NF-κB p65亚单位的表达及分布。 结果 (1)10－9、10－8、10－7、10－6 mol/L AngⅡ作用RPMC 12 h，TLR4 mRNA表达分别增加70.5%、89.5%、102.9%和121.9%；作用24 h TLR4蛋白表达分别增加12.1%、27.7%、51.2%和41.6%。AngⅡ（10－7 mol/L）作用RPMC不同时间，TLR4 mRNA表达高峰为8 h和12 h（P < 0.01），蛋白表达高峰为12 h和24 h（P < 0.01）。(2)洛沙坦阻断后，AngⅡ诱导的TLR4表达与未阻断组比较，下调33.5%（P < 0.05）。PD123177对AngⅡ诱导的TLR4表达无显著影响（P > 0.05）。(3) 与正常对照组比较，LPS作用60 min p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调362.6%（P < 0.01）和67.4%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调299.9%（P < 0.01）；与LPS组比较，AngⅡ预刺激24 h加LPS作用60 min，p-IκBα/IκBα、p-p65/p65表达分别上调49.1%（P < 0.01）和29.3%（P < 0.05）；作用4 h CD40 mRNA表达上调56.8%（P < 0.01）。(4)免疫荧光结果显示正常对照组与AngⅡ组细胞中，p65信号定位于细胞胞质；LPS作用60 min，p65信号从胞质进入胞核；AngⅡ+LPS组NF-κB p65胞核信号显著增强。 结论 AngⅡ呈浓度、时间依赖性诱导RPMC TLR4表达，并显著增强LPS诱导NF-κB激活及CD40的表达。提示腹膜组织局部产生的AngⅡ可能对LPS诱导的腹膜组织炎性反应具有放大作用。     

二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时PI3K mRNA和Akt mRNA表达的影响

目的 评价二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K) mRNA和蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt) mRNA表达的影响.方法 培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106个/ml密度接种于96孔培养板(100μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=25).正常对照组(C组)不作任何处理;缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)、二氮嗪预先给药+线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸组(DZ+ 5-HD组)均进行缺氧2h,复氧2h.DZ组和DZ+ 5-HD组在缺氧前2h分别加入100 μmol/L二氮嗪、100μnol/L二氮嗪+ 100 μmol/L 5-羟葵酸.于复氧2h时测定细胞活力、细胞凋亡率、PI3K mRNA和Akt mRNA表达.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,PI3K mRNA和Akt mRNA表达上调(P＜0.05或0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,PI3K mRNA和Akt mRNA表达上调(P ＜0.05或0.01);5-羟葵酸可逆转二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05或0.01).结论 二氮嗪预先给药减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤的机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道,促进PI3K和Akt基因的转录有关.     

雌激素和孕酮对人脐静脉内皮细胞组织因子表达的影响

目的探讨17β-雌二醇(E2)和孕酮(P)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)组织因子(TF)mRNA表达和蛋白合成的影响。方法原代培养的HUVECs,分别给予10-6mol／L,血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)单独或合并10-9、10-7、10-5mol／L 17β- E2或P处理细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察TF mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)和双辛丁酸法测定细胞裂解液中TF蛋白浓度。结果 10-6mol／L Ang Ⅱ对HUVECs有明显的损伤作用,内皮细胞TF mRNA表达和蛋白合成均显著增加,10-9mol／L17β-E2明显抑制Ang Ⅱ对内皮细胞TF mRNA表达和蛋白合成的刺激作用,但随着雌激素浓度的增加,抑制作用逐渐减弱;而随着P浓度的增大,增加了Ang Ⅱ刺激内皮细胞TF mRNA表达和TF蛋白合成的作用,加重了对内皮细胞的损伤。结论低剂量的雌激素对内皮细胞有保护作用,随着雌激素浓度的增加,这种保护作用逐渐减弱;低剂量的P对内皮细胞无保护作用,高剂量P对内皮细胞有损伤作用。     

