骨髓间充质干细胞的分离与培养

目的　摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件 ,并观察其部分生物学活性。方法　采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法 ,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响 ,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果　以选用 4～ 2 4h贴壁的有核细胞 ,加入 5 %～ 1 0 %胎牛血清、种植密度(4～ 8)× 1 0 4个 /ml的培养条件为最适宜细胞生长 ;在此条件下 ,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性 ;其形态呈梭状 ,具有快速增殖的能力 ;培养细胞在 3～ 4d进入对数生长期 ,随后进入平台期 ,分裂相细胞明显减少 ;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状 ,2～1 0代的细胞呈均质状 ;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论　建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件 ,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性 ,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础     

胎儿心脏间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的建立胎儿心脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)的分离培养方法,并检测其表面标志及多向分化潜能。方法取胎龄4~5月水囊引产胎儿心脏,用1.073 g/mL的Percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSC培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,并与胎儿骨髓MSC对比,研究其增生及生长特征。结果流式细胞术证明,胎心MSC表达干细胞标志,具有间充质细胞的特征及多向分化能力。原代及传代培养显示,同胎儿骨髓MSC一样,胎儿心脏MSC具有活跃增生的能力。结论胎儿心脏中可成功地分离MSC,为组织工程的种子细胞和基因工程的载体细胞提供了新的可行的来源。     

胎儿骨髓间充质干细胞生物学特征及荧光标记

目的:探讨分离、培养、扩增和荧光标记胎儿骨髓间充质干细胞(Bore mesenchymal stem cell,BMSCs)的方法及其生物学特征.方法:取4～5个月胎儿四肢骨骨髓,Ficoll离心、贴壁筛选法分离BMSCs,体外扩增,传至第12代.检测BMSCs的生长曲线,细胞周期和细胞表型,酶活性及糖原含量,以及DAPI标记BMSCs的标记率.结果:(1)BMSCs主要呈长梭形,漩涡状排列.传代细胞生长快于原代细胞,12代后的细胞出现衰老征象;(2)流式细胞术检测第3、8代细胞表达CD29、CD71,不表达CD34、HLA-DR;C0和G1期细胞约为93.73%,S、M和G2期为6.27%;(3)第5代细胞的非特异性酯酶及糖原均为阳性,碱性磷酸酶为弱阳性;(4)DAPI标记后的BMSCs生长正常,标记率为100%,后逐渐减弱,3周时标记率仅15%.结论:分离获得的胎儿BMSCs具有MSCs的特征.DAPI标记是短期示踪BMSCs的有效方法.     

兔骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

组织工程研究的临床应用尚有许多问题有待解决,其中之一为种子细胞的来源问题.骨髓间充质干细胞（MSCs）因其本身具有多向分化潜能和强大增殖扩增能力而日益受到人们的关注,并成为组织工程研究的主要种子细胞,有很好的应用前景.但因骨髓中MSCs含量少且易与其它细胞相混杂,故需进行体外纯化和扩增.本实验拟选择合适的MSCs体外分离、纯化和扩增的方法,以期建立一种较理想MSCs体外培养体系,为MSCs的临床应用提供理论依据和技术方法.     

骨髓间充质干细胞在肝脏疾病中的研究

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我复制和多向分化的潜能,在特定条件的诱导下可分化成神经细胞、肝细胞和脂肪细胞等组织细胞.Schwartz等[1]通过诱导大鼠骨髓原始多潜能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPCs)分化为肝细胞实验,证实肝干细胞可以由骨髓分化而来.随后Clarke等[2-3] 在加入肝细胞生长因子等诱导MSCs实验中,发现有清蛋白(ALB)和细胞角蛋白18(CK-18)的RNA表达.     

