In vitro expression of hepatitis C virus non-structure 5 antigen in the HepG2 cell line

Summary To establish a cell line as a model system for HCV infection and propagationin vitro, a human HepG2 cell line was incubated with a HCV RNA positive serum. The sABC immunological techniques and gold-labeled colloid electron microscopy method were employed to examine the viral proteins in those cells. The HCV non-structure 5 antigen was first detected in the HepG2 cells 72 h after incubation. The antigen was continuously observed in the cytoplasm as well on the membrane of the HepG2 cells even after 1, 2, 3 and 4 weeks after incubation. The observation of HCV non-structure 5 antigen continuously expressed in the HepG2 cells strongly indicates that the cells may have been infected by HCV virus. Therefore, the HepG2 cell line may serve as a potential host for establishment of HCV infection and propagationin vitro. This project was supported by a grant of the National Educational Committee for return scholars (No.)     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的：用丙型肝炎（丙肝）阳性血清（抗ＨＣＶ阳性及ＨＣＶＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ阳性）感染ＨｅｐＧ２细胞,以期建立稳定的ＨＣＶ感染的细胞模型。方法：采用丙肝阳性血清连续感染法感染ＨｅｐＧ２细胞,用逆转录多聚酶链反应检测传代ＨｅｐＧ２细胞内ＨＣＶＲＮＡ正链和负链,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原（ＨＣＶＮＳ５、ＨＣＶ ｃａｐｓｉｄ）的存在。结果：感染后传代的     

体外培养人肝癌细胞系7721中HCV复制和表达特性

建立支持ＨＣＶ体外长期复制的细胞培养体系,研究其体外复制和表达特性。方法：将ＨＣＶ感染血清接种人肝癌细胞系７７２１后,以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化、原位杂交检测细胞内ＨＣＶ的感染和复制情况。结果细胞内和培养上清中在孵育后的３月余均可间断地检测出ＨＣＶ正链和／或负链ＲＮＡ,多种ＨＣＶ抗原在细胞内能稳定有达;ＨＣＶ ＲＮＡ和抗原多位于胞浆中,结论ＨＣＶ在７７２１细胞系中的复制和表达与体内感染状态接     

丙型肝炎阳性血清直接感染HepG2细胞的初步研究

目的 :用丙型肝炎 (丙肝 )阳性血清 (抗HCV阳性及HCVRNART PCR阳性 )感染HepG2细胞 ,以期建立稳定的HCV感染的细胞模型。方法 :采用丙肝阳性血清连续感染法感染HepG2细胞 ,用逆转录多聚酶链反应检测传代HepG2细胞内HCVRNA正链和负链 ,电镜观察感染后的细胞内的病毒颗粒 ,免疫组化方法检测感染后的细胞内丙肝病毒蛋白抗原 (HCVNS5、HCVcapsid)的存在。结果 :感染后传代的第一代至第三代细胞内检出HCVRNA正链及负链 ;在感染后传代的细胞内发现球形、密集分布的类丙肝病毒颗粒 ,直径为 30～ 6 0nm ;免疫金银染色发现部分细胞内有聚集的银染颗粒 ;免疫电镜检查在细胞胞浆的囊泡样结构中发现聚集的金颗粒。结论 :HCV可在HepG2细胞内复制 ,可形成病毒颗粒 ,可随细胞传代。本研究初步建立了用丙肝阳性血清感染HepG2细胞的丙肝病毒感染细胞模型     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721,培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达,并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原E1在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后,RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA,细胞培养上清中可检出HCV正链RNA,CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

人肝癌细胞系7721与原代人胎肝细胞用于体外培养HCV的对比研究

目的 研究丙型肝炎病毒（HCV）在体外培养原代人胎肝细胞和人肝癌细胞系7721中复制和表达的异同,探讨HCV体外培养条件。方法 原代人胎肝细胞系7721分别与HCV感染血清共孵育后,用逆转录-聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化检测细胞和培养上清中的HCV RNA和抗原表达。结果 从孵育的2～3天,即可在细胞内和/或培养上清中间断地检出HCV RNA（其中HCV在7721细胞株中的复制至少可达66d,HCV在 人胎肝细胞中的复制持续25d）;HCV抗原可在感染细胞内得到稳定表达,感染细胞内存在HCV负链RNA杂交信号,且多位于细胞浆。结论 两种肝细胞对HCV易感,尤其是7721细胞可以稳定地支持HCV体外复制,可用于HCV体外长期培养的靶细胞。     

