野生型Parkin基因对肝癌细胞生长的影响

目的 探讨野生型及突变型Parkin基因表达对人肝癌细胞株Huh-7在体内外生长情况的影响.方法 利用脂质体介导的基因转染法将野生型及突变型Parkin基因真核表达载体转染肝癌细胞株Huh-7,筛选稳定表达细胞株,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行鉴定并送测序分析.细胞增殖实验和裸鼠致瘤性实验检测各稳定表达株的体内外生长情况.结果 成功建立了稳定表达野生型和突变型Parkin基因的Huh-7细胞株.以转染空载体的Huh-7细胞作为对照,野生型Parkin基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长(t=3.875,P=0.031),可显著减缓裸鼠皮下瘤的生长速度并减小其体积(t=8.228,P=0.003).突变型Parkin基因的表达对肝癌细胞的生长影响不大(P＞0.05).结论 野生型Parkin的重表达有助于肝癌细胞恶性表型的逆转.野生型Parkin基因是一个肝癌相关的抑癌基因.     

RASSF1A基因表达对人肝癌细胞株QGY-7703生长的影响

目的观察RASSFlA基因的表达对人肝癌细胞株QGY-7703在体内外生长的影响。方法利用已构建成功的稳定表达RASSFlA基因的肝癌细胞株QGY-7703，通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、细胞周期的测定和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果以未转染的QGY-7703为对照，RASSFlA基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长速度，使肝癌细胞周期阻滞在G1／S期，显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目（P〈0．01）和大小，显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量（P〈0．01）。空载体的表达对肝癌细胞的生长影响不明显。结论RASSFlA的重表达抑制肝癌细胞在体内外的生长；RASSFlA基因是一个新的肝癌相关的抑癌基因。     

基因启动区异常甲基化导致肝癌中RASSF1A基因外失活的研究

目的观察肝癌组织中的抑癌基因RASSF1A的表达情况和由于启动区异常甲基化导致其基因外失活的状况，并分析DNA异常甲基化与肝癌临床相关因素之间的关系。方法利用RT—PCR和MS-PCR的方法，结合DNA测序和Taq I酶切消化法，分析了24例肝癌标本、4株肝癌细胞株（SMMC7721、HepG2、BEL7402和BEL7703）中RASSF1A基因的表达情况，以及其基因启动区异常甲基化的情况。采用甲基化抑制剂5＇-Aza—CdR处理肝癌细胞株，观察RASSF1A重新表达的情况。结果66．7％的肝癌组织未表达RASSF1A；4株肝癌细胞株中仅SMMC7721检测到RASSF1A的表达。83．3％的肝癌组织及4株肝癌细胞株都发生了异常甲基化，而正常肝组织和正常肝细胞株（L02）中却未发现甲基化。甲基化与肝硬化、乙肝表面抗原、肿瘤分化程度及血管浸润和远处转移有相关性。原来RASSF1A表达失活的3株肝癌细胞株经甲基化抑制剂5＇-Aza—CdR处理后，又重新恢复了表达。结论基因转录启动区的异常甲基化是导致肝癌中RASSF1A表达失活的主要原因。检测RASSF1A启动区异常甲基化可作为一种有潜在应用价值的生物分子指标来用于肝癌的早期发现和早期诊断，以及预后的判断。     

肝癌抑癌基因GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A异常甲基化检测及其临床意义

目的 研究肝细胞癌中的GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A 4种基因启动子区域甲基化状态的表达差异,并探讨其在肝癌发生中的作用.方法运用甲基化特异性聚合酶链反应（methylation-specific PCR,MSP）技术,分别检测35例肝癌组织及其相应的癌旁组织和20例正常对照肝组织中4种候选抑癌基因（GSTP1、p16、RIZ1、RASSF1A）启动子区域的甲基化表达情况,并结合临床病理资料进行分析.结果在肝细胞癌、癌旁及正常对照肝组织中检测到GSTP1基因启动子区的甲基化率分别是57.1 （20/35）,25.7％（9/35）,0％ （0/20）;p16基因启动子区甲基化率分别是54.3％ （19/35）,37.1％ （13/35）,0％ （0/20）; RIZ1基因启动子区甲基化率分别是68.6％ （24/35）,14.3％ （5/35）,0％ （0/20）;RASSF1A基因启动子区甲基化率分别是88.6％ （31/35）,74.3％（26/35）,10％ （2/20）,其中癌组织中GSTP1和RIZ1基因甲基化率均显著高于相应的癌旁组（P＜0.01）和正常对照肝组织（P＜0.01）,癌组织中p16、RASSF1A启动子区甲基化率高于癌旁组织,但二者无统计学意义（P＞0.05）,但明显高于正常对照肝组织（P＜ 0.01）.在肝癌组织中肿瘤有包膜侵犯者GSTP1基因甲基化阳性率明显高于无包膜侵犯者（P＜0.05）;乙肝表面抗原（HbsAg）阳性的肝癌患者p16基因甲基化阳性的比率要显著高于HbsAg阴性者（P＜0.05）;而RIZ1、RASSF1A与临床病理资料间均没有统计学意义（P＞ 0.05）.结论RIZ1、GSTP1基因甲基化状态具有肝癌特异性,或可作为临床肝癌辅助诊断的分子标记物.慢性HBV感染可能是导致p16甲基化而失活的原因,GSTP1基因启动子甲基化可能与肝细胞癌的侵袭性有关.     

腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响

目的 研究腺病毒介导的多种基因在肝癌细胞中的表达和对肝癌细胞生长的影响。方法 构建含人ｐ５３、Ｂ７－１、ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体,感染３种肝细胞癌细胞系和肝细胞系Ｌ０２,运用ＥＬＩＳＡ、免疫组化、流式细胞仪等方法,检测目的基因在肝癌细胞中的表达,和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果 肝癌细胞对腺病毒高度易感,腺病毒多重感剂量为５０（５０ＭＯＩ时）,可使９０％左     

腺病毒介导反义c-myc基因抑制人肝癌细胞生长的研究

目的观察重组腺病毒介导反义c-myc基因(Ad-ASmyc)对体外培养人肝癌细胞的生长抑制作用和裸鼠体内移植肝肿瘤的治疗效果.方法Ad-ASmyc感染人肝癌细胞系后,观察细胞生长形态变化,通过细胞生长曲线、流式细胞仪分析、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫印迹法(Western blot)分析Ad-ASmyc对人肝癌细胞系SMMC-7721和HCC-9204细胞生长、c-myc和bcl-2基因表达的影响;裸鼠皮下移植瘤内注射3种不同剂量Ad-ASmyc(1×109pfu-A组,1×108pfu-B组,1×107pfu-C组)抑制裸鼠肿瘤生长的差异.结果Ad-ASmyc可高效转导人肝癌细胞系SMMC-7721和HCC-9204,抑制细胞生长(抑制率分别为48.72%和56.88%),诱导肝癌细胞G1期阻滞和凋亡,c-myc、bcl-2 RNA及c-myc蛋白水平下降;瘤内注射3种不同剂量Ad-ASmyc均可明显抑制裸鼠皮下移植肿瘤生长,抑制率分别为47.1%、77.3%和82.6%(与对照组比较,P＜0.01).结论重组腺病毒介导的反义c-myc基因能够引起人肝癌细胞c-myc、bcl-2 RNA及c-myc蛋白表达下调和细胞生长抑制,瘤内注射Ad-ASmyc治疗裸鼠皮下移植肝癌有效.     

脂质体介导c-myc基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生物学影响

目的 探讨应用脂质体（ＬＲ）介导ｃ－ｍｙｃ基因反义寡核苷酸（ＡＳＯＤＮ）对人肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７２１（７７２１细胞）的生物学影响。方法 利用１ｍｇ／Ｌ ＬＲ包裹２μｍｏｌ／Ｌ ｃ－ｍｙｃ ＡＳＯＤＮ转染于培养的人肝癌细胞,观察其对瘤细胞的作用。结果 四唑盐比色实验（ＭＴＴ）法测定ＬＲ－ＡＳＯＤＮ组作用４８ｈ对瘤细胞生长抑制率（５５％）较无ＬＲ的ＡＳＯＤＮ组的生长抑制率（１５％）显著提高（Ｐ〈０．     

3p21.3区域相关抑癌基因——RASSF1A、BLU和SEMA3B在肝癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨3p21.3区域相关基因--RASSF1A、BLU和SEMA3B基因转录表达与肝细胞癌发生及预后的关系.方法 用RT-PCR的方法 检测RASSF1A、BLU和SEMA3B基因在79例肝癌组织以及相应的癌旁组织中的表达.结果 (1)肝细胞癌组织中三种基因的表达缺失率均明显高于癌旁组织(P＜0.05);(2)合并有肝硬化或者乙肝表面抗原阳性的病人,其肝癌组织中三种基因的表达失活率显著高于无肝硬化或乙肝表面抗原阴性病人(P＜0.05);(3)低分化型癌组织中三种基因缺失率均高于中、高分化型,但SEMA3B的差异无显著性(P＞0.05);(4)年龄、性别、肝功能分级和血清AFP值对三种基因表达的影响无显著性差异(P＞0.05).结论 肝癌组织中3p21.3区域相关抑癌基因转录表达缺失,可能参与调控肝癌的发生、发展过程,并影响其预后.     

