野生型Parkin基因对肝癌细胞生长的影响

目的 探讨野生型及突变型Parkin基因表达对人肝癌细胞株Huh-7在体内外生长情况的影响.方法 利用脂质体介导的基因转染法将野生型及突变型Parkin基因真核表达载体转染肝癌细胞株Huh-7,筛选稳定表达细胞株,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)进行鉴定并送测序分析.细胞增殖实验和裸鼠致瘤性实验检测各稳定表达株的体内外生长情况.结果 成功建立了稳定表达野生型和突变型Parkin基因的Huh-7细胞株.以转染空载体的Huh-7细胞作为对照,野生型Parkin基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长(t=3.875,P=0.031),可显著减缓裸鼠皮下瘤的生长速度并减小其体积(t=8.228,P=0.003).突变型Parkin基因的表达对肝癌细胞的生长影响不大(P＞0.05).结论 野生型Parkin的重表达有助于肝癌细胞恶性表型的逆转.野生型Parkin基因是一个肝癌相关的抑癌基因.     

RASSF1A基因表达对人肝癌细胞株QGY-7703生长的影响

目的观察RASSFlA基因的表达对人肝癌细胞株QGY-7703在体内外生长的影响。方法利用已构建成功的稳定表达RASSFlA基因的肝癌细胞株QGY-7703，通过细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、细胞周期的测定和裸鼠致瘤性试验对各稳定表达株的生物学行为进行检测。结果以未转染的QGY-7703为对照，RASSFlA基因的表达可明显抑制肝癌细胞在体外的生长速度，使肝癌细胞周期阻滞在G1／S期，显著降低肝癌细胞在软琼脂中形成的克隆数目（P〈0．01）和大小，显著减慢裸鼠皮下瘤的生长速度和重量（P〈0．01）。空载体的表达对肝癌细胞的生长影响不明显。结论RASSFlA的重表达抑制肝癌细胞在体内外的生长；RASSFlA基因是一个新的肝癌相关的抑癌基因。     

RASSF1A对人胃癌细胞株SGC7901增殖的影响

目的:观察外源性RASSF1A基因对人胃癌细胞SGC7901增殖的影响。方法:利用脂质体转染技术将真核表达重组体pcDNA3.0-RASSF1A质粒和空载体pcDNA3.0质粒分别导入SGC7901细胞，经G418筛选后获得稳定转染细胞克隆。采用RT-PCR和蛋白印迹检测RASSF1A基因表达。绘制细胞生长曲线，并用裸鼠成瘤实验、平板克隆形成实验、流式细胞术分析转染细胞的生物学行为。结果〖HT8.5SS〗经脂质体转染和筛选，建立了高表达RASSF1A基因的SGC7901细胞系。与未转染组和转染空白载体组比较，转染RASSF1A基因的SGC7901细胞生长速度明显减慢; 细胞周期中G1/G0期比例明显增加，而S期比例减少; 克隆形成率明显减少; 裸鼠成瘤抑制率为57.1%。结论:RASSF1A基因能抑制人胃癌细胞SGC7901的增殖。     

能稳定表达外源抑癌基因PTEN的胆管癌细胞系QBC939的建立

目的：为研究抑癌基因PTEN对胆管癌细胞生物学行为的影响，建立能稳定表达外源PTEN的胆管癌细胞系。方法：将野生型、突变型PTEN质粒和空载体质粒分别转化细菌，提取纯化后，脂质体介导法转染体外培养的胆管癌细胞系QBC939;嘌呤霉素筛选抗性克隆;Western blot 检测标签蛋白HA的表达;RT-PCR， Western blot和免疫细胞化学法分析目的基因PTEN的表达。结果：野生型、突变型PTEN和空载体转染细胞株均获得嘌呤霉素抗性;野生型和突变型PTEN转染细胞株均检测到ＨＡ的表达，而空载体转染细胞株和未转染细胞株均未检测到ＨＡ的表达;野生型及突变型PTEN转染细胞株中目的基因PTEN在mRNA和蛋白质表达水平上均较空载体转染细胞株和未转染细胞株增强。结论：成功构建了分别能稳定表达外源野生型PTEN，突变型PTEN或空载体pBP的胆管癌细胞系。     