氟伐他汀联合氯沙坦对血管紧张素Ⅱ诱导的人足细胞血管内皮生长因子表达的影响及机制研究

目的 探讨氟伐他汀联合氯沙坦对血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)诱导的人足细胞血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响及机制.方法 体外培养人足细胞株,采用不同浓度的AngⅡ(10-9～10-5mol/L)刺激人足细胞,另予氟伐他汀(10-7、10-6、10-5 mol/L)和(或)氯沙坦(10-7、10-6、10-5 mol/L)、ERK特异性阻断剂PD98059( 5× 10-5 mol/L)干预.Western印迹法检测VEGF、磷酸化(p)ERK1/2蛋白的表达.RT-PCR法检测VEGF mRNA的表达.结果 AngⅡ刺激后,人足细胞VEGF mRNA和蛋白的表达显著增加(P＜0.05),p-ERK1/2增加(P＜0.05).氟伐他汀、氯沙坦及PD98059均可下调AngⅡ诱导的VEGF mRNA和蛋白表达及ERK1/2磷酸化(P＜0.05),而氟伐他汀和氯沙坦联合干预较单独作用抑制效果更为显著(P＜0.01).结论 氟伐他汀和氯沙坦均可抑制AngⅡ诱导足细胞VEGF的过表达,且两者联合具有协同作用.抑制ERK信号通路可能是实现其联合作用的机制之一.     

血管紧张素Ⅱ诱导VEGF mRNA在人肝癌细胞中的表达

目的研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对人肝癌HepG2细胞血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响。方法体外培养人肝癌HepG2细胞,采用不同浓度的AngⅡ进行处理,收集处理后不同时点的细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量法,分别检测AngⅡ处理前后HepG2细胞VEGFmRNA的表达;同时利用MTT法检测AngⅡ对HepG2细胞增殖的影响。结果AngⅡ能刺激HepG2细胞增殖,并增强VEGFmRNA的表达(P0.05)。这种作用呈浓度-时间依赖效应,当AngⅡ浓度为10-7mol/L,时间为60h时,这种作用达到最高值,且此作用可被AngⅡ1型受体(AT1R)拮抗剂所阻断。结论AngⅡ可以通过AT1R诱导人肝癌细胞VEGFmRNA的表达,对肝癌的生长及转移可能起到一定的促进作用。     

二氮嗪预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时缺氧诱导因子-1α mRNA和p53mRNA表达的影响

目的 探讨二氮嚓预先给药对大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧时缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)mRNA和p53 mRNA表达的影响.方法 培养SD大鼠心肌微血管内皮细胞,以1×106/ml的密度接种于96孔板(100μl/孔)或培养皿(2 ml/皿),采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=24):正常对照组(C组)不作任何处理,缺氧复氧组(H/R组)、二氮嗪预先给药组(DZ组)、二氮嗪预先给药+线粒体ATP敏感性钾通道阻断剂5-羟葵酸组(DZ+5-HD组)均进行缺氧2 h复氧2 h.DZ组和DZ+5-HD组在缺氧前2 h分别加入100μmol/L二氮嗪、100μmol/L二氮嗪+100μmol/L 5-羟葵酸.于复氧2h时测定细胞活力、细胞凋亡率、HIF-1α mRNA和p53 mRNA表达水平.结果 与C组比较,H/R组细胞活力降低,细胞凋亡率升高,HIF-1αmRNA和p53 mRNA表达上调(P＜0.01);与H/R组比较,DZ组细胞活力升高,细胞凋亡率降低,HIF-1αmRNA表达上调,p53 mRNA表达下调(P＜0.05或0.01);5-羟葵酸可抑制二氮嗪预先给药导致的上述改变(P＜0.05).结论 二氮嗪预先给药可上调HIF-1和下调p53表达,从而减轻大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧复氧损伤,其机制与激活线粒体ATP敏感性钾通道有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of diazoxide pretreatment on the expression of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) mRNA and p53 mRNA in rat myocardial microvascular endothelial cells exposed to hypoxia-reoxygenation (H/R).Methods The SD rat myocardial microvascular endothelial cells were cultured. The cells were seeded in 96-well plates ( 100 μl/hole) or in 6 cm diameter dishes (2 ml/dish) with the density of 1 ×106/ml and randomly divided into 4 groups ( n = 24 each): normal control group (group C), H/R group, H/R +diazoxide pretreatment group (group DZ) and H/R + diazoxide pretreatment + mitochondrial ATP-sensitive potassium channel blocker 5-hydroxydecanoate (5-HD) group (group DZ + 5-HD). The cells were exposed to 2 h hypoxia followed by 2 h reoxygenation. Diazoxide 100 μmol/L and diazoxide 100 μmol/L + 5-HD 100 μmol/L were added to the culture medium 2 h before hypoxia in DZ and DZ + 5-HD groups respectively. The cell vitality, apoptotic rate and expression of HIF-1α mRNA and p53 mRNA were detected at the end of reoxygenation. Results Compared with group C, the cell vitality was significantly decreased, apoptotic rate increased and the expression of HIF- 1α mRNA and p53 mRNA up-regulated in H/R group ( P ＜ 0.01). Compared with group H/R, the cell vitality was significantly increased, apoptotic rate decreased, the expression of HIF-1α mRNA up-regulated and the expression of p53 mRNA down-regulated in group DZ ( P ＜ 0.05 or 0.01 ). 5-HD could inhibit diazoxide pretreatment-induced changes mentioned above (P ＜ 0.05 ). Conclusion Diazoxide pretreatment can reduce H/R injury in rat myocardial microvascular endothelial cells through up-regulating the expression of HIF-1α and down-regulating the expression of p53, and the mechanism is related to activation of mitochondrial ATP-sensitive potassium channels.     

