NLRP1基因启动子区荧光素酶报告载体的构建与鉴定

目的构建人NLRP1(nucleotide-binding,leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1)基因启动子区SNPrs878329位点两种单倍体荧光素酶报告基因载体。方法分别以SNP rs878329的GG和CC基因型的人基因组DNA为模板,用PCR法扩增出包含该位点的长476 bp的NLRP1基因启动子区目的片段,用KpnⅠ/BglⅡ双酶切,切胶回收后分别与同样双酶切的荧光素酶报告基因载体PGL3-promoter相连接,构建pGL3-promoter-G和pGL3-promoter-C两个表达质粒,并测序验证其DNA序列。结果成功构建了人类NLRP1基因启动子SNP rs878329的两种纯合子基因型(GG型和CC型)的荧光素酶报告载体,且测序得以证实。结论成功构建出的荧光素酶报告载体,为研究NLRP1基因启动子SNP rs878329能否调控NLRP1基因表达提供了基本实验条件。     

大鼠SCN5A基因内含子1+204 bp～+757 bp转录调控功能分析

目的克隆大鼠心肌SCN5A基因5′端调控区,检测目的片段在HEK293细胞中的转录活性。方法扩增大鼠心肌SCN5A基因 204 bp~ 757 bp、 204 bp~ 385 bp和 204 bp~ 329 bp片段,构建含目的片段的荧光素酶报告基因——pGL3-P0、pGL3-P1和pGL3-P2,比较HEK293细胞中荧光素酶活性,评价不同长度DNA片段的转录调控活性。结果成功构建大鼠心肌SCN5A基因5′端3个片断的荧光素酶报告基因,HEK293细胞中pGL3-P1相对荧光素酶活性分别为pGL3-P0、pGL3-P2的4.3倍和2.8倍。结论SCN5A基因内含子1目的片段在HEK293细胞中具有较强的转录调控活性;SCN5A基因 329 bp~ 385 bp为正调控区,软件分析MZF1、USF、C-ETs-1等因子能与这些正调控区域结合并可能参与SCN5A基因的表达调控。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

CKLF基因与CKLFSF1基因间的顺式调控元件

目的：探讨CKLF基因与CKLFSF1基因间序列(CCS)的调控作用。方法：运用PCR技术扩增CCS，并将此片段插入含有荧光素酶(luriferase)报告基因载体pGL3-basic，以及pGL3-SV40启动子中，构建受其调控的荧光素酶报告基因载体。应用脂质体介导基因转染技术，将4种重组质粒转染Hela细胞，进行瞬时表达分析。结果：在pGL3-basic和pGL3-basic-CCS质粒中的报告基因luciferase均无表达，但将CCS片段插入至promoter上游后，荧光素酶活性增加近1倍。结论：CKLF与CKLFSF1基因间的序列不具有启动子活性，但该序列中却可能存在调控其下游基因表达的顺式增强子元件。     

以Apo A-Ⅰ为靶点的基因表达上调剂筛选模型的建立

目的 建立靶向人Apo A-Ⅰ转录调控序列的高通量药物筛选模型,用于筛选Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增Apo A-Ⅰ上游的启动子序列,克隆至荧光素酶报告基因质粒pGL4.17上游,采用脂质体介导的方法将重组质粒转染人肝癌细胞HepG2,在G418抗性存在的条件下,通过有限稀释法筛选稳定转染细胞株.对溶剂浓度和药物作用时间进行条件优化,应用阳性化合物染料木素评价模型有效性,通过检测荧光素酶的表达活性变化来筛选人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂.结果 通过PCR成功扩增了人Apo A-Ⅰ基因上游的启动予序列,构建了相应的重组荧光素酶报告基因质粒pGL4-ApoP,并建立稳定转染细胞株ApoP-Luc HepG2.对筛选条件优化后,应用阳性化合物进行评价,筛选窗相关系数Z'因子为0.68,大于0.5,适于进行高通量筛选.应用该筛选模型对5000余种化合物进行筛选,4个黄酮类化合物和白藜芦醇显示出较好的活性,半数有效浓度均小于10μg/ml.结论 成功建立了人Apo A-Ⅰ基因表达上调剂筛选模型,并利用该模型筛选到5个活性化合物.     

HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础。方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3’端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a。对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒)。利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1～8号细胞)。通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1)。结果:HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒。8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致。HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配。成功构建了不同长度的3’端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因。pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1～8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490。结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础。     

TFF1基因启动子双荧光素酶报告基因载体的构建及活性鉴定

目的:构建含有野生型或突变型人三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并研究雌激素对上述启动子转录活性的影响。方法:设计人野生型和突变型TFF1基因启动子的引物,扩增回收片段,将其克隆到含有荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中构建重组质粒,经双酶切和测序鉴定后转染胆囊癌GBC-SD细胞,24h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的表达活性。结果:成功构建了野生型pGL3-TFF1质粒和雌激素应答元件(Estrogen response elements,ERE)位点突变的pGL3-TFF1-△ERE突变质粒,激活蛋白1(Activating protein-1,AP-1)位点突变的pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒。经双荧光素酶报告基因检测分析,pGL3-TFF1质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒均具有基础转录活性,与对照组比较(P0.001)。雌激素能进一步增强野生型TFF1启动子质粒和pGL3-TFF1-△ERE突变质粒的启动子转录活性(P0.01),而对pGL3-TFF1-△AP-1突变质粒以及pGL3-TFF1-△ERE+△AP-1双突变质粒的活性无影响(P0.05)。结论:本研究成功构建了野生型以及突变型TFF1启动子质粒,发现非经典雌激素受体结合部位——激活蛋白1(AP-1)位点对雌激素诱导的TFF1启动子转录活性增强发挥决定性作用。     

人大麻素受体启动子真核报告质粒的构建及活性分析

目的:利用双荧光素酶报告基因体系,根据大麻素受体1(cannabinoid receptor 1,cnr1)启动子序列不同部位的转录活性来初步确定其活性区域,为脊髓缺血耐受保护中cnr1高表达的转录调控的研究奠定基础。方法:从NCBI中获取cnr1基因转录起始点5’端向上约1800 bp的核苷酸序列,按照300 bp的距离间隔,设计6个不同长度的截短体PCR引物,以人全血基因组DNA为模板,分别扩增cnr1启动子区域的截短体片段,并克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒中。将含有不同截短体的重组质粒分别转染Hela、Jurket和A549细胞后行荧光素酶活性检测。根据不同截短体转录活性检测结果,确定cnr1启动子活性区域。结果:成功将cnr1启动子区6个不同长度(1800、1500、1200、900、600和300 bp)的截短体克隆入荧光素酶报告基因pGL3-Basic质粒。在3种细胞系Hela、Jurket和A549的荧光素酶活性检测均显示600 bp的截短体转录活性最强。结论:成功构建了cnr1启动子的报告基因重组质粒,初步证实-600 bp到-200 bp区为cnr1的启动子的活性区域,从而为进一步研究cnr1的转录调控奠定了基础。     

HIF1A基因两个位点多态性与夏尔巴人群高原低氧适应关系的研究

目的研究西藏高原夏尔巴人群缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1，alpha subunit；HIF1A）基因（HIF1A）第12外显子1772（C→T）、1790（G→A）多态性与高原低氧适应相关性。方法选取世居西藏高原夏尔巴族148人及广东汉族健康个体90人的血样，提取白细胞基因组DNA，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）检测HIF1A基因第12外显子1772（C→T）、1790（G→A）的单核苷酸多态性，分析其基因多态性特征。结果1772（C→T）CC、CT和TT基因型频率在夏尔巴人组与汉族对照组分别为14．19％和16．67％、39．19％和41．11％、46．62％和42．22％，两组间比较差异无统计学意义；1790（G→A）GG、GA和AA基因型频率在夏尔巴人组与汉族对照组分别为57．43％和75．56％、37．84％和21．11％、4．73％和3．33％，夏尔巴人组的GG基因型频率较汉族对照组的低（P〈0．01），而GA基因型频率高于汉族对照组（P〈0．01）。组合基因型分布，夏尔巴人CC＋GA、CT＋AA、TT＋GA和TT＋AA的组合基因型频率高于汉族组。结论HIFIA基因1790（G—A）多态性与夏尔巴人群高原低氧适应存在相关性，GA、AA基因型可能对低氧适应有利，值得进一步深入探讨。     

人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1基因P7启动子调控的报告基因载体的构建及鉴定

应用PCR方法从人单核细胞系THP-1基因组DNA扩增人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1(acyl coenzyme A: cholesterol acyltransferase1, ACAT1)基因 P7启动子全长片段,进行TA克隆,经双酶切、测序鉴定阳性克隆.将该基因亚克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Enhancer,用DEAE-葡聚糖(DEAE-dextran)法将重组质粒pGL3E-P7瞬时转染入单核细胞THP-1,检测其活性,证明pGL3E-P7能在体外表达荧光素酶.人ACAT1基因P7启动子调控的荧光素酶报告基因表达载体的成功构建,为研究动脉粥样硬化过程中ACAT1基因的转录调控机制提供新手段.     