重组丙型肝炎病毒在7721细胞中的复制

目的 探讨构建的重组丙型肝炎病毒(HCV)能否在易感细胞系中复制和表达。方法 用人工构建的HCV感染易感细胞系7721，培养72h后利用RT-PCR检测HCV的RNA表达，并应用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察免疫荧光标记的HCV核心抗原和胞膜抗原EI在细胞中的表达。结果 人工构建的HCV感染7721细胞72h后、RT-PCR检测细胞内可检出HCV正链及负链RNA，细胞培养上清中可检出HCV正链RNA，CLSM检测HCV核心抗原和E1抗原在细胞内的分布呈胞浆型。结论 构建的HCV72h内可以在易感细胞系7721中复制和表达。     

丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验研究

目的 建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型．方法 用HCV阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2、SMMC 7721及胎肝细胞株L02，继续培养60d，用巢式逆转录-聚合酶链反应(nested RT-PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCV RNA。结果 HepG2、SMMC 772l在感染后第2-30d，L02在感染后第3-30d细胞中可以间断检出HCV正链RNA；3株细胞的细胞内HCV负链RNA均在感染后第3-30d可以间断检出，检出率与正链RNA接近。3株细胞以HepG2细胞中HCV RNA正、负链检出率较高，并在第3l—60d仍可间断检出，但复制程度逐渐减弱。3株细胞的培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性，检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均末检出HCV负链RNA。结论 HePG2、SMMC772l及L02细胞均对HCV易感，并能支持HCV长期复制。而HePG2细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活SV40病毒早期启动子的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A的反式激活作用。方法：扩增HCV NS5A基因，构建HCV NS5A基因真核表达载体pcDNA3．1(-)—NS5A；并转染肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，免疫印迹方法检测转染细胞中HCV NS5A蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3--promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法检测细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果：质粒pcDNA3．1(-)—NS5A在HepG2细胞瞬时表达HCV NS5A蛋白，共转染实验中pcDNA3．1(-)—NS5A组的CAT表达活性是空质粒对照组的3．8倍。结论：构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS5A蛋白反式激活的靶基因，深入阐明HCV NS5A蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供依据。     

HCV发夹状siRNA表达质粒的构建及作用研究

目的建立HCV感染动物模型,并对HCV进行RNA干涉。方法制备HCV感染的HepG2细胞,RT-PCR法鉴定后腋下注射裸鼠,免疫组化法检测瘤组织内HCV NS3表达情况。制备带绿色荧光蛋白（GFP）的HCVsiRNA表达质粒,转染HepG2细胞,观察GFP表达情况。将此质粒注射模型小鼠,取瘤组织,RT-PCR及免疫组化法对其进行检测。结果在HCV感染的裸鼠实体瘤中检测到HCV NS3蛋白的稳定表达。成功构建了HCV发夹siRNA表达质粒,该质粒转染细胞后能够在其内正确表达。将该质粒尾静脉注射HCV感染的模型小鼠,注射4d后瘤组织内HCV NS3抗原阳性细胞阴转。结论成功建立了HCV感染的裸鼠模型,构建了HCV发夹siRNA表达质粒,该质粒能成功地干涉模型小鼠中的HCV。     

Characteristics of HCV replication and expression in a cultured human liver carcinoma cell line in vitro

ProgressonhepatitisCresearchhasadvancedquickly.However,theabsenceofcellculturesystemofHCVinfectionhashamperednotonlytheunder-standingofitslifecycle,butalsotheanalysisofthemoleculardeterminantsofitspersistence.Toidentifycriticalepitopesthatelicitaneutralizingantibodyre-sponseandtounderstandthepathogenesisofpersis-tentHCVinfection,efficientcellmodelsofHCVin-fectionisneeded[1].HumanT-lymphocytecelllines[2-5],humanfibroblastcells[6](VH3),peripheralbloodmono-nuclearcells[7](PBMCs)andhepatocy…     

高能X线照射对人肝癌细胞株HepG2凋亡及bcl-2、Fas表达的影响

目的:研究高能X线照射后不同时间点人肝癌细胞株HepG2凋亡及bcl-2、Fas表达的变化,为原发性肝癌放射治疗的时间剂量分割提供借鉴。方法:用吸收剂量为5Gy的6MVX线单次照射HepG2细胞,以流式细胞仪测定受照后不同时间的细胞凋亡率,以免疫细胞化学法检测细胞受照前后bcl-2和Fas的表达水平。结果:高能X线可诱导HepG2细胞发生凋亡,照射后6h细胞凋亡率达到高峰(32%),同时bcl-2表达水平下降,Fas表达水平升高。结论:高能X线能够诱导肝癌细胞株HepG2发生凋亡,bcl-2及Fas可能参与其细胞凋亡的调控。     