骨髓间充质干细胞的分离培养和生物学性状

目的建立一种体外分离纯化和培养扩增人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的方法,并探讨其生物学特性,为MSCs的进一步应用研究提供数据.方法抽取人骨髓后用Percoll分离液经密度梯度离心法分离得到单个核细胞,以105个细胞/cm2密度接种,培养液为含10%胎牛血清的L-DMEM.倒置相差显微镜及吉姆萨-瑞氏染色观察其形态,MTT法测其生长曲线、流式细胞仪检测细胞周期及表面标记物.结果培养的MSCs 12h后换液,有部分细胞贴壁生长,4～5d可见有集落形成,14～20d左右可达到80%～90%融合,倒置相差显微镜及吉姆萨-瑞氏染色可见细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等,生长曲线图显示MSCs增殖活跃,流式细胞仪检测显示约有86%的细胞处于G0、G1期,表面标记物中CD14、CD34、VLA-1、CD45和HLA-DR阴性,而CD44、CD105和CD29阳性.结论成功地建立了一种分离培养人骨髓MSCs的方法,获得的细胞形态多样、增殖稳定.     

骨髓间充质干细胞分离与培养技术

1970年,Friedenstein首次从骨髓中分离出一种多能基质细胞,呈梭形,可以进行体外克隆和多向分化,被称为CFU-Fs(colony-forming unit fibro-blasts),随后发现这种骨髓来源的基质细胞是间叶组织细胞谱系的共同前体细胞,因其具有干细胞的部分特性,而被命名为骨髓间充质干细胞(BMS...     

骨髓间充质干细胞分离培养方法改进

目的本实验旨在建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。方法比较单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法(采用淋巴细胞分离液)结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs。结果成年人MSCs呈均一的成纤维细胞样,不表达造血谱系抗原CD14、CD34、CD45。结论利用密度梯度离心法(采用淋巴细胞分离液)结合贴壁培养法能有效分离纯化成年人MSCs,用此种方法培养的细胞具有MSCs的一般生物学特性。     

胎儿骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的从胎儿骨髓中分离培养纯化骨髓间充质干细胞(MSC),并进行细胞表面标志的检测,探讨MSC的培养方法。方法采用全骨髓培养、贴壁筛选法分离培养MSC,采用差速贴壁培养方法纯化细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志,并观察不同方法处理的培养界面对细胞贴壁和生长的影响。结果通过分离纯化培养,光镜下细胞形态以长梭形、不规则多角形为主;IV型胶原包被和Co60照射(照射量6GY)处理的培养瓶更利于MSC的贴壁、生长;流式细胞仪检测结果显示CD44( )、Stro-1( )、CD14(-)、CD34(-)、CD45(-)、CD11b(-)。结论采用贴壁筛选法和差速贴壁法结合可获得较高纯度的MSC,并且细胞生长良好,在体外具有较强的扩增能力。     

骨髓间充质干细胞简易分离纯化法

目前比较常用的分离骨髓间充质干细胞（MSC）的方法有全骨髓法。全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液除去不贴壁细胞,从而达到纯化MSC的目的,此方法简单、易行,所得细胞多能分化能力和增殖力好,但是对成纤维样细胞污染的问题不易解决。我们在全骨髓法基础上,增加两次差速法使成纤维样细胞去除率高达98％以上,此法为纯化MSC提供一新思路。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

小鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离?培养及鉴定

目的:建立一种高效,稳定的从小鼠骨髓中同时分离培养间充质干细胞(MSC)和内皮祖细胞(EPC)的方法.方法:从小鼠骨髓分离单个核细胞,经差速贴壁结合专用血清或特殊培养基分别扩增MSC和EPC.以成骨、成脂诱导分化鉴定MSC,并以流式细胞术(FCM)检测MSC纯度;以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1荧光双标,结合vWF、CD31免疫组化染色鉴定EPC,并计算其纯度.结果:早期贴壁细胞48 h换液时即可见明显集落形成,1周后即达80%融合,传至第3代后经诱导能够向成骨细胞和脂肪细胞分化,FCM检测CD29、CD34、CD45、CD90阳性率分别为(93.86±1.12)%,(0.48±0.38)%,(1.89±1.49)%,(94.11±3.32)%;2次贴壁细胞经EGM-2 MV专用培养基培养后,第3天开始伸展,第5天可见集落形成,约2周左右可融合近80%,传代后Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(75.2±4.5)%,vWF、CD31免疫组化染色阳性率分别为(55.7±4.7)%和(52.5±3.6)%.结论:采用该方法可以同时培养扩增骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,效率高,稳定性和重复性好.     