突变型端粒酶逆转录酶基因转染对膀胱癌细胞T24增殖的影响

目的　探讨转染缺失突变的人端粒酶逆转录酶 (hTERT)基因对膀胱癌细胞株T2 4端粒酶活性和体外增殖的影响 ,为膀胱肿瘤基因治疗提供新的基因靶点。　方法　采用DNA 磷酸钙共沉淀法 ,将绿色荧光蛋白基因标记的含突变型hTERT真核表达载体 pEGFP hTERT导入人膀胱癌细胞株T2 4中。应用荧光显微镜、端粒酶PCR ELISA法、与衰老相关的 β 半乳糖苷酶染色、软琼脂集落形成试验、裸鼠皮下成瘤试验等方法动态观察转染细胞中端粒酶活性及对细胞恶性表型的影响。　结果　在转染 pEGFP hTERT细胞中可见与突变型hTERT基因融合的绿色荧光蛋白稳定表达于细胞核内 ,转染细胞端粒酶活性降低 ,衰老相关 β 半乳糖苷酶表达增加 ,软琼脂中集落形成减少 ,裸鼠成瘤性降低。与转染空载体组及未转染组细胞相比 ,差别有显著性意义 (P <0 .0 5 )。　结论　转染突变型人端粒酶逆转录酶基因hTERT能抑制膀胱癌细胞T2 4的端粒酶活性 ,促进其衰老并逆转膀胱癌细胞的恶性表型 ,对膀胱肿瘤基因治疗具有潜在的临床应用价值     

Dpc4基因转染胰腺癌细胞株对裸鼠胰腺癌移植瘤生长的影响

目的 探讨Dpc4基因转染胰腺癌细胞株HS766T对裸鼠移植瘤生长的影响.方法 按pcDNA3,1-Dpc4是否转染人胰腺癌细胞株HS766T将细胞分为pcDNA3.1-Dpc4转染组、pcDNA3.1空载体组和未转染组,RT-PCR鉴定目的基因的表达;将3组细胞分别接种于裸鼠,比较Dpc4基因对裸鼠胰腺癌移植瘤的生长抑制作用,Western blot检测移植瘤中Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达.数据以(x)±s表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验.结果 经RT-PCR鉴定,Dpc4基因在pcDNA3.1 -Dpc4中稳定表达.与pcDNA3.1空载体组和未转染组比较,pcDNA3.1-Dpc4转染组胰腺癌细胞HS766T肿瘤体积更小(F=19.43,P＜0.05);pcDNA3,1-Dpc4转染组与pcDNA3.1空载体组的抑瘤率分别为32.3％和4.0％.与pcDNA3.1空载体组比较,pcDNA3.1 -Dpc4转染组Caspase-3和Bax蛋白表达显著升高,而Bcl-2蛋白表达显著降低(F=14.24,13.83,19.50,P＜0.05).结论 Dpc4基因转染可抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生长.影响肿瘤细胞的凋亡可能是Dpc4基因抗肿瘤作用之一.     

