雷帕霉素通过激活LC3介导的细胞自噬改善ApoE4/5×FAD小鼠的认知功能

目的:探讨表达不同人载脂蛋白E(ApoE)亚型的5个家族性阿尔茨海默病(FAD)突变基因(5×FAD)转基因小鼠(EFAD小鼠)的海马组织细胞自噬功能是否存在差异,以及雷帕霉素能否通过增强细胞自噬减少β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积而改善EFAD小鼠的认知功能。方法:6月龄ApoE3/5×FAD(E3FAD)小鼠和ApoE4/5×FAD(E4FAD)小鼠每日给予雷帕霉素(1 mg/kg)灌胃,持续6周,给药结束后通过Morris水迷宫检测小鼠的学习记忆能力,透射电镜观察各组自噬体超微结构特点,免疫组织化学染色法观察脑内淀粉样斑块沉积情况,Western blot方法检测海马内自噬相关蛋白p-mTOR和LC3-II的表达,ELISA法测定海马组织可溶性和不溶性Aβ1-42水平。结果:与溶媒组E3FAD小鼠相比,溶媒组E4FAD小鼠Morris水迷宫训练潜伏期延长(P0.05),探索实验时穿越平台次数少(P0.05),距离平台平均距离更长(P0.05)。雷帕霉素干预可改善E3FAD和E4FAD小鼠的认知功能,降低2组小鼠海马组织可溶性Aβ1-42水平和E4FAD小鼠海马组织不溶性Aβ1-42水平(P0.05),缩小了E3FAD和E4FAD小鼠之间的认知差距(P0.01)。同时,溶媒组E4FAD小鼠马组织自噬标志物LC3-II表达比E3FAD小鼠低(P0.05),雷帕霉素可降低E3FAD和E4FAD小鼠海马组织p-mTOR水平(在E4FAD小鼠中作用更为明显)、升高LC3-II表达、增强细胞自噬功能(P0.05)。结论:ApoE4加重了5×FAD转基因小鼠的认知功能障碍,增加了脑内Aβ沉积和细胞自噬。雷帕霉素通过抑制mTOR、激活LC3介导的自噬减轻Aβ沉积,从而改善EFAD小鼠的认知功能。     

右美托咪啶通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍

目的 探究右美托咪啶通过PINK1/Parkin信号通路调控线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍的分子机制。方法 SPF级SD大鼠随机分为假手术组、模型组、右美托咪啶(40μg/kg)组、自噬抑制剂三甲基腺嘌呤(3-MA,100 mmol/L)组、右美托咪啶+3-MA组,每组8只。旷场和水迷宫实验检测大鼠认知能力;TUNEL染色检测大鼠海马神经元凋亡情况;透射电镜观察大鼠海马神经元自噬情况;Western blot检测各组大鼠脑组织PTEN诱导激酶1(PINK1)/帕金森病蛋白(Parkin)、自噬效应蛋白Beclin 1、微管轻链蛋白3B(LC3Ⅱ/Ⅰ)、线粒体自噬受体p62(p62)蛋白表达。结果 右美托咪啶显著改善老年大鼠术后认知功能,抑制神经元凋亡,改善线粒体结构,减少自噬小体数量,升高大鼠脑组织PINK1、Parkin、Beclin 1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达水平,降低p62蛋白表达水平。而右美托咪定的上述改善作用均被3-MA减轻或抑制。结论 右美托咪啶通过激活PINK1/Parkin信号通路增强线粒体自噬改善老年大鼠术后认知功能障碍。     

自噬水平变化对心脏骤停心肺复苏后大鼠海马神经元凋亡的影响

目的探讨自噬水平变化对心脏骤停心肺复苏(CA/CPR)后大鼠海马神经元凋亡的影响。方法将40只大鼠随机分为假手术组(sham)、CA/CPR模型组(model)、雷帕霉素(Rapa)组(CA/CPR+Rapa)及3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(CA/CPR+3-MA)。采用呼气末夹闭气管窒息法复制大鼠CA/CPR动物模型,分别给予自噬激动剂Rapa 0.2 mg/kg及自噬抑制剂3-MA 10 mg/kg进行干预。采用神经功能缺陷评分(NDS)评价CA/CPR大鼠神经功能;用TUNEL染色法检测大鼠海马神经元的凋亡变化;用RT-PCR和Western blotting法检测大鼠海马内微管蛋白轻链3(LC3)、Beclin-1、Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA和蛋白的表达水平。结果与假手术组比较,CA/CPR模型组大鼠NDS评分明显降低;海马神经元TUNEL染色阳性细胞数明显增多,凋亡率显著升高;海马内LC3、Beclin-1、Caspase-3、Bax表达上调,Bcl-2表达下调(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,CA/CPR+Rapa大鼠NDS评分明显降低,而海马神经元凋亡率明显有所增加,海马内LC3、Beclin-1、Caspase-3、Bax表达明显上调,而Bcl-2表达则明显有所下降;CA/CPR+3-MA大鼠NDS评分明显升高,而海马神经元凋亡率下降,海马内LC3、Beclin-1、Caspase-3、Bax表达明显下调,而Bcl-2表达则有所升高(P<0.05,P<0.01)。结论 CA/CPR后自噬水平升高促进海马神经元凋亡,自噬水平降低抑制海马神经凋亡,两者相互作用共同参与CA/CPR的病理过程。     