兔骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定

目的采用原代培养符合实验要求的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）,进行生物学特性分析,为进一步骨组织工程实验研究奠定基础。方法采用全骨髓冲洗手段,结合密度梯度离心与贴壁培养方式体外分离兔BMSCs,倒置显微镜观察细胞形态,MTT绘制细胞生长曲线,ALP染色试剂盒检测细胞成骨性能。结果原代培养12d后可获得纯化的兔BMSCs,经成骨条件培养液诱导培养后,形态相对稳定,具有成骨性能。结论采用骨髓冲洗结合密度梯度离心与贴壁培养方式能够成功分离培养大量较纯化的兔BMSCs,第1～3代细胞体外培养生长状态好,形态稳定且贴壁率较高,可以作为后续骨组织工程实验种子细胞。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

骨髓间充质干细胞的免疫调节活性

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一种多潜能的非造血干细胞,可以向多系分化,如骨、脂肪和软骨,并优先归巢于损伤组织,有利于组织修复。体外研究显示它们不诱导免疫应答,对识别、清除同种异体抗原的免疫细胞具有抑制作用。在动物实验中,骨髓间充质干细胞可以诱导外周免疫耐受并向损伤处迁移,抑制致炎细胞因子的释放,促进损伤组织修复。这种独特作用说明它们在细胞治疗和自身免疫性疾病治疗中发挥了积极作用。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMMSCs)向神经细胞分化的潜能。方法体外培养人BMMSCs,并诱导其向神经细胞分化。诱导前后观察细胞形态变化,免疫细胞化学法检测细胞神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达以鉴定细胞类型,流式细胞术检测细胞周期以确定细胞增殖活性。结果分离培养的BMMSCs有克隆增殖能力。诱导后,分化细胞呈现典型神经元的表型,且免疫荧光染色呈NSE阳性。流式细胞术分析显示诱导前BMMSCs的增殖指数(PI)较高,细胞增殖活跃。与诱导前比较,诱导分化细胞的PI显著降低(P<0.01),细胞增殖发生抑制,而分化阶段各期细胞比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMMSCs可以在体外增殖扩增,并能分化为神经元样细胞,且分化的神经元样细胞能较长时间存活。     

两种从骨髓中分离人间充质干细胞方法的比较研究

目的比较Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesen-chymal stem cells,hBMMSCs)与常用的Percoll分离法之间的差异.建立一种简便、实用的hBMMSCs分离方法.方法分别应用上述两种方法分离hBMMSCs,比较用两种方法从骨髓中分离的有核细胞得率及死亡率、贴壁细胞克隆数、细胞形态以及细胞表面标志.结果两种方法获得的有核细胞得率无显著差异(P＞0.05);Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法获得的有核细胞死亡率显著小于Percoll分离法(P＜0.01);Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法获得的hBMMSCs原代培养5 d的贴壁细胞克隆数/37.5 cm2显著多于Percoll分离法(P＜0.05).Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法与Percoll分离法获得的hBMMSCs细胞形态均一,为纺锤形或三角形;Fieoll(1.073g/ml)密度梯度离心法与Percoll分离法获得的原代hBMMSCs CDl05阳性表达率[(94.0±2.0)%vs(95.8±1.5)%]及CD34阴性表达率[(96.0±1.2)%vs(97±1.0)%]无显著差异(P＞0.05).结论与Percoll分离法相比较,Ficoll(1.073g/ml)密度梯度离心法分离hBMMSCs具有细胞死亡率较小,细胞得率较多的优点,是一种较好的hBMMSCs分离方法.     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的:分离培养和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞.方法:分离SD青年大鼠股骨,L-DMEM冲洗骨髓腔,制备细胞悬液接种培养,消化传代纯化细胞.传代的骨髓间充质干细胞进行增殖曲线、克隆形成能力测定,用免疫组化检测增殖细胞vimentin、laminin的表达.结果:传代的细胞在培养第1～2天为潜伏期,第3～6天是细胞快速增殖期,第6天达高峰,第 9天后速度减慢,进入平台期,并且随传代次数的增加,细胞增殖速度逐渐下降.随传代次数增多,克隆形成能力逐渐下降.第5代以后细胞基本纯化为骨髓间充质干细胞,细胞呈长梭形.免疫组化检测增殖细胞vimentin表达阳性、laminin表达阴性.结论:本实验方法能有效扩增大鼠骨髓间充质干细胞,而且简单易行.