HBV转染肝癌细胞系基因表达谱改变的研究

目的 利用寡核苷酸芯片筛选HBV感染应答基因,探讨HBV感染分子致病机制.方法 选用Agilent Human 1A Oligo基因芯片进行乙型肝炎基因表达改变的研究,用Cy3标记实验细胞(HepG2.2.15细胞),Cy5标记对照组细胞(HepG2细胞),比较HepG2.2.15细胞与HepG2细胞之间的基因表达谱差异;用适时定量PCR(RQ-PCR)对部分差异基因进行验证.结果 通过杂交、扫描、统计学分析,根据P Value LogRatio值及gProcessed signal/rProcessed signal值从近20 000个基因中共筛选出差异表达基因744个,其中423个基因表达上调,321个基因表达下调.用RQ-PCR技术对其中4个相关基因胰岛素样生长因子2(IGF2)、甲胎蛋白(AFP)、干扰素同源序列结合蛋白(ICSBP)、核糖核苷酸还原酶缩多氨酸M1(RRM1)的表达差异进行了验证,与表达谱的结果基本保持一致.结论 通过验证,表达谱芯片的杂交结果真实可靠,为下一步继续进行差异表达基因的研究、了解HBV的致病机制打下了基础.     

远红荧光蛋白报告基因mKate2对肝癌细胞的标记及荧光成像

目的 制备远红荧光蛋白报告基因mKate2慢病毒,用于标记人肝癌细胞株HepG2,并进行体外的细胞荧光成像,为肿瘤的活体荧光成像示踪提供基础.方法 以pmKate2-N质粒为模板,将mKate2基因克隆到慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST;pLenti6.3-mKate2表达质粒和包装质粒共转染293T细胞进行病毒包装,并测定慢病毒的活性滴度;mKate2慢病毒以病毒感染复数(MOI)=6感染HepG2 96 h后,通过荧光显微镜观察和流式细胞分析法(FACS)检测感染效率;收集2×106个mKate2-HepG2细胞,通过光学成像系统进行荧光成像,确定最佳成像参数.结果 测序结果显示,mKate2基因序列正确,无突变或缺失;mKate2慢病毒的活性滴度为1.6×106TU/ml;mKate2慢病毒感染HepG2 96 h后,荧光显微镜下观察到大量红色荧光蛋白的表达,FACS检测显示mKate2的阳性率为93.8%±0.4%;激发光(530±15)nm和发射光(710±28)am为对mKate2-HepG2细胞进行荧光成像的最佳参数.结论 慢病毒能够介导远红荧光蛋白报告基因mKate2对人肝癌细胞株HepG2的高效标记,并且mKate2标记的HepG2能够进行体外细胞荧光成像,可以用于下一步的活体肿瘤示踪研究.

Abstract：

Objeclive To create far-red fluorescence protein reporter gene mKate2 lentivirus.label human liver cancer cell line HepG2 with lentivirus and explore the feasibility of in vitro fluorescence imaging of labeled tumor cells so as to provide experimental rationales for in vivo fluorescence tumor imaging.Methods mKate2 gene was amplified from pmKate2-N plasmid.Then the fragment was inserted into the lentivirus expression vector pLenti6.3/V5-DEST.The expression plasmids pLenti6.3-mKate2 and the packaging plasmids were cotransfected into 293T cells.The biological titer of lentivirus was determined.HepG2 cells were infected with mKate2 lentivirus at a MOI(virus multiplicitv of infeetion)of 6 for 96 hours.The infection efficiency was assayed through fluorescence microscope and fluorescent-activated cell scanning(FACS).And 2×106 mKate2-HepG2 cells were collected for fluorescence imaging through an optical imaging system.And the optimal imaging parameters were determined.Results DNA sequencing analysis confirmed that mKate2 gene sequence was correct and there was no mutation or deletion.The biological titer of produced mKate2 lentivims was 1.6×106 TU/ml.At 96 hours after mKate2 lentivirus infection,fluorescence microscope showed that mKate2 was expressed in a large percentage of cells.FACS assay showed that the mKate2 positive rate was 93.8%±0.4%.Excitation light 530±15 nm and emission light 710±28 nm were the optimal imaging parameters for mKate2-HepG2 cells.Conclusion Lentivirus can mediate efficiently the mKate2 reporter gene labeling of human liver cancer cell line HepG2.The mKate2-labeled HepG2 cells can be detected through in vitro fluorescence imaging.Further tracing studies of in vivo tumor fluorescence imaging age technically feasible.     