TRPC6高表达对血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠足细胞凋亡的影响

目的 观察瞬间受体电位阳离子通道蛋白6(TRPC6)高表达对血管紧张素Ⅱ(AnglI)诱导的小鼠足细胞凋亡的影响并探讨其作用机制.方法 用脂质体将针对小鼠TRPC6的基闪真核表达载体pEGFP.N1.mTRPC6转染体外培养的永生化小鼠足细胞系.24 h后用荧光显微镜观察增强绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.Western印迹法检测转染后TRPC6蛋白表达的变化.将足细胞分组,应用不同浓度AngⅡ处理足细胞,Fluo-3AM结合激光共聚焦显微镜检测各组足细胞胞质内钙离子的浓度.RT-PCR及Westem印迹法检测Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的水平.流式细胞仪及Hoeehst染色法榆测足细胞凋亡.结果 pEGFP-NI-mTRPC6转染足细胞后,约35%细胞出现绿色荧光;足细胞TRPC6蛋白表达明显上调(P<0.01).TRPC6高表达町以明显促进AngII诱导的足细胞钙离子内流(P<0.01),在蛋白及基因水平均上调Bax的表达而下调Bcl.2的表达(P<0.01,P<0.05).在低剂量Ang Ⅱ(10-10mol/L)作用下.足细胞凋亡率为(2.50±0.72)%,转染TRPC6以后凋亡率为(4.33±0.45)%,差异有统计学意义(P<0.05).在高剂量Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用下,足细胞凋亡率为(15.46±1.40)%.转染TRPC6以后凋亡率为(18.33±0.87)%,差异有统计学意义(P<0.01).结论 TRPC6在AngⅡ诱导的足细胞凋亡中发挥重要作用.TRPC6可能通过增加钙离子内流,进而启动其下游的捌亡调节成分参与凋亡过程.     

左旋布比卡因和布比卡因对体外人中性粒细胞黏附分子CD11b表达的影响

目的评价左旋布比卡因和布比卡因对体外人中性粒细胞(PMN)黏附分子CD11b表达的影响。方法健康志愿者12名,男性、女性各6名,体重55～68kg,年龄20～25岁。每名健康志愿者取8份(每份0.2ml)血样,分别随机接受不同处理:0.2ml血样+10μl磷酸盐缓冲液,37℃孵育60 min(对照组,Ⅰ组);Ⅱ组、Ⅲ组在Ⅰ组基础上分别加入血小板活化因子(PAF)、趋化寡肽(FMLP);Ⅳ组在Ⅰ组基础上加PAF,37℃孵育5min后加FMLP;Ⅴa组、Ⅴb组和Ⅴc组在Ⅳ组基础上加入布比卡因10μl,浓度分别为1×10~(-6)、1×10~(-5)和1×10~(-4)mol/L;Ⅵ组在Ⅳ组基础上加入左旋布比卡因10μl(终浓度为1×10~(-4)mol/L)。FMLP和PAF终浓度均为1×10~(-6)mol/L。测定PMN黏附分子CD11b的表达。结果与Ⅰ组比较,Ⅱ组CD11b表达差异无统计学意义(P>0.05),Ⅲ组、Ⅳ组CD11b表达上调;Ⅳ组高于Ⅲ组(P<0.01)。与Ⅳ组和Ⅴa组比较,Ⅴb组、Ⅴc组和Ⅵ组CD11b表达下调;Ⅴc组低于Ⅴb组(P<0.05或0.01);Ⅴc组与Ⅵ组差异无统计学意义(P>0.05)。结论布比卡因可抑制PAF和FMLP诱导PMN黏附分子CD11b的表达,且呈浓度依赖性;左旋布比卡因和布比卡因对PMN黏附分子CD11b表达的抑制作用无差异。     

