细胞外热休克蛋白72作为Toll样受体内源性配体在大鼠缺血再灌注肝损伤中的表达及作用

目的探讨在大鼠缺血再灌注（I,R）肝损伤中,细胞外热休克蛋白72（Hsfr72）作为Toll样受体（TLR）内源性配体的表达及作用。方法将120只I／R组SD大鼠分为4组,每组30只,均予以I／R处理,其中A组于I／R处理前给予抗HSP72,B组给予重组HSP72,D组给予缺血预处理。同时假手术组（P组,30只）以及非手术组（N组,10只）为对照。之后于不同时间点采集标本,检测血浆丙氨酸转氨酶（AIJT）、肿瘤坏死因子仪（TNF—a）、HSP72及肝组织HSP72mRNA及其蛋白。结果P组术后血浆TNF．叭HSP72水平较术前均显著升高（P均〈0．01）。B组处理后相较I／R组其他分组,血浆ALT、TNF．d、HSP72均显著升高护均〈0．01）。P组及I／R各组的肝组织HSP72mRNA较术前均显著升高,且I／R各组升高较P组更为明显（P〈0．01）。结论大鼠肝组织I／R后释放的HSP72可能启动了TLR信号通路,从而导致肝细胞的炎性损伤。     

Toll样受体4在多器官功能障碍综合征大鼠肾组织中的表达

目的 动态监测多器官功能障碍综合征( MODS)大鼠肾组织中Toll样受体4( TLR4)蛋白的表达变化,探讨TLR4在MODS早期肾损伤中的作用.方法 实验在三峡大学医学院实验中心完成.将40只成年雄性SD大鼠随机(随机数字法)分为正常对照组(8只)、MODS模型组(32只),模型组又分为造模后6,12,24,48 h不同时相,每组8只.采用“二次打击”即眼球失血加腹腔注射脂多糖(LPS)制备MODS模型,对照组予以腹腔注射等量的生理盐水,造模完成后在不同的时相点搜集标本.肉眼、光镜观察肾组织的形态结构变化;采用流式细胞技术(FCM)测定肾组织和外周血白细胞表面TLR4蛋白表达.组间比较采用单因素方差分析(SNK法).结果 (1)正常对照组肾组织结构无改变;MODS组肾组织损伤较重.(2)流式细胞技术结果显示:与对照组比较,造模后6h肾组织TLR4的表达开始增高,但差异无统计学意义,12 h达到高峰(P＜0.01),24h开始下降(P＜0.01),48 h与对照组差异无统计学意义.与对照组比较,造模后外周m白细胞表面TLR4的表达6～48 h组均有明显增加(P＜0.0l).外周血WBC表面的TLR4与肾组织TLR4质量分数变化之间呈正相关,相关系数(r) 0.893 (P＜0.05).结论 在MODS的早期,大鼠肾组织TLR4表达迅速上调,高表达的TLR4可能在MODS肾损伤的发病中起重要作用.     

Toll样受体4在失血性休克小鼠肺组织HO-1表达中的作用

目的 探讨Toll样受体4(TLR4)在失血性休克并发急性肺损伤(ALI)小鼠肺组织血红素加氧酶-1(HO-1)表达中的作用.方法 采用小鼠失血性休克复苏模型,48只TLR4基因突变型小鼠C3H/HeJ和野生型小鼠C3H/HeN随机分为2组:①假手术组;②失血休克复苏组.分别于失血性休克复苏后6 h、24 h和48 h取颈动脉血行血气分析,检测肺组织HO-1蛋白和mRNA的表达、肺组织IL-6含量及髓过氧化物酶(MPO)活性.采用方差分析进行数据统计.结果 失血休克复苏后24 h C3H/HeN和C3HL/HeJ的肺组织中HO-1 mRNA和蛋白含量的表达、IL-6含量、MPO活性与假手术组比较显著增加(P＜0.01或P＜0.05);与C3H/HeN鼠比较,休克复苏后24 h C3H/HeJ鼠的HO-1mRNA和蛋白含量、IL-6含量和MPO活性明显降低(P＜0.01或P＜0.05).C3HL/HeN鼠休克复苏后24 h并发ALI并且PaO2/FiO2＜300 mmHg.结论 TLR4受体激活在失血性休克致ALI肺组织HO-1的表达中扮演重要角色.     

