丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的 建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型．方法 用HCV阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2、SMMC 7721及胎肝细胞株L02，继续培养60d，用巢式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCV RNA。结果 HepG2、SMMC 772l在感染后第2-30d，L02在感染后第3-30d细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后第3-30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第3l—60d仍可间断检出，但复制程度逐渐减弱。3株细胞的培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均末检出HCV负链RNA。结论 HePG2、SMMC772l及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期复制。而HePG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的进一步研究

为进一步研究外周血单个核细胞 (PBMC)感染丙型肝炎病毒 (HCV)的状况。用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、地高辛标记 HCV探针作原位杂交和链酶亲和素 -生物素 (SABC)作免疫组化三项技术 ,检测血清和 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5 抗原。结果显示 RT- PCR检测的 2 0例慢性丙型肝炎患者 ,除去 4例接受干扰素治疗者 ,余16例中有 14例 (87.5 % )血清 HCV RNA阳性 ,2例血清 HCV RNA阴性者的 PBMC- HCV RNA阳性。对 RT- PCR检测的 9例 PBMC- HCV RNA阳性患者 ,进一步用原位杂交和免疫组化技术 ,分别检测 PBMC中的 HCV RNA和HCV NS5 抗原。显示这几种方法的检测结果是基本一致的 ,呈正相关关系。患者的 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原呈散在颗粒状或弥漫分布 ,主要位于胞浆中 ,HCV NS5 抗原还分布于胞膜上。证实 HCV可以感染 PBMC,并在其中复制 ,复制部位在胞浆。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

2a基因型丙型肝炎病毒体外感染人 CD4＋T 细胞模型的建立

目的：建立2a基因型丙型肝炎病毒（ HCV）体外感染CD4＋T细胞模型。方法密度梯度离心法从抗HCV阴性健康个体的外周血提取外周血单核细胞（ PBMC）,从PBMC中分选CD4＋T细胞,HCV病毒颗粒感染CD4＋T细胞,逆转录聚合酶链反应（ RT－PCR）检测HCV RNA,免疫印迹法（ Western blot ）检测HCV的NS3和NS5A蛋白。结果感染后的CD4＋T细胞中,RT－PCR检测到HCV RNA,Western blot检测HCV的NS3和NS5A蛋白。结论成功建立2 a基因型HCV体外感染CD4＋T细胞模型,为进一步研究HCV慢性持续性感染的机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒NS5B在Hep3B细胞的表达及活性分析

目的丙型肝炎病毒NS5B基因转染人肝癌细胞系Hep3B细胞,检测NS5B的表达与细胞内RNA聚合酶活性。方法使用脂质体把包含全长丙型肝炎病毒NS5B基因的重组载体pcDNA-5B转染到Hep3B细胞。RT-PCR和Wes-tern blot鉴定NS5B基因的表达,荧光素酶检测NS5B的细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结果RT-PCR和Westernblot发现转染NS5B基因的Hep3B细胞产生NS5B mRNA和NS5B蛋白,荧光素酶分析表明Hep3B细胞表达的NS5B蛋白具有细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。结论人肝癌细胞系Hep3B细胞可以成功表达NS5B基因,且表达的NS5B蛋白具备细胞内RNA依赖的RNA聚合酶活性。     

高表达CD81的Huh7细胞株对提高HCV病毒感染效率的研究

目的建立具有高感染性的丙型肝炎病毒（HCV）的体外细胞株。方法构建高表达CD81的Huh7细胞株。将HCV质粒（JFH-1,2a）体外转录成RNA,电转染到Huh7和CD81-Huh7细胞中,实时定量PCR法检测两组细胞和培养上清液中病毒载量,间接免疫荧光法检测细胞中HCV核心蛋白表达。收集电转后细胞上清液重新感染两组细胞,检测细胞中病毒RNA表达。结果 CD81-Huh7电转后,细胞和上清液中病毒RNA水平均明显高于Huh71-2log。其被感染的效率也高于Huh7。结论成功建立一株能够高表达感染性HCV病毒颗粒的细胞株CD81-Huh7。     