抑癌基因TSLC1在肝癌组织中的表达及临床意义

目的通过检测抑癌基因肺癌肿瘤抑制物1(TSLC1)在肝癌组织中的表达来探讨TSLC1与肝癌发生和进展的关系。方法共取40例新鲜肝癌标本,所有标本均含有肝癌组织及癌旁组织,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)检测TSLC1的表达情况,对肝癌患者进行临床病理学分期,检测肝癌患者HBV感染情况及血清中AFP水平。结果40例标本的癌旁组织中TSLC1的表达率为75%,癌组织中TSLC1的表达率为30%,TSLC1基因表达缺失率与肝癌的临床分期、HBV感染及血清中AFP水平呈正相关,与肿瘤直径无关。结论PSLC1的失表达可能在肝癌发生中发挥作用,TSLC1的失表达还可能与肝癌的恶性进展有关。     

马钱子对人肝癌细胞生长的影响及其作用机制

目的 探讨马钱子对人肝癌细胞生长影响及作用机制.方法 体外培养人肝癌细胞SMMC-7721,分别加入5％、10％、20％的马钱子药物血清,噻唑蓝(MTT)比色法测定对人肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制作用.20％马钱子药物血清作用肝癌细胞SMMC-77210、24、48 h后,分别收集细胞,提取蛋白和总RNA,应用Westem blot和荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测Fas、Cyclin D1、PCNA蛋白和mRNA表达.结果 20％马钱子药物血清对人肝癌细胞72 h的生长抑制率为(54.94±8.19)％,与5％、10％浓度抑制率(19.928±7.653)％、(29.020 ±6.100)％比较差异有统计学意义(F=18.23,P＜0.01).药物血清作用24、48 h后,肝癌细胞SMMC-7721 Fas蛋白表达分别为(0.302±0.009)、(0.399±0.021),与对照组(0.226±0.022)比较,差异有统计学意义(F=68.25,P＜0.05);药物血清作用48 h后,肝癌细胞SMMC-7721 PCNA蛋白表达为(0.7457±0.0386),与对照组、24 h(0.8529±0.0099、0.9016±0.0139)比较,差异有统计学意义(P＜0.05);药物血清作用24、48 h后,肝癌细胞SMMC-7721 Cyclin D1 mRNA表达分别为0.045 680 ±0.038 130、0.026 714±0.019934,与对照组(0.145246±0.048543)比较,差异有统计学意义(F=8.671,P＜0.05);药物血清作用24、48 h后,肝癌细胞SMMC-7721 Cyclin D1蛋白表达,PCNA、Fas mRNA表达变化差异无统计学意义(F =68.25,P＞0.05).结论 马钱子具有抑制人肝癌细胞增殖作用,其抑制效应与药物血清浓度成正相关;通过上调肝癌细胞Fas蛋白和下调PCNA蛋白及Cyclin D1 mRNA表达,是马钱子抑制肝癌细胞增殖的机制之一.     

肝细胞癌中SEMA3B基因的表达及其意义

目的 通过对SEMA3B基因在原发性肝细胞癌（HCC）组织中表达的检测，探讨该基因与HCC发生机制的关系。方法 采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测35例HCC组织及癌旁肝组织SEMA3BmRNA表达水平。结果 （1）在所有受检的癌旁肝组织中，SEMA3BmRNA表达率为85．7％（30／35），明显高于癌组织的表达率20．0％（7／35），差异有统计学意义（P〈0．01）；（2）合并有肝硬化（20／28）或者乙肝（19／28）的患者，其癌组织中SEMA3B基因的表达缺失率显著高于无肝硬化（8／28）或乙肝阴性（9／28）患者（P〈0．05）；（3）SEMA3B基因的异常表达情况与年龄、性别的差异无统计学意义（P〉0．05），与HCC患者术前肝功能Child—Pugh分级评价和血清AFP的检测值高低无相关（P〉0．05）；（4）SEMA3B的表达缺失率与TNM分期关系无统计学差异，低分化型癌组织中SEMA3B基因缺失率高于中、高分化型，但差异无统计学意义（P〉0．05）。此外，该基因的缺失与肿瘤大小无关（P〉0．05）。结论 SEMA3B基因在HCC组织中的高频表达缺失说明该基因的失活与HCC的发生密切相关。SEMA3B基因是定位于染色体3p21．3区域的与HCC相关的抑癌基因，并且可能在HCC的发生发展方面起重要作用。     