人胰腺组织Toll样受体4 表达的研究

目的：研究人胰腺组织Toll样受体4(TLR4)的表达分布。方法：采用免疫组化方法观察20例正常人胰腺组织冰冻切片TLR4的表达分布情况。结果：正常人胰腺主胰管上皮、血管内皮、胰岛和胰腺腺泡细胞可见TLR4的表达,其中胰管上皮和血管内皮表达尤为明显。结论：正常人胰腺胰管上皮及血管上皮存在TLR4的表达分布,此结果提示TLR4可能参与胰腺感染时识别和清除入侵病原体的免疫防御反应。     

Toll样受体4在急性肺损伤中的作用

目的观察Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因突变型小鼠与野生型小鼠内毒素攻击致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的差异,分析TLR4在ALI中的作用。方法采用TLR4基因突变小鼠(C3H/HeJ品系,TLR4~(-/-)及野生型小鼠(CBA品系,TLR4~( / )),用内毒素攻击复制小鼠ALI模型,用显微病理及肺干湿重比(W/D)分析肺损伤程度,检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)水平,探讨损伤差异的可能机制。结果用1,5 mg·kg~(-1)LPS溶液经尾静脉注射复制ALI模型,结果示TLR4突变小鼠肺组织大体及显微病理损伤较野生型小鼠减轻,同时肺组织水肿(W/D)亦较野生小鼠减轻,尤其是在大剂量(5mg·kg~(-1))时,差异有显著性[(4．08±0．1)vs．(4．55±0．2),n=10,t=12．71,P＜0．01]。突变小鼠肺组织PMN浸润水平较野生型低[MPO：1 mg·kg~(-1)组,(20．73±4．58)vs．(39．97±3．66),n=10,t=13．43,P＜0．01];5 mg·kg~(-1)组,[(24．0±3．94)vs．(48．5±4．07),n=10,t=15．33,P＜0．01],且两者均较假手术组高。结论TLR4可能通过介导中性粒细胞肺内聚集而导致ALI的发生发展。     

Toll样受体4在大鼠胰腺组织特异性分布表达

目的 探索Toll样受体4(TLR4)在大鼠胰腺组织的特异性分布表达。方法 采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组化SP方法，检测Wistar大鼠胰腺组织中TLR4 mRNA及TLR4蛋白的分布表达。结果 通过RT-PCR方法(31个循环)，从正常大鼠胰腺组织检测到549bp目的基因片段。免疫组化方法检测到大鼠胰腺内有TLR4表达，主要位于胰管上皮、血管、微血管内皮及胰岛组织，胰腺外分泌腺泡细胞未见TLR4表达。结论 TLR4在大鼠正常胰腺组织内有分布表达，主要定位于上皮组织(胰管上皮)和内皮组织(动脉、     

高容量血液滤过对内毒素休克犬心肌组织Toll样受体4表达的影响

目的 探讨高容量血液滤过(HVHF)对内毒素休克心肌组织Toll样受体4(TLR4)mRNA表达的影响.方法 健康犬16只,静脉注射脂多糖(LPS)650 μg/kg诱导犬内毒素休克模型.将制摸成功的动物按随机数字表法分为对照组和HVHF治疗组,每组8只.用放射免疫法测定血中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10含量,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定心肌TLR4 mRNA表达,电镜下观察心肌组织病理改变.结果 治疗组HVHF后1、2、4 h血清TNF-α(μg/L:0.59±0.15、0.51±0.12、0.41±0.10)、IL-6(ng/L:11.08±2.83、9.82±2.58、8.25±2.05)、IL-10(μg/L:57.28±5.93、53.81±5.83、50.67±6.33)的含量显著低于本组成模时[(0.84±0.16)μg/L、(16.97±2.50)ng/L、(70.86±5.43)μg/L]和对照组相应时间点[TNF-α(μg/L):0.75±0.14、0.74±0.11、0.72±0.11,IL-6(ng/L):15.33±3.20、14.66±3.24、14.20±3.33,IL-10(μg/L):71.54±4.73、70.71±4.34、69.35±4.60],差异均有统计学意义(均P<0.01).治疗组较对照组心肌TLR4 mRNA表达明显下调(t=3.58,P<0.01).相关分析显示,TLR4 mRNA表达与循环血中TNF-α、IL-6、IL-10浓度呈正相关(r1=0.785,r2=0.569,r3=0.635,均P<0.05).电镜下观察治疗组心肌病理损伤较对照组减轻.结论 HVHF能下调内毒素诱导休克犬心肌TLR4mRNA 表达,减轻心肌炎症反应和心肌损伤.     