HCV亚基因复制子支持细胞的筛选

目的寻找新的支持HCV亚基因复制子复制的支持细胞,为研究HCV复制机制、HCV与宿主间的关系,及建立HCV缺陷病毒培养体系提供材料储备。方法质粒pNNeo3-5B含HCV-N亚基因复制子cDNA,该复制子RNA能在Huh7细胞中有效复制。缺失其中的BsaBⅠ-HpaⅠ片段(含NS5B的GDD基序),生成缺陷型复制子质粒pNNeo3-5B(Δ)。将以上两个质粒线性化后体外转录出复制子RNA:rNNeo3-5B和rNNeo3-5B(Δ)。将rNNeo3-5B电转染Huh7、SMMC7721、HepG2、BEL7402、Lo2、CBRH7919、BHK21、VeroE6、293和293T等细胞,以G418筛选3周,观察克隆形成情况,并检测克隆中HCV特异性RNA和蛋白。结果在CBRH7919和BHK21获得G418抗性克隆,转染rNNeo3-5B(Δ)的细胞和未转染复制子的细胞则全部死亡。RT-PCR检测证实各克隆都含有HCV5′NTR和新霉素磷酸转移酶基因,间接免疫荧光和Westernblot检测证实有大量表达的HCVNS3和NS5A蛋白,未转染复制子的细胞全为阴性。结论本研究证实CBRH7919和BHK21能支持HCV复制子的自主复制,可作为建立HCV病毒培养体系的备选材料。     

慢性丙型肝炎病毒对肝癌细胞静止的影响及其机制研究

目的 探讨慢性丙型肝炎病毒（HCV）通过PCNA钳位相关因子（PCLAF）调控肝癌细胞静止的潜在机制。方法 HCV感染后,检测肝癌细胞HUH7的细胞周期分布。HCV感染或不感染后,肝癌细胞进行RNA-seq,使用siRNA敲低差异基因并检测细胞周期分布。过表达PCLAF后检测肝癌细胞的细胞周期分布。过表达HCV的非结构蛋白5A（NS5A）后,检测肝癌细胞PCLAF的表达和细胞周期分布。PCLAF抑制剂α-常春藤皂苷处理后,检测HCV对肝癌细胞周期分布的影响。结果 HCV感染后,肝癌细胞G0期和G1期细胞分布减少（P <0.05）,而S期和G2/M期细胞分布增加（P <0.05）。敲低PCLAF后肝癌细胞G0期细胞分布增加（P <0.05）。HCV感染的情况下,过表达PCLAF后肝癌细胞G0期细胞分布减少（P <0.05）。过表达NS5A后,肝癌细胞PCLAF mRNA和蛋白相对表达量升高（P <0.05）。过表达NS5A后,肝癌细胞G0期和G1期细胞分布减少（P <0.05）,而S期和G2/M期细胞分布增加（P <0.05）。但过表达NS5A的同时敲低PCLAF后,肝癌细胞的细胞周期分布无显著变化。过表达NS5A同时α-常春藤皂苷处理后,肝癌细胞的细胞周期无显著变化。HCV感染同时α-常春藤皂苷处理后,肝癌细胞的细胞周期无显著变化。结论 HCV诱导肝癌细胞跨越G0/G1期静止,减少细胞分裂时间。HCV的NS5A蛋白通过提高PCLAF的表达而抑制肝癌细胞静止。PCLAF抑制剂α-常春藤皂苷可以阻断HCV抑制的肝癌细胞静止。     