血管紧张素Ⅱ通过TLR4-MyD88途径诱导大鼠肾小管上皮细胞炎性因子释放

目的 观察血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）刺激肾小管上皮细胞（NRK-52E）后肿瘤坏死因子α（TNF-α）和热休克蛋白47（HSP47）的表达,分析Toll样受体4（TLR4）信号通路的变化与上述因子的关联,探讨AngⅡ促进NRK-52E细胞炎性反应、纤维化的天然免疫机制。 方法 细胞同步化后,将其分为4组：对照组、AngⅡ（10-7 mmol/L）组、坎地沙坦（10-5 mmol/L）+AngⅡ组、TLR4阻断剂（20 mg/L）+AngⅡ组,培养6 h后RT-PCR法检测TLR4及转接信号髓分化因子88（MyD88）mRNA表达水平;12 h后免疫荧光法检测细胞表面TLR4蛋白表达;24 h后以ELISA法检测细胞上清液TNF-α及HSP47的浓度。 结果 与对照组相比,AngⅡ显著上调NRK-52E细胞 TLR4、MyD88 mRNA和TLR4蛋白表达（均P < 0.01）,并诱导细胞TNF-α和HSP47的释放（均P < 0.01）。与AngⅡ组相比,TLR4阻断剂和坎地沙坦干预均显著抑制 AngⅡ对细胞TLR4、MyD88的刺激效应（均P < 0.01）;坎地沙坦抑制AngⅡ诱导的细胞 TNF-α、HSP47的释放（均P < 0.01）,TLR4阻断剂对细胞 TNF-α、HSP47的下调呈剂量依赖性。 结论 AngⅡ对NRK-52E细胞天然免疫信号TLR4、MyD88具有激活效应,该信号激活可能是AngⅡ促进肾小管细胞炎性相关因子释放的重要机制之一。坎地沙坦抑制肾小管细胞炎性因子的体外效应也与其调节该信号通路有关。     

法舒地尔对血管紧张素Ⅱ诱导足细胞骨架重构的干预作用

目的 观察ROCK抑制剂法舒地尔对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导小鼠足细胞骨架重构的影响,探讨法舒地尔在足细胞病变中的保护机制.方法 体外采用AngⅡ(]0-7 mol/L)致足细胞损伤模型.不同浓度法舒地尔(10-8、10-7、10-6mol/L)与足细胞预孵育30 min或60 min后,再加入含AngⅡ(10-7 mol/L)的培养基,继续作用24 h.异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔环肽荧光染色和Western印迹法分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和synaptopodin 的变化,并进一步观察细胞内调节骨架装配的Rho-ROCK信号通路的活性,即采用Western印迹法检测Rho激酶1(ROCK-1)及磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)表达,代表ROCK的表达及活性.结果 与对照组相比,AngⅡ可明显降低足细胞synaptopodin的表达(P＜0.05),使F-actin重构,而法舒地尔预处理可减轻AngⅡ介导的synaptopodin的下调(P＜0.05)和F-actin的重构.法舒地尔可下调AngⅡ诱导的足细胞ROCK-1 (P＜ 0.05)及MYPT1蛋白表达(P＜0.05).结论 法舒地尔可稳定足细胞的细胞骨架,拮抗AngⅡ对足细胞的损伤.法舒地尔的上述作用可能与细胞内Rho-ROCK信号通路有关.     