失血性休克小鼠心肌Toll样受体2/4 mRNA的表达

目的 探讨无复苏对失血性休克小鼠心肌Toll样受体（TLR）表达变化的影响及其意义。方法 将45只C57BL／6小鼠随机分为失血性休克模型组、假手术组、脂多糖（LPS）组（由尾静脉注射LPS5mg／kg），每组15只；采用心脏穿刺法建立小鼠失血性休克模型。心肌TLR2mRNA和TLR4mRNA表达采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法进行分析；测定左室收缩末压（LVESP）以反映左室收缩功能。结果 ①与假手术组比较，失血性休克及LPS刺激后小鼠的动脉血压出现下降，均可导致左室收缩功能障碍；②失血性休克及LPS刺激后TLR2和TLR4的mRNA表达水平均出现不同程度上调，而假手术组在各时间点未见明显改变。结论 ①失血性休克及LPS刺激后心肌TLR2及TLR4的mRNA表达上调与心功能障碍存在密切联系，但这两种病理状态下的信号转导通路可能存在差异；②失血性休克和LPS刺激后TLR2、TLR4的mRNA升高增强了机体的天然免疫功能，提高了机体对急性炎症的应激能力，对机体具有保护作用，但其过度表达也可能对组织、器官功能产生损害。     

Toll样受体4与急腹症

Toll样受体4(TLR4)为研究最广的先天性免疫受体,主要与免疫、感染相关;已证明与多种感染性疾病、急性脏器损伤及某些肿瘤相关。近年来发现TLR4与新生儿坏死性小肠结肠炎、急性胰腺炎、腹膜炎等急腹症密切相关。现对其研究进展加以综述,为急腹症进一步的研究提供向导。     

Toll样受体2和4在老年慢性左心力衰竭中的表达

目的探讨Toll样受体2(TLR2)和T0ll样受体4(TLR4)在老年慢性左心力衰竭患者外周血单核细胞表面的表达。方法根据NYHA心功能分级和左室射血分数(LVEF)将健康对照者和慢性左心力衰竭患者分成对照组、心功能I级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级组。采用流式细胞仪检测外周血单核细胞表面TLR2和TLR4的表达。结果左心力衰竭患者不同心功能组中TLR2和TLR4的表达均显著高于对照组(均P<0.05),且随着心功能分级的升高而明显上升。LVEF随着心功能分级的升高而逐渐下降,且与对照组比较,均P<0.05。结论 TLR2和TLR4可能作为一种危险因素参与老年慢性左心力衰竭的发生发展。     

Leptin and stress protein (heat shock protein 72: HSP72) in patients with obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome

Leptin is a circulating hormone that is expressed abundantly and specifically in adipose tissue. Leptin induces a complex response involving control of body weight, energy expenditure and fat distribution. It is difficult for patients with obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome to reduce and maintain their weights. Therefore, it is important to understand the circadian rhythms and regulation of serum leptin levels in order to control the body weight of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS) patients. Heat shock protein(HSP) 72 is generally known to be a stress-inducible isoform that is barely detectable under unstressed conditions but which is rapidly synthesized during or after stress. Recent data suggest that OSAHS may have significant effects on the serum leptin levels and HSP72 levels in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of patients with OSAHS.     