P53对涎腺腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用

目的为了探讨P53基因对腺样囊性癌细胞端粒酶活性的抑制作用及机制。方法构建携带人野生型P53基因的腺病毒表达载体，以脂质体法瞬时转染腺样囊性癌SACC-83细胞，RT-PCR检测转染细胞P53基因mRNA的表达，TRAP-PCR-ELISA法检测转染细胞端粒酶活性的改变。并将P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2—630共转染SACC-83细胞，测定转染细胞荧光素酶报告基因活性。结果1．瞬时转染含人野生型P53基因的重组腺病毒表达载体p△E1-P53于腺样囊性癌SACC-83细胞后，其P53基因mRNA的表达明显增强；2．基因转染后，SACC-83细胞内源性端粒酶活性显著降低。3．P53基因与含有hTERT启动子核心调控区的荧光素酶报告基因pGL2-630共转染SACC-83细胞后，其荧光素酶活性显著下降。结论外源性表达P53基因可以降低腺样囊性癌细胞SACC-83细胞端粒酶活性，并可能通过抑制端粒酶hTERT基因启动子的转录活性实现。     

BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的：克隆大鼠肺表面活性蛋白A（SPA）基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性，为进一步研究SPA 基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA 基因序列，对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析，推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA 基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic 中,构建pGL3-SPA 质粒，将其亚克隆于pGL3-control 中，构建pGL3-SPA-enhancer 质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic 质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞, 用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。 结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer 质粒、pGL3-SPA质粒转染H441 细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA 基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性， 为下一步研究SPA 基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。     

大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体的构建

目的 构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测其在神经元中的表达.方法 采用PCR方法获得GluR2基因启动子区目的 片段(-298～﹢283),双酶切后插入到pGL3-Basic载体中构成重组表达载体,使萤火虫荧光素酶报告基因的表达受GluR2启动子控制.将构建的重组表达载体或pGL3-Basic载体分别与内参质粒pRL-CMV(表达海肾荧光素酶)共转染原代培养皮质神经元,24 h后用双荧光检测试剂盒测定萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶活性.结果 重组表达载体经双酶切及测序鉴定证明构建正确,该重组表达载体在神经元中特异性高表达萤火虫荧光素酶.结论 成功构建大鼠GluR2基因启动子控制的萤火虫荧光素酶表达载体,并检测到该载体在神经元中的特异性表达.     

干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的构建干扰素调节因子3（IRF-3）rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性。为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础。方法以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒（wIRF-3）。以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒（mIRF-3）。wIRF．3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位（RLU）。结果成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组（P〈0．005）。结论野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局。     

载脂蛋白A5 553G/T单核苷酸多态性对血浆脂质代谢的影响

目的探讨载脂蛋白A5基因（apoa5）553G／T变异在中国镇江地区的频率分布及其对血浆脂质代谢的影响。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）结合琼脂糖凝胶电泳技术检测152例健康人ApoA5 553G／T基因型及等位基因频率分布，同时采用生化方法测定所有研究对象的血浆脂质水平。结果ApoA5 553T等位基因频率为0．049。GG、GT、TT3种基因型中，GT杂合子个体和刀纯合子个体甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）水平明显高于GG纯合子个体。T等位基因携带者（GT＋TT）的TG水平较非T等位基因携带者（GG）增高了54．6％（2．47±2．01mmol／L：1．20±1．13mmol／L，P〈0．05），LDL-c水平增高28．3％（3．33±1．03mmol／L：2．78±0．82mmol／L，P〈0．05）。非T等位基因携带者年龄与TG、胆固醇（TC）水平呈正相关，T等位基因携带者年龄与血脂各项指标不相关。男性T等位基因携带者较非T等位基因携带者TG水平增高77．1％（P〈0．01），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平和载脂蛋白Al（ApoAl）水平分别降低6．7％（P〈0．05）和5．2％（P〈0．05），而女性T等位基因携带者较非T等位基因携带者TG水平增高23．1%（P〈0．05），HDL-c水平和ApoAl水平略降低，但无统计学意义（P〉0．05）。结论ApoA5 553G／T单核苷酸多态性对健康人群血浆TG有影响，553T等位基因与血浆TG和LDL-c水平增高有关，与HDL-c和ApoAl水平降低有关，这种作用在男性人群较女性人群更为明显。     