反义转化生长因子-β1基因逆转骨肉瘤细胞恶性表型的研究

目的　观察反义转化生长因子 (TGF) β1基因对骨肉瘤细胞恶性表型的逆转作用。方法　将反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞MG 63后 ,以G418(4 0 0mg/L)筛选 14d ,获得转染细胞系。分别检测细胞周期、细胞凋亡和明胶酶A(MMP 2 )表达 ,并观察转染细胞软琼脂克隆形成数和裸鼠体内致瘤能力。结果　与MG 63和空载体转染细胞MG pcDNA3相比 ,反义基因转染细胞MG TGF β1(-)的G0 /G1期细胞从 5 6.2 %和 60 .1%增至 71.6% ,S期细胞从 19.1%和 17.8%降至 12 .9% ,MMP 2mRNA表达明显减少。MG TGF β1( )的软琼脂克隆形成数从 48.6± 8.1和45 .2± 4.7减至 2 8.2± 5 .6,裸鼠体内形成肿瘤的体积 (83 .4± 2 7.4)mm3 也明显小于MG 63组(191.3± 2 1.5 )mm3 和MG pcDNA3组 (2 0 4.2± 3 0 .7)mm3 。结论　反义TGF β1基因转染骨肉瘤细胞可以逆转肿瘤细胞的恶性表型 ,抑制肿瘤的侵袭和转移。     

逆转录病毒介导人血管内皮抑制素基因对人肝癌细胞体内生长的抑制作用

目的：探讨宿主细胞表达的人血管内皮抑制素（endostatin)对人肝癌细胞在体内生长的影响。方法：利用逆转录病毒载体pLncx,将endostatin基因导入人肝癌细胞SMMC7721内建立转基因肝癌细胞株。应用PCR、免疫组化及Western blot检测人endostatin的转染、表达和分泌。血管内皮细胞增殖试验检测表达的endostatin生物学活性。同时对转染细胞株在体外及在裸鼠体内的生长情况进行观察。结果：PCR证实,转endostatin基因的肝癌细胞 基因组中存在有550bp人特异性endostatin片段,免疫组化及Western blot印迹分析示人endostatin在转染肝癌细胞株中获得稳定表达和分泌。转染细胞表达的endostatin能显著抑制人血管内皮生长,抑制率达48％（P＜0．01）。与对照组相比,转染人endostatin基因的肝癌细胞在体外的生长速度无明显改变,但在接种裸鼠皮下后,肿瘤生长明显受到抑制,在22d时,肿瘤缩小率达94．5％（P＜0．01）。结论：逆转录病毒介导的人endostatin基因疗法对人肝癌SMMC7721在裸鼠体内的生长有显著抑制作用。     

RASSF1A 基因对胃癌SGC7901细胞NF-κB活性的影响

目的 探讨RASSF1A基因对人胃癌SCC7901细胞NF-KB活性的影响.方法 电泳迁移实验分析RASSF1A基因转染前后SGC7901细胞NF-kB活性的变化.蛋白印迹和免疫细胞化学检测RASSF1A基因转染前后SGC7901细胞P65蛋白的表达.结果 与未转染组和转染空白载体组比较,转染RASSF1A基因组SCC7901细胞的NF-kB活性明显降低,P65蛋白的表达明显减少.结论 RASSF1A基因可能通过抑制P65的表达、降低NF-kB活性抑制从而抑制胃癌SGC7901细胞生长.     

运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。     

短发卡RNA稳定沉默FOXM1对肝癌细胞体外生长的影响

目的 探讨短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体稳定沉默叉头框M1(forkhead box M1,FOXM1)基因对人肝癌细胞体外生长的影响.方法 构建针对人类FOXM1mRNA的不同干扰靶点的4个shRNA表达载体,选择干扰效果最佳的表达载体和阴性对照质粒转染人肝癌细胞QGY-7703,用新霉素(G418)筛选稳定转染的克隆.用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和平板克隆形成实验检测FOXM1基因沉默前后肝癌细胞体外生长能力的变化.用Annexin V-APC/PI双染法检测细胞凋亡.结果 不同人肝癌细胞株中普遍表达FOXM1蛋白.4个shRNA表达载体中,shRNA-1026表达载体的干扰效果最佳,对FOXM1 mRNA和蛋白表达水平的抑制率分别为38.5%和53.2%.用shRNA-1026稳定沉默FOXM1基因后,QGY-7703细胞增殖受到抑制,培养48、72和96 h后,沉默组的吸光值均显著低于对照组(分别t=10.830,3.578,5.734,均P＜0.05);沉默组的克隆形成能力较对照组显著降低(t=5.336,P＜0.05),而细胞凋亡较对照组显著增加(t=6.827.P＜0.05).结论 shRNA表达载体稳定沉默FOXM1基因抑制肝癌细胞的生长.