RNAi对HCV ns5b基因表达的抑制作用

目的：研究RNAi(RNA interference)效应对HCV ns5b基因表达的抑制作用．方法：根据HCV ns5b基因序列及其二级结构特征，依据Tuschl等设计siRNA的原则，确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs；利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B-EGFP HepG2细胞株，以未转染的细胞为对照；细胞爬片后经DAPI染色，荧光显微镜下观察和半定量RT-PCR法检测siRNAs的抑制效应．结果：化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达，效率可达70％-80％以上，结论：在细胞水平上，化学合成的siRNAs可以抑制HCV ns5b基因的表达，为利用RNAi抑制HCV RNA复制的研究奠定基础。     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )阳性血清 (抗HCV阳性及HCVRNART PCR阳性 )感染HepG2细胞 ,以期建立稳定的HCV感染的细胞模型。方法 :采用丙肝阳性血清连续感染法感染HepG2细胞 ,用逆转录多聚酶链反应检测传代HepG2细胞内HCVRNA正链和负链 ,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒 ,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原 (HCVNS5、HCVcapsid)的存在。结果 :感染后传代的第一代至第三代细胞内检出HCVRNA正链及负链 ;在感染后传代的细胞内发现球形、密集分布的类丙肝病毒颗粒 ,直径为 30～ 6 0nm ;免疫金银染色发现部分细胞内有聚集的银染颗粒 ;免疫电镜检查在细胞胞浆的囊泡样结构中发现聚集的金颗粒。结论 :HCV可在HepG2细胞内复制 ,可形成病毒颗粒 ,可随细胞传代。本研究初步建立了用丙肝阳性血清感染HepG2细胞的丙肝病毒感染细胞模型     

Chronic HCV histology is predictable from HCV RNA and IgM anti HCV results

The aim of this study was to determine if knowledge of both the serum HCV RNA and serum anti core IgM antibody status enabled one to predict the histological severity in chronic hepatitis C. We studied 45 female patients with chronic hepatitis C infection. The presence or absence of IgM antibodies to HCV and HCV RNA by PCR in each patient's serum was determined. Liver biopsies performed were scored according to a modified Desmet's histological activity index. Negative HCV RNA patients had least histological change. HCV RNA positive patients who were also IgM antibody positive had lower scores than their IgM negative counterparts. The grade of histological severity is more accurately predictable from knowledge of both the HCV RNA and IgM anti HCV status of the patient.     

丙型肝炎病毒基因型与慢性丙型肝炎患者预后的相关性研究

目的 探讨丙型肝炎(HCV)病毒基因型与慢性HCV患者经抗病毒治疗实现持续病毒学应答(sustained virological response,SVR)之间的关系.方法 选取慢性HCV患者45例,根据治疗后患者是否实现SVR分为SVR组(n=14)和非SVR组(n=31).采用线性探针反向杂交法(INNO-LiPA)检测HCV基因型,两组患者经聚乙二醇干扰素(PEG-IFN)联合利巴韦林(RBV)治疗后检测SVR,分析HCV基因型与SVR之间的相关性.结果 非SVR组中HCV基因1型患者显著多于SVR组,差异具有统计学意义(P＜0.05);HCV基因型与PEG-IFN联合RBV治疗响应有显著相关性,HCV基因2、3型是与治疗反应相关的最强因素,且独立于其他变量之外,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 HCV基因型是慢性HCV感染患者经PEG-IFN联合RBV治疗预后的一个重要独立预测因素,可用于患者最佳抗病毒治疗方案的选择.     

应用荧光定量PCR检测血清中HCV RNA

目的 :探讨荧光定量PCR(FQ PCR)法检测血清中丙型肝炎病毒 (HCV)含量的敏感性、特异性。方法 :采用FQ PCR和逆转录巢式PCR同步检测 76份HCV抗体阳性血清标本 ,并对两种方法的检测结果进行对照比较。结果 :FQ PCR定量HCVRNA拷贝数在 10 2 ～10 6拷贝·μl-1,其中低于 10 3 拷贝·μl-1占 2 0 .93 % ,10 3 ～ 10 5拷贝·μl-1占 60 .47% ,高于 10 5拷贝·μl-1占 18.60 %。 76份HCV抗体阳性血清中 ,巢式PCR检测阳性为 45份 ,FQ PCR检测阳性为 43份 ,二者相对符合率为 97.3 7%。结论 :FQ PCR检测HCVRNA与常规定性巢式PCR特异性、敏感性基本一致。     