激活α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAchR)增加小鼠海马组织M2型小胶质细胞数量并减轻脓毒症脑病

目的检测α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nAchR)对M2型小胶质细胞的影响,探索其减轻脓毒症脑病(SAE)的机制。方法采用盲肠结扎穿刺术(CLP)于2月龄雄性C57BL/6小鼠构建SAE模型,比较两组小鼠学习记忆能力的改变。采用Western blot法检测海马组织中α7nAchR的表达变化。给予腹腔注射α7nAchR的激动剂二甲氧基苯亚胺基假木贼碱(GTS-21),观察给予激动剂后海马组织中α7nAchR的表达变化,同时探索GTS-21是否能减轻SAE小鼠的学习记忆障碍。通过免疫荧光细胞化学染色法检测精氨酸酶1(ARG1)、离子钙结合接头蛋白1(Iba-1)的表达确定SAE小鼠M2型小胶质细胞数量的变化,以及GTS-21对M2型小胶质细胞数量的影响。结果 SAE小鼠的新物体识别及恐惧记忆能力显著下降,小鼠海马组织中α7nAchR表达显著降低。GTS-21可改善SAE小鼠的学习记忆障碍,增加脑组织中α7nAchR的表达。同时,脓毒症小鼠海马组织中M2型小胶质细胞显著减少,而GTS-21可显著增加M2型小胶质细胞的数量。结论 SAE小鼠海马组织中α7nAchR表达降低,使抑制炎症反应的M2型小胶质细胞减少, GTS-21可显著增加M2型小胶质细胞数量,减轻SAE小鼠的学习记忆障碍。     

大麻素受体激动剂花生四烯酰氯乙胺(ACEA)通过抑制炎症反应改善小鼠脓毒症相关性脑病

目的 探讨大麻素受体激动剂花生四烯酰氯乙胺(ACEA)对脓毒症相关性脑病(SAE)小鼠认知功能的影响。方法C57BL/6小鼠随机分成人工脑脊液(ACSF)组和脂多糖(LPS)组,通过采用LPS侧脑室注射构建SAE模型,小鼠脓毒症严重程度评分(MSS)和体质量变化判断小鼠的基本情况;行为学范式评估小鼠运动能力(旷场实验)、认知功能(情景前置性条件恐惧实验、 Y迷宫实验)。评估ACEA干预效果中,小鼠随机分为ACSF组、 ACEA干预的ACSF组、 LPS组和ACEA干预的LPS组,ACEA干预组给与1.5 mg/kg ACEA,实时定量PCR检测小鼠海马组织白细胞介素1β(IL-1β)、 IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA表达水平;Western blot法检测小鼠海马组织IL-6、 TNF-α的蛋白表达水平;尼氏染色检测小鼠海马CA1区神经元损伤情况;行为学范式评估小鼠运动能力(旷场实验)、认知功能(情景前置性条件恐惧实验、 Y迷宫实验)。结果 侧脑室注射LPS 3 d后,小鼠存在显著认知功能障碍,证实SAE造模成功。与ACSF组相比,LPS组海马炎症因子IL-6、 TN...     

创伤后应激障碍大鼠海马神经元自噬增强

目的:观察创伤后应激障碍(PTSD)模型大鼠海马神经元自噬的改变,探讨PTSD致海马体积异常的可能机制。方法:成年健康雄性SD大鼠20只,随机被分为对照组和模型组。采用改良的单一连续应激后给予不可逃避足底电击方法制备PTSD大鼠模型;采用透射电镜技术观察海马神经元超微结构,Western blot方法检测海马微管相关蛋白轻链3(microtube-associated protein 1 light chain 3,LC-3)和Beclin-1的表达水平。结果:模型组海马神经元自噬体增多;海马组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin-1表达水平高于对照组(P<0.05)。结论:PTSD模型大鼠海马神经元存在明显的细胞自噬,可能与海马体积异常变化有关。     