植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用

目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制,并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol,E2)进行比较分析。方法 进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养,利用基因重组技术构建4个含人TF基因5′上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒,用脂质体转染法分别转入以下6组细胞：①正常对照组;②10^-7mol／L,E2刺激组;③10^-7mol／L ZAL刺激组;④10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑤10～mol／L E2 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;⑥10^-7mol／L ZAL 10^-6mol／L AngⅡ刺激组;测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relative luciferase activity,BLA)的变化。结果 转染pGL3-TF-171/ 71的各组细胞BLA均较低,不同刺激组之间无显著差异;AngⅡ可使质粒pGL3-TF-593／ 71,pGL3-TF-316／ 71,pGL3-TF-236／ 71荧光素酶表达大量增加,E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应,2者间无显著差异。结论 含有1个NF-κB位点和2个AP-1位点的-236bp-171bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用。     

肿瘤坏死因子α和血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞组织因子基因表达及其机制的研究

目的；研究肿瘤坏死因子α（TNFα），血管紧张素Ⅱ（AngⅡ)对内皮细胞组织因子（TF）表达的影响，并探讨TF基因5‘上游序列在TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞该基因转录中的调控作用。方法：应用细胞原位杂交技术检测TF mRNA水平。采用基因重组技术构建含有人TF基因不同上游序列荧光毒酶报告基因质粒，经脂质体法转染内皮细胞，检测及分析报告基因活性。结果：TNFα和AngⅡ均可以诱导内皮细胞TF mRNA的表达增强。在TF基因上游序列－244／＋121bp存在时，TNFα，AngⅡ均可使转梁内皮细胞荧光素酶表达量明显增加，而在－111／＋121bp存在时TNFα，AngⅡ组与对照组荧光素酶表达量均无明显差异，而且较－244／＋121bp存在时荧光素酶表达量明显降低。结论：TF基因上游－244／－112bp序列的存在对TNFα，AngⅡ诱导内皮细胞TF基因表达起重要的调节作用。     

IPO8基因启动子区rs35100176位点变异对基因表达的影响

 目的：研究人importin 8（IPO8）基因启动子区rs35100176多态性位点CCT插入/缺失对基因表达的影响。方法：PCR扩增IPO8基因启动子区包含rs35100176多态位点的342 bp序列,通过测序获得了49例DNA样本的基因多态性分布。以CCT/CCT插入纯合子或-/-缺失纯合子DNA样本为模板,扩增含有不同插入/缺失序列的IPO8基因启动子片段,插入萤光素酶报告质粒pGL3-Basic,构建pGL3-3N Insertion 和pGL3-3N Deletion重组表达载体。重组质粒经Fugene 6.0转染入细胞,采用双萤光素酶报告系统,检测携带不同多态性序列的重组质粒中报告基因的表达活性;real-time PCR检测各不同基因型细胞中IPO8 mRNA表达。结果：通过测序发现rs35100176多态位点存在CCT/CCT、CCT/-和-/- 3种表型,其基因分布频率分别为1837%、5510%和2653%。成功构建pGL3-3N Insertion和pGL3-3N Deletion重组表达载体。双萤光素酶报告基因活性检测结果显示,pGL3-3N Insertion启动下游报告基因表达的相对活性与pGL3-3N Deletion相比显著减弱,两者存在显著差异（P<005）;real-time PCR结果显示,CCT纯合插入的HEK293细胞中IPO8 mRNA的表达显著低于CCT纯合缺失的Saos-2细胞。结论：IPO8基因启动子区rs35100176位点的CCT碱基插入变异能显著抑制启动子活性,从而影响IPO8基因的转录。     

Wilson病ATP7B基因启动子区突变对基因表达的影响

目的 探讨Wilson病ATP7B基因启动子区突变与Wilson发病的关系。方法 在48例患者中发现2例存在-183（C→T）突变，对发现存在突变的样本的DNA片段进行分离，克隆入pGL2荧光素酶报告基因，转染细胞，测定荧光素酶的活性，以野生型的ATP7B基因启动子作为对照，分析ATP7B基因启动子点突变对转录活性的影响。结果 含正常与含突变ATP7B启动子区序列的pGL2载体的荧光素酶转录活性相比较差异无统计学意义（n=3，P〉0．05）。结论 启动子区-183（C→T）突变不影响基因转录活性。提示该突变的意义有待进一步的探讨。