一滴血最易感染丙肝

1000人在看病的时候,遇到来自丙肝、艾滋病、乙肝患者的针孔一滴血,从感染几率来说,最可能患上的是什么病?肝病著名专家魏来教授认为,他们中的300人会感染丙肝,30人会感染艾滋病,3人会感染乙肝。前不久,全球最大规模的肝病学术大会上,作为我国"十五"攻关计划丙型肝炎项目的负责人,魏来教授呼吁,我国肝病防控要把重心慢慢转     

昆明地区HIV和HCV共感染者丙型肝炎病毒基因型特征

目的分析昆明地区人类免疫缺陷病（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）共感染者丙型肝炎病毒基因型分布。方法对204例经逆转录聚合酶链反应检测HCV病毒栽量,核酸为阳性的样品,利用反向点杂交技术进行HCV基因分型检测,其中60例经免疫印迹试验（WB）确认的HIV感染者,对共感染和非共感染组的丙型肝炎病毒基因型分布进行分析。结果204例HCV患者中3b型85例（HCV感染率最高,为41．6％）;1b型HCV感染在HIV／HCV共感染组中的感染率（30．0％）明显高于单纯HCV感染组感染率（20．0％）（P〈0．05）。而3b型HCV感染在HIV／HCV共感染组中的感染率（35．0％）明显低于单纯HCV感染组感染率（44．2％）（P〈0．05）。1b型,3a型和3b型HCV合并HIV感染的发生率较高;2a型和6a型HCV合并HIV感染的发生率较低。不同丙肝基因型HIV／HCV共感染者间感染途径以静脉药隐为主,其次是性接触。结论昆明地区共感染纽中的HCV流行的基因亚型有1b,3a,3b,6a共4种,1h为流行的主要基因亚型3a,3b和6a型均占相当比例,初步说明昆明地区HCV流行的基因亚型呈现多样性．     

丙型肝炎病毒RNA定量检测与抗-HCV及ALT的关系

目的了解丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV RNA）定量与丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）及丙氨酸氨基转移酶（ALT）的关系。方法用荧光定量逆转录聚合酶反应（FQ—RT—PCR）检测239例抗-HCV阳性者的HCVRNA定量，同时检测ALT水平。结果239例中，150例（62．8％）HCV RNA定量高于80拷贝／ml；133例ALT异常，其异常率随HCV RNA定量的升高而增加。ALT异常例数与正常例数差异有统计学意义（P〈0．01），ALT水平与HCVRNA定量无相关性（r=0．524，P〉0．05），而ALT异常率与HCV RNA定量呈正相关（r=0．955，P〈0．05）。结论HCV RNA是反映HCV复制的可靠指标，结合ALT结果可帮助了解HCV在体内复制状况。     

丙型肝炎病毒核酸、核心抗原和抗体联合检测的临床意义

目的探讨丙型肝炎病毒核酸、核心抗原和抗体检测联合应用的意义。方法抗-HCV和HCV-cAg用ELISA法检测,HCV-RNA用RT-PCR法检测。结果1761例病人共测得阳性标本57例,其中抗-HCV阳性54例,HCV-cAg阳性22例,同时阳性为19例。3例HCV-RNA而抗-HCV阴性样本中检出HCV-cAg。22例HCV-cAg阳性标本经HCV-RNA检测均为阳性。结论HCV-RNA、抗-HCV和HCV-cAg联合检测可起到互补作用,提高检出阳性率,有利于早期诊断。     

丙型肝炎病毒核酸、核心抗原和抗体联合检测的临床意义

目的探讨丙型肝炎病毒核酸、核心抗原和抗体检测联合应用的意义。方法抗-HCV和HCV-cAg用ELISA法检测,HCV-RNA用RT-PCR法检测。结果1761例病人共测得阳性标本57例,其中抗-HCV阳性54例,HCV-cAg阳性22例,同时阳性为19例。3例HCV-RNA而抗-HCV阴性样本中检出HCV-cAg。22例HCV-cAg阳性标本经HCV-RNA检测均为阳性。结论HCV-RNA、抗-HCV和HCV-cAg联合检测可起到互补作用,提高检出阳性率,有利于早期诊断。