臭氧溶液对HBV体外感染的HepG2细胞的抗病毒作用

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)体外感染人肝癌HepG2细胞的实验模型,并研究臭氧溶液对感染了HBV后的HepG2细胞的抗病毒作用。方法:乙肝阳性血清与HepG2细胞共孵育建立体外感染模型,采用倒置相差显微镜检测细胞形态,MTT法检测细胞成活率,ELISA法检测HBsAg和HBeAg表达水平,HBV荧光定量PCR检测HBV DNA表达量。结果:体外感染了HBV DNA的HepG2细胞能持续稳定分泌HBsAg和HBeAg,并能产生HBV DNA,通过低浓度臭氧溶液作用后,细胞形态无明显差异,细胞成活率无明显影响(P>0.05),HBsAg和HBeAg均转阴(P<0.01),HBV DNA拷贝量亦明显降低(P<0.01)。结论:较低浓度臭氧溶液对感染了HBV的HepG2细胞有明显的抗病毒作用,对细胞并无损伤。     

儿茶素抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡作用研究

目的观察表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对肝癌HepG2细胞Cyclin D1,Bcl-2表达的影响,探讨EGCG抗肿瘤的作用机制。方法采用MTT法观察EGCG对肝癌细胞HepG2增殖的影响,免疫细胞化学法、Western blot法分别检测EGCG作用后Cyclin D1,Bcl-2的表达。结果 EGCG呈浓度依赖性抑制肝癌HepG2细胞增殖(P<0.05),免疫细胞化学和Western blot的结果均显示EGCG作用后Cyclin D1和Bcl-2的表达下调。结论 EGCG可能通过下调Cyclin D1,Bcl-2的表达,抑制HepG2细胞增殖的同时诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤的作用。     

VBE-3对肝癌HepG2细胞生长的影响

目的:观察黄荆子木脂素VBE-3抑制人肝癌HepG2细胞生长作用。方法:体外培养HepG2细胞和人胚肝L-02细胞,MTT比色法测定细胞活性,细胞计数法检测细胞生长。结果:VBE-3选择性抑制HepG2细胞活性,呈浓度依赖性;同时选择性抑制HepG2细胞生长,呈时间依赖性。结论:VBE-3具有选择性抑制HepG2细胞生长作用。     

丁型肝炎病毒复制包装载体的构建

目的  构建一种可以实现丁型肝炎病毒（HDV）复制包装的HDV转座子载体。方法  采用分子克隆方法构建含HDV复制子和乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）表达框的转座子（PB）载体PB126I3,将构建好的载体转染HuH-7细胞,转染48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,转染48 h后收集细胞上清用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HBsAg的表达,质粒转染细胞8.5 d后提取病毒用逆转录荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测HDV核糖核酸（RNA）的含量;同时细胞上清病毒浓缩后感染HBV受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白（Na+/NTCP）稳定转染的HepG2.N9细胞系并于感染后第7天用免疫荧光检测细胞内HDVδ抗原的表达。结果  HDV复制包装载体PB126I3瞬时转染HuH-7后细胞上清可检测到HBsAg的表达和较高滴度的HDV颗粒,并且该病毒颗粒感染HepG2.N9细胞7 d后细胞内可检测到HDVδ抗原。结论  HDV复制包装转座子载体构建成功,为未来HDV的大规模复制包装以及尝试建立HDV稳定转染细胞系提供前期基础。

     

丙型肝炎病毒核心蛋白抑制shRNA介导的RNA干扰作用

目的研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。方法构建丙型肝炎病毒不同蛋白质的真核表达质粒,加入萤火虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,共转染HeLa细胞,检测萤火虫荧光素酶活性以观察RNA干扰效果的变化,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子。在针对内源性GFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用。利用共转染方法观察该蛋白抑制RNA干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用。结果加入核心蛋白后,萤火虫荧光素酶活性恢复到80%,与空白对照比较有显著性差异(P<0.05)。在绿色荧光蛋白RNA干扰体系中,核心蛋白使绿色荧光蛋白的表达强度明显增加。该种对抗RNA干扰的作用在HepG2、HEK293和HeLa细胞中均存在,且呈剂量依赖关系。在siRNA介导的RNA干扰体系中,加入核心蛋白后萤火虫荧光素酶活性无显著性变化(P>0.05)。结论核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性。核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病机制中发挥重要作用。     

CHFR基因在人肝癌HepG2细胞中的表达与作用

目的:研究CHFR基因在人肝癌细胞株HepG2中的表达,以及CHFR基因甲基化对HepG2细胞生长与集落形成的影响。方法:采用去甲基化剂5-氮-2-脱氧胞苷处理人肝癌细胞株HepG2,半定量RT-PCR检测CHFR在HepG2细胞中的表达变化,CCK法和平板集落形成试验分析HepG2细胞生长增殖情况的改变。结果:CHFR在HepG2细胞中表达缺失;经Aza去甲基化处理后,CHFR在HepG2细胞中逐渐恢复表达,肿瘤细胞抑制率和集落形成抑制率都逐渐增高,均存在剂量-反应关系;且CHFR表达水平与HepG2细胞抑制率、集落形成抑制率均呈正相关。结论:CHFR对于肝癌细胞的生长增殖能力发挥负向调控作用。