RASSF1A基因在肝癌组织中的表达及其临床意义

目的观察人肝癌组织RASSF1A的表达情况。方法应用半定量反转录聚合酶联反应技术检测62例人中晚期肝癌及其癌旁正常组织中RASSF1A的表达情况。结果69．4％（43/62）的肝癌组织中RASSF1A表达缺失，而癌旁组织中仅30．6％（19／62）该基因表达缺失，两者差异有统计学意义（P〈0．05）。结论中晚期肝癌中RASSF1A表达处于失活状态，其可作为一种有潜在应用价值的生物分子指标来用于肝癌的早期发现、早期诊断以及预后的判断。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体对肝细胞肝癌的抑制作用

目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体(TRAIL)对肝细胞肝癌的抑制作用。方法 构建绿色荧光蛋白融合TRAIL质粒,转染肝癌细胞株HepG2、SMMC7721细胞后,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测 TRAIL的表达,采用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡,噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率;体内实验建立裸鼠肝癌皮下模型,pIRES-EGFP-TRAIL直接瘤体注射,并观察TRAIL的抑癌作用。结果 真核表达质粒TRAIL体外转染肝癌细胞后,RT-PCR和 Western blot证实了肝癌细胞中有 TRAIL的表达,但对肝癌细胞的生长无显著性的抑制作用。体内直接瘤体注射 pIRES-EGFP-TRAIL 2周,RT-PCR证实瘤体有 TRAIL mRNA强表达,癌旁组织 TRAIL mRNA呈弱表达,正常肝无 TRAIL mRNA表达,但两组间肿瘤大小差异无显著性(P>0.05)。结论 肝细胞肝癌对TRAIL诱导的凋亡有耐药现象,提示HCC中存在抑制TRAIL诱导凋亡的因素,单一的TRAIL治疗HCC疗效有限。     

稳定表达Angiopoietin-1基因肝癌细胞株的建立及其意义

目的 通过将Angipoietin-1基因转染培养人肝癌细胞SMMC－7721,建立长期表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞模型。方法 基因重组构建Angipoietin-1真核表达质粒pcDNA3/Angipoietin-1,经脂质体将pcDNA3/Angipoietin-1质粒转染培养人肝癌细胞株SMMC－7721,G418筛选阳性细胞克隆,逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）检测转染后25-30d细胞Angipoietin-1基因mRNA表达水平。结果 （1）限制酶切和凝胶电泳证明成功构建表达质粒pcDNA3／Angipoietin-1;（2）通过脂质体Dosper将质粒pcDNA3／Angipoietin-1转染SMMC－7721,经G418筛选后获得阳性细胞克隆;（3）RT－PCR证明经脂质体转染的人肝 癌细胞株SMMC－7721可较稳定表达Angipoietin-1基因。结论 成功建立稳定表达Angipoietin-1基因的肝癌细胞株SMMC－7721／Angipoietin-1,为通过在体途径探讨Angipoietin-1对肿瘤血管生成的调节作用奠定了基础。     

原发性肝癌RASSF1A基因启动子区甲基化及其临床意义

目的 探讨原发性肝癌中RASSF1A基因启动子的甲基化水平及其与临床病理特征的关系.方法 采用MSP测定100例原发性肝癌患者的肿瘤标本及其癌旁组织、6株肝癌细胞株及10例正常肝组织RASSF1A基因甲基化状态,分析甲基化与肝癌临床病理特征的关系.采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理肝癌细胞株,用RT-PCR检测RASSF1A的重新表达情况.结果 100例肝癌组织中有69例(69％)存在RASSF1A基因CpG岛的异常甲基化,癌旁组织中有15例(15％),6株肝癌细胞株有4株(4/6)发生甲基化,而正常肝组织中无RASSF1A基因甲基化存在,RASSF1A基因异常甲基化在3种组织中的发生率差异有统计学意义(x2=67.75,P＜0.001).RASSF1A基因启动子甲基化与患者乙肝表面抗原及组织分化存在一定相关性.发生甲基化的4株肝癌细胞株经甲基化抑制剂5-Aza-CdR处理后,全部重新恢复表达.结论 原发性肝癌存在RASSF1A基因CpG岛异常甲基化,并与患者乙肝表面抗原及组织分化密切相关.经甲基化抑制剂处理的肝癌细胞株又重新恢复表达,推测CpG岛的甲基化可能是导致其基因表达降低的主要原因之一.