Abstract：

Objective To evaluate the effect of sustained silencing Forkhead box Ml (F0XM1) gene by short-hairpin RNA (shRNA) expression vector on cell growth of hepatocelluar carcinoma (HCC) in vitro.Methods Four shRNA expression vectors targeting different sequences of human F0XM1 mRNA were constructed.The expression vector with the best interfering effect and the negative control plasmid were used to transfect HCC cell line QGY-7703, stably transfected cell clones were selected by neomycin (G418).Cell growth was evaluated by 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and colony formation was assessed by clonogenic assay.Cell apoptosis was detected by double staining with APC conjugated Annexin V and PI.Results F0XM1 protein was detected with different levels in all these studied human cell lines.The expression vector shRNA-1026 exhibited excellent interference effect after transient transfection, which showed 38.5% and 53.2% reduction of FOXM1 mRNA and protein level respectively.The growth of QGY-7703 cells was inhibited after stable inhibition of FOXM1 expression by shRNA-1026, which was indicated by decreased absorbance value of the test group after culture for 48, 72 and 96 h compared to control group (t = 10.830,3.578 and 5.734 respectively, P ＜ 0.05).Stable inhibition of F0XM1 also led to reduced colony formation ( t = 5.336, P ＜ 0.05 ) and increased apoptosis of QGY-7703 cells in comparison to control cells (t = 6.827, P ＜ 0.05 ).Conclusions Stable silencing F0XM1 gene by shRNA suppresses the growth of HCC cells in vitro.     

转乙型肝炎病毒x基因肝癌细胞株的建立

目的 建立表达转乙型肝炎病毒Ｘ基因（ＨＢＸ）的人肝癌细胞株,为研究ＨＢＸ基因与肝癌生物学行为间的关系提供模型。方法 以聚合酶链反应（ＰＣＲ）法从３．２ｋｂ 型肝炎病毒（ＨＢＶ）全基因组中主增ＨＢＸ基因,亚克隆至逆转 功体,磷酸钙共沉淀法将其导入包装细胞系,以含病毒的培养上清感染人肝癌细胞系ＱＧＹ７７０１,新霉素（Ｇ４１８）筛选,ＰＣＲ与反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）鉴定。结果 ＰＣＲ法从ＨＢＶ基因     

Tiam1基因在胃癌细胞的表达及其生物学行为研究

目的构建Tiam1基因的真核表达载体,评估其转染人胃癌细胞株MKN45细胞后对胃癌细胞功能的影响。方法实时荧光定量PCR分析Tiam1基因在胃癌细胞中的表达;将外源性重组真核表达载体Tiam1基因(N1/Tiam1)转染到人胃癌细胞株MKN45内,经G418筛选并建立稳定表达Tiam1基因的胃癌MKN45细胞株,为:N1/Tiam1组,转染空质粒细胞(N1)组和未处理细胞(MKN45)组的两个对照组分别为:N1组和MKN45组;通过细胞增殖、划痕和侵袭实验分别观察上调Tiam1基因表达后的胃癌细胞功能。结果与N1组相比,N1/Tiam1组中Tiam1蛋白表达明显上调[(0.36±0.05)vs.(2.67±0.14),P<0.01];与对照组相比较,N1/Tiam1实验组较N1对照组细胞增殖数量明显增加(P=0.000);与转染N1空载体的MKN45细胞对照组相比,转染了N1/Tiam1高表达质粒的MKN45细胞促进胃癌细胞的迁移和侵袭。结论 Tiam1基因真核表达载体的筛选成功,为继续深入的研究Tiam1基因在胃癌中的功能奠定了基础。     