细胞因子对大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体表达的影响

目的 探讨细胞因子对大鼠血管平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)表达的影响.方法 原代体外培养的1月龄SD大鼠(体重120～130 g)胸主动脉血管平滑肌细胞,于无血清DMEM培养液中培养24 h后,在含10%胎牛血清的DMEM培养液中继续培养.采用随机数字表法,将细胞随机分为5组,对照组(C组)不给予任何处理,继续培养12 h;不同浓度细胞因子组分别加入10%细胞因子(L组)、50%细胞因子(N组)、100%细胞因子(H组)孵育12 h,细胞因子包括IL-1β50 ng/ml+TNF-α 100ng/ml+干扰素γ(IFN-γ)500 ng/ml;L-精氨酸甲酯(L-NAME)组加入100%细胞因子+一氧化氮合酶抑制剂L-NAME 5 mmol/L孵育12 h.每组均重复6次.采用RT-PCR法检测AT1R mRNA的表达;采用Western blot法检测AT1R蛋白的表达.结果 与C组比较,L组、N组和H组血管平滑肌细胞AT1R mRNA和蛋白表达均下调,且呈浓度依赖性(P＜0.05或0.01),L-NAME组差异无统计学意义(P＞0.05);与L-NAME组比较,H组血管平滑肌细胞AT1R mRNA和蛋白表达均下凋(P＜0.01).结论 细胞因子可下凋大鼠血管平滑肌细胞AT1R的表达,其机制与促进一氧化氮的合成有关.

Abstract：

Objective To investigate the effects of cytokines on the expression of angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats. Methods Primary cultured VSMCs from SD rat thoracic aorta were cultured in serum-free DMEM for 24 h, and then in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum for another 12 h. The cultured VSMCs were randomly divided into 5 groups (n =6 each): control group (group C); 10% cytokine group (group L); 50% cytokine group (group N); 100% cytokine group (group H) and L-arginine methy ester (L-NAME), an inhibitor of nitric oxide synthase) group. In group C, the cellswere cultured continuously for 12 h. In L, N and H groups, 10%, 50% and 100% cytokines (IL-1β 50 ng/ml +TNF-α 100 ng/ml + IFN-γ 500 ng/ml) were added to the culture medium respectively and the cells were then incubated for 12 h. In group L-NAME, 100% cytokines + L-NAME 5 mmol/L were added to the culture medium and the cells were then incubated for 12 h. The expression of AT1R mPNA and protin was determined by RT-PCR and Western blot respectively.Results Cytokines down-regulated AT1R mRNA and protein expression in a concentration-dependent manner (P ＜ 0.05 or 0.01). L-NAME reversed cytokines-induced changes in AT1R mRNA and protein expression ( P ＜ 0.01). Conclusion Cytokines can down-regulate the expression of AT1R in rat VSMCs and the mechanism is related to the NO synthesis.     

洛沙坦对糖尿病小鼠机械通气相关肺损伤的影响

目的 评价洛沙坦对糖尿病小鼠机械通气相关肺损伤的影响.方法 SPF级雌性C57/BL6小鼠48只,10 ～ 12周龄,体重20 ～ 25 g,采用随机数字表法,将小鼠随机分为3组(n=16)∶对照组(C组)、糖尿病机械通气组(DM组)和洛沙坦组(L组).DM组和L组采用腹腔注射链脲佐菌素150mg/kg的方法制备糖尿病模型.取糖尿病模型制备成功的小鼠进行机械通气4h,吸入氧浓度50％,通气频率70次/min,潮气量15 ml/kg,PEEP 2 cm H2O.L组于机械通气前30 min腹腔注射洛沙坦30mg/kg.机械通气4h时采集颈动脉血样,测定PaO2,随后处死,取肺组织,测定湿/干重比(W/D比)、髓过氧化物酶(MPO)活性和肺微血管通透性;采用实时荧光定量RT-PCR法测定血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体AT1 mRNA的表达水平;ELISA法测定AngⅡ的含量;Western blot法测定细胞核内NF-κB p65的表达水平.结果 与C组比较,DM组和L组PaO2降低,肺组织W/D比、MPO活性、肺微血管通透性和AngⅡ含量升高,AT1 mRNA和NF-κB p65表达上调(P＜0.05);与DM组比较,L组PaO2升高,肺组织W/D比、MPO活性、肺微血管通透性和Ang Ⅱ含量降低,AT1 mRNA和NF-κB p65表达下调(P＜0.05).结论 洛沙坦通过抑制AT1受体和Ang Ⅱ水平,从而改善肺微血管通透性和抑制NF-κB活化,减轻糖尿病小鼠机械通气相关肺损伤.     