抗热休克蛋白72多克隆抗体血清的制备和检测

目的 探讨在大肠杆菌中表达人热休克蛋白72（hHSP72）与组氨酸（His）的融合蛋白并制备其抗体血清的方法。方法 将hHSP72片断插入His融合表达载体pPROEX-1^TM，重组载体酶切鉴定后，在大肠杆菌中经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达获得His-hHSP72融合蛋白。采用纯化后的HSP72免疫新西兰白兔，制备抗血清；蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测重组抗原的免疫活性。结果 重组质粒酶切鉴定结果表明，hHSP72基因已正确插入到pPROEX-1^TM中，经IPTG诱导后，表达出分子质量约为73ku的蛋白，获得了效价为1：100000的多克隆抗体。Western blot检测证明，所制备的多克隆抗体可以与hHSP72特异性结合，其效价高于市售的单克隆抗体。结论 用hHSP72片断在大肠杆菌中能成功表达，并能制备得到多克隆抗体；这种多克隆抗体是一种新的高特异性和高灵敏度的试剂。     

Toll样受体4与肾纤维化的关系研究进展

肾纤维化是大多数慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的基本病理改变,其发病过程受到多种信号通路的调节。肾纤维化过程以持续炎症为特征,包括炎性细胞浸润和细胞因子分泌。Toll样受体4(Toll-likereceptor-4,TLR4)信号分子是介导肾脏炎症及纤维化的重要桥梁,可通过核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)激活炎性因子大量释放而造成肾纤维化。TLR4在肾纤维化中发挥重要作用。     

Interaction between heat shock protein 72 and alpha-fetoprotein in human hepatocellular carcinomas

BACKGROUND: AFP in adult serum often signals pathological conditions, particularly the presence of hepatocellular carcinoma (HCC) and germ cell tumors containing yolk sac cell elements. Heat shock protein 72 (HSP72) as a molecular chaperone has been confirmed to overexpress in epithelial carcinoma cells. There may be a possible correlation between the expression of HSP72 and AFP during the growth and differentiation of hepatocellular carcinoma cells. We investigated the interaction between heat shock protein 72 (HSP72) and alpha-fetoprotein (AFP) in human hepatocellular carcinomas. METHODS: The expression and localization of HSP72 and AFP in human hepatocellular carcinomas were determined by immunohistochemistry and confocal laser microscopy. The interaction between HSP72 and AFP in hepatocellular carcinoma cells was analyzed by immunoprecipitation and Western immunoblots. RESULTS: Hepatocellular carcinoma synchronously co-expressed higher level of HSP72 and AFP than in adjacent normal liver tissues. HSP72 were stained in cell nuclei and cytoplasm respectively, while AFP stained in cell plasma. Based on Western blotting methods, AFP was detected in the immunoprecipitate of anti-HSP72 monoclonal antibody (mAb), while HSP72 existed in the immunoprecipitate of anti-AFP mAb. CONCLUSIONS: HSP72 and AFP expression are higher in hepatocellular carcinoma tissues. HSP72 was associated with alpha-fetoprotein in human hepatocellular carcinoma cells. The interaction between HSP72 and AFP in human hepatocellular carcinoma cells can be a new route for studying the pathogenesis and immunotherapy of hepatocellular carcinoma.     

Hydrogen peroxide induces midzonal heat shock protein 72 and apoptosis in sinusoidal endothelial cells of hypoxic rat liver