PTEN基因联合奥沙利铂对胆管癌细胞生长抑制的研究

目的探讨脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞（QBC939）,联合化疗药物奥沙利铂（L-OHP）,分别进行人胆管癌细胞体外培养和体内接种生长,观察分析该基因对胆管癌细胞生长的抑制情况,探索人类胆管癌的生物治疗的可行性和方法.方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体.转胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养.绘制细胞生长曲线及MTT细胞活性观察;利用免疫组化检测转染前后PTEN阳性表达率;透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化;流式细胞分析细胞的周期变化和细胞凋亡情况;体外细胞侵袭力抑制试验;裸鼠体内肿瘤生长,病理学及电镜扫描的观测.结果PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达,阳性表达率升高（P＜0.05）;肿瘤细胞活性下降（P＜0.05）,细胞周期G1～S期抑制,细胞凋亡率增加（P＜0.01）;透射电镜细胞较成熟、分化好;细胞侵袭力明显抑制（P＜0.05）;裸鼠体内肿瘤未转染组生长早,加入奥沙利铂后生长受抑制（P＜0.05）,病理证实为腺癌.结论1.脂质体成功将PTEN基因转染人胆管癌QBC939细胞,并稳定表达.2.PTEN基因转染后细胞生长速度无明显变化;MTT实验活性细胞数有所下降.3.转PTEN基因后的胆管癌细胞超微结构变化显示线粒体增多,细胞较成熟、分化好;流式细胞议分析,细胞周期G1期被抑制,细胞凋亡多,侵袭力受到抑制;4.接种转PTEN基因裸鼠的体内成瘤显著抑制;6.转基因的生物治疗联合奥沙利铂（L-OHP）对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用.     

PTEN基因对人胃癌细胞SGC-7901的生物学效应

目的　研究PTEN基因对人胃癌细胞SGC 790 1增殖、细胞周期及凋亡的影响。方法　将携带有PTEN基因的真核表达载体pBabe Puro PTEN以及pBabe Puro ,以脂质体介导的基因转染方法转入SGC 790 1细胞系中 ,嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞 ,通过细胞活力实验、流式细胞仪和DNA凝胶电泳 ,观察PTEN基因对SGC 790 1细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。结果稳定转染PTEN基因的SGC 790 1细胞中PTEN蛋白稳定表达 ,转染PTEN基因的SGC 790 1细胞生长速度较对照组明显减慢。流式细胞仪显示 ,细胞周期发生G1期阻滞。转染PTEN的细胞在透射电镜下可出现典型的凋亡形态学的改变 ;细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳显示凋亡细胞特有的“梯状”条带 ,而对照组没有出现。结论　外源性PTEN基因导入SGC 790 1细胞后 ,可引起SGC 790 1细胞G1期阻滞 ,抑制肿瘤细胞增殖 ,并促进凋亡的发生     

乙型肝炎病毒x基因上调肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ胚胎启动子活性的研究

目的　研究乙型肝炎病毒x基因（HBx）对肝癌细胞胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)启动子活性的影响,探讨HBx基因影响肝癌恶性表型的分子机制。方法　应用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测QGY7701肝癌细胞株和转HBx基因肝癌细胞株QGY/HBx的IGF-Ⅱ成年启动子P1与胚胎启动子P3、P4的活性。结果　与QGY7701细胞相比,QGY/HBx细胞IGF-Ⅱ基因P1启动子活性无明显改变(分别为3.12±1.18与3.74±1.87,P＞0.05),而P3与P4活性显著升高(2.27±0.68、3.97±1.66与1.20±0.39、1.45±0.43比较,P＜0.05)。结论　HBx基因可上调肝癌细胞IGF-Ⅱ基因胚胎启动子P3、P4活性,这可能HBx基因增强肝癌恶性表型的一个重要机制。