异丙酚对内毒素诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Toll样受体4表达水平的影响

目的 探讨异丙酚对内毒素诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达水平的影响.方法 SPF级雄性Wistar大鼠,体重180～250 g,8～9周龄,原代培养大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞,经鉴定后随机分为5组,每组18孔,对照组(C组):不给予任何药物,继续培养3 h;LPS组:加入LPS,终浓度1μg/ml,孵育3 h;异丙酚组(P1～3组):同时加入LPS(终浓度1μg/nd)和终浓度分别为25、50、100 μmol/L的异丙酚,孵育3 h.孵育结束后测定肺泡Ⅱ型上皮细胞TLR4 mRNA、TLR4蛋白表达和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的释放量.结果 与C组比较,LPS组和P1组TLR4 mRNA及其蛋白表达上调(P<0.05),P2组和P3组差异无统计学意义(P>0.05);与LPS组比较,P2组和P3组TLB4 mRNA和其蛋白表达下调,TNF-α释放量降低(P<0.05或0.01),P,组上述指标差异无统计学意义(P>0.05);P2组与P3组上述指标差异无统计学意义(P>0.05).结论 异丙酚可抑制LPS诱导的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞TLR4 mRNA及其蛋白表达上调,且呈浓度依赖性,这可能是其抑制肺局部炎性反应的机制.     

血管紧张素Ⅱ诱导足细胞c-Abl的表达改变

目的 探讨血管紧张素Ⅱ( AngⅡ)诱导下大鼠肾脏及条件永生性小鼠足细胞c-Abl的表达变化.方法 采用AngⅡ泵(400ng·kg-1·min-1)植入SD大鼠皮下的方法建立AngⅡ输注模型,24只大鼠成模后被随机分为AngⅡ输注2周组、AngⅡ输注4周组、AngⅡ输注+替米沙坦(ARB,3 mg·kg-1·min-1)干预2周组及4周组,同时设生理盐水输注组和健康对照组,每组6只.分别于成模后2周末、4周末处死大鼠取肾.电镜下观察肾脏足细胞超微结构的改变;免疫荧光法检测肾脏c-Abl表达;实时PCR及Western印迹检测c-Abl mRNA及蛋白水平的改变.对于体外培养条件永生性小鼠足细胞,免疫荧光法检测足细胞肾脏c-Abl的表达,实时PCR及Western印迹法检测足细胞在AngⅡ不同作用浓度(10-9 mol/L～10-6 mol/L)及不同作用时间点(0h、3h、6h、12 h、24 h)c-Abl mRNA和蛋白水平的变化.结果 (1)免疫荧光检测结果显示肾脏足细胞有c-Abl表达;实时PCR及Western印迹结果显示AngⅡ输注2周组和4周组大鼠肾脏c-Abl表达增加(P＜0.05),ARB干预组大鼠肾脏c-Abl表达较同期AngⅡ输注组均有降低(P＜0.05).(2)体外培养的条件永生性小鼠足细胞胞质及胞核有c-Abl表达.AngⅡ可诱导培养的小鼠足细胞c-Abl mRNA及蛋白表达增加(P＜0.05),且呈时间和剂量依赖性.结论 c-Abl在肾足细胞及体外培养足细胞均有表达,AngⅡ可诱导c-Abl表达上调.c-Abl可能参与了AngⅡ诱导的足细胞损伤.     

缺氧诱导因子1α介导的信号通路在血管紧张素Ⅱ诱导肾间质纤维化中的作用

目的 探讨缺氧诱导因子1α（HIF-1α）介导的信号通路在血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导肾间质纤维化（RIF）中的作用。 方法 体外培养肾小管上皮细胞,以不同浓度（10-9~10-6 mol/L）的AngⅡ分别处理24 h、48 h时,用实时荧光定量PCR和Western印迹法分别检测肾小管上皮细胞中HIF-1α、脯氨酸羟化酶2（PHD2）及基质金属蛋白酶1组织抑制剂（TIMP-1）mRNA和蛋白的表达变化情况。 结果 随AngⅡ刺激浓度的增加,HIF-1α mRNA的表达水平也增加,呈浓度依赖性。当AngⅡ浓度在10-7 mol/L,并且干预时间为24 h时,HIF-1α mRNA的表达水平增加了166%。实时荧光定量PCR和Western印迹分析显示,相对于空白对照组,在AngⅡ干预的肾小管上皮细胞中HIF-1α、TIMP-1的mRNA和蛋白表达水平均升高 （P < 0.05）,而PHD2的mRNA和蛋白表达水平均下降（P < 0.05）。 结论 AngⅡ可能通过下调PHD2的表达而减少肾小管上皮细胞中HIF-1α的降解,从而上调HIF-1α及TIMP-1的表达,参与RIF。