OBJECTIVE: To investigate the heat shock protein (HSP) 72 expression and apoptosis induced by hydrogen peroxide in hypoxic rat liver. DESIGN: Prospective control study using the isolated rat liver. SETTING: Animal research facility. SUBJECTS: Fasted, pathogen-free specific, male Sprague-Dawley rats. INTERVENTIONS: A low-flow hypoxia model was made by reducing an afferent pressure from 10 to 2.5 cm H2O, and by perfusing the isolated rat liver for 2 hrs. MEASUREMENT AND MAIN RESULTS: We investigated the hydrogen peroxide production by using the 2'-7' dichlorofluorescein image, the induction of HSP 72 by using immunohistochemistry, and apoptosis by using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling method in the low flow hypoxic rat liver. In low-flow hypoxia, hydrogen peroxide production, HSP 72 expression, and apoptosis were induced in the midzone of rat liver. Prevalence of HSP 72 expression was higher in the sinusoidal endothelial cells (SEC) than in the hepatocytes. All apoptotic cells were SEC with expression of HSP 72. Hydrogen peroxide was derived from hepatocytes. Pretreatment with the specific xanthine oxidase inhibitor, sodium(-)-8-(3-methoxy-phenylsulfinylphenyl) pyrazolo [1,5-a]-1,3,5-triazine-4-olate monohydrate significantly attenuated hydrogen peroxide production, HSP 72 expression, and apoptosis of SEC in the midzone. CONCLUSION: Xanthine oxidase-dependent hydrogen peroxide induces midzonal and SEC-dominant HSP 72 expression and apoptosis in hypoxic rat liver.     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要.目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础.方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定.结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达.成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达.     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1（＋）的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

超声微泡造影剂介导HSP72 siRNA基因转染对大鼠缺血-再灌注肝损伤的作用

笔者前期的研究中发现,缺血-再灌注肝损伤中过度表达的热休克蛋白72 (heat shock protein 72,HSP72)可以释放至细胞外,并作为Toll样受体的内源性配体启动炎性应答而导致肝组织细胞损伤[1-2];HSP72 siRNA能抑制体外热应激肝细胞释放HSP72[3].本研究利用超声微泡造影剂结合HSP72siRNA,并靶向转染入肝组织,观察HSP72siRNA在肝组织细胞内的表达及对肝组织细胞损伤的影响.     

高氧致大鼠急性肺损伤Toll样受体2和4的变化及意义

目的 探讨Toll样受体(TLRs)在高氧致急性肺损伤(ALI)发病过程中的作用.方法 将32只SD大鼠按随机数字表法分为空气对照组和高氧暴露24、48、72 h组,每组8只.分别于相应时间点活杀8只大鼠,取肺组织标本,测定肺湿/干重(W/D)比值并行肺组织病理评分,用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定肺组织TLR2和TLR4的mRNA表达,用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)测定肺组织TLR2和TLR4的蛋白表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定肺组织匀浆中白细胞介素-6(IL-6)含量.结果 各高氧暴露组肺W/D比值均较空气对照组明显增高(P均<0.01).高氧暴露48 h、72 h肺组织病理评分[(2.69±0.53)分,(3.94±0.62)分]均明显高于空气对照组[(0.41±0.38)分,P均<0.01].RT-PCR结果显示,高氧暴露组肺组织TLR2和TLR4 mRNA表达均明显高于空气对照组(0.67±0.15和0.63±0.19),并均于24 h达高峰(1.82±0.33,1.35±0.26,P均<0.05).Western blotting结果显示,高氧暴露组TLR2和TLR4蛋白表达均较空气对照组[(7.20±0.51)%和(14.26±0.19)%]明显增高,分别于48 h、72 h达峰值[(28.12±0.24)%,(81.35±0.82)%,P均<0.05].ELISA结果显示,高氧暴露组肺组织匀浆IL-6含量较空气对照组[(639.38±95.24)pg/L]明显增高,于72 h达高峰[(1 300.58±442.24)pg/L,P<0.05].结论 在高氧引起的ALI中,TLR2和TLR4在肺组织炎症启动和维持中起重要作用.     

异丙酚对心肌缺血再灌注损伤大鼠模型Toll样受体4及高迁移率族蛋白1表达的影响

目的 探讨异丙酚对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠模型的保护机制.方法 将60只大鼠随机分为假手术组(A组)、假手术联合异丙酚组(B组)、心肌缺血再灌注组(C组)、心肌缺血再灌注联合异丙酚组(D组).A组于左心耳根部2 mm处穿线后,不夹闭左冠状动脉前降支及心大静脉,60 min后缝合;B组手术开始静脉泵入异丙酚6 ...