白细胞介素10 通过抑制自噬调节树突状细胞功能

目的:研究白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)对树突状细胞(Dendritic cells,DCs)自噬及功能的影响。方法:体外培养C57BL/6 小鼠骨髓来源的DCs 分为对照组、LPS 刺激组、IL-10 干预组、IL-10 与雷帕霉素干预组、雷帕霉素干预组,分别通过流式细胞术分析DCs 表面共刺激分子CD40、CD80 的表达、DCs 摄取OVA 抗原的比例以及诱导OT2 细胞增殖比例,ELISA 检测DCs 分泌IL-6,TNF-β的水平等DCs 相关功能;蛋白免疫印迹法检测DCs 自噬蛋白LC3 的表达,比较组间差异,以探讨IL-10 对DCs 功能及自噬的影响。结果:(1)与LPS 刺激组比较,IL-10 处理组DCs 的表面共刺激分子CD40、CD80的表达下降、分泌IL-6、TNF-β水平下降、刺激T 细胞增殖的比例明显减弱、摄取OVA 抗原的能力增加,IL-10+雷帕霉素干预组的DCs 与IL-10 单独处理组相比,表面CD80 的表达明显增加(P<0.05)、分泌IL-6、TNF-β能力及刺激T 细胞增殖的能力均明显增加(P<0.000 1)。(2)DCs 的自噬相关蛋白(LC3 / LC3 比例)明显下降。结论:IL-10 可能通过抑制DCs 自噬水平调节树突状细胞功能。     

芫根对脓毒症小鼠认知功能障碍的保护作用及机制初探#

目的:初步探究芫根对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导脓毒症小鼠认知功能障碍的保护作用及机制.方法:选取21只KM小鼠根据体重随机分为对照组(n=4)、模型组(n=8)以及治疗组(n=9),治疗组预防性给予芫根提取液灌胃7 d、14 d后腹腔注射LPS10 mg?kg-1构建脓毒症小鼠模型.LPS注射7 d后采用旷场实验评价小鼠焦虑情绪,通过HE染色评价海马神经元损伤情况,以Western Blot检测全脑RACK1、HIF-1α 蛋白表达水平.结果:模型组小鼠角落区域停留时间及总静止时间增加,而中央及四周停留时间缩短,HE结果显示海马神经元明显出现核固缩,同时,脑RACK1蛋白水平明显降低(P<0.05)而HIF-1α表达有所升高;芫根提取液灌胃后,相对于模型组,小鼠四周及中央区域的停留时间明显增加(P<0.05),角落停留时间及总静止时间明显降低(P<0.05),海马神经元核固缩明显减少,同时脑RACK1蛋白水平升高,HIF-1α 表达降低.结论:芫根对脓毒症小鼠认知功能障碍具有一定的改善作用,其机制可能与调控RACK1/HIF-1α、保护海马神经元有关.     

卡络磺钠通过抑制parkin介导的线粒体自噬减轻脓毒症大鼠的肺损伤

目的:探讨卡络磺钠是否通过抑制线粒体自噬来减轻脓毒症大鼠的急性肺损伤。方法:将雄性Wistar大鼠随机分为5组:假手术组、脓毒症组及卡络磺钠低剂量(8 mg/kg)组、中剂量(40 mg/kg)组和高剂量(80mg/kg)组,每组23只大鼠。采用盲肠结扎穿孔(CLP)法建立脓毒症模型后,腹腔注射不同剂量的卡络磺钠。绘制大鼠生存曲线(每组15只大鼠)。CLP术后24 h,行肺部Micro-CT检查;检测肺毛细血管通透性;HE染色观察肺组织病理变化;免疫荧光观察肺组织凋亡及线粒体自噬改变;Western blot方法测定大鼠肺组织中parkin和自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达,并计算LC3-II/LC3-I比值。结果:与脓毒症组相比,卡络磺钠组大鼠的生存率升高,肺血管通透性下降(P0.05)。肺影像学和肺组织HE染色显示,脓毒症组大鼠肺部病变和损伤更重,而卡络磺钠组大鼠肺病变和损伤程度减轻(P0.05)。免疫荧光结果显示,脓毒症大鼠肺组织凋亡增加(P0.01),LC3与Tom20、parkin与Tom20的共定位荧光增强,而卡络磺钠组大鼠肺组织凋亡减少,LC3与Tom20、parkin与Tom20的共定位荧光减弱。Western blot结果显示,与假手术组相比,脓毒症组大鼠肺组织中parkin的表达增多,LC3-II/LC3-I比值升高(P0.05),而卡络磺钠组大鼠肺组织中parkin表达减少,LC3-II/LC3-I比值降低(P0.05)。结论:卡络磺钠可以减轻脓毒症大鼠的急性肺损伤,其作用机制与抑制parkin介导的线粒体自噬过度激活有关。     

自噬激活如何影响大鼠内皮祖细胞凋亡、增殖和周期的变化?

背景:曾有报道雷帕霉素可以对内皮祖细胞的增殖能力、迁移能力、黏附能力产生影响,但是没有提到自噬在其中所起到的不可忽视的作用,以及自噬与凋亡之间的相互关系。目的:通过雷帕霉素激活自噬探讨自噬激活对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡和周期的影响。方法:采用密度梯度离心法从骨髓获得单个核细胞,将其接种在人纤维连接蛋白包被的培养板上,培养7 d后收集贴壁细胞,即内皮祖细胞。加入不同质量浓度雷帕霉素(0.01,0.1,1,10μg/L)分别培养24 h。Western blot检测LC3-Ⅱ蛋白表达监测自噬的诱导情况,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期进程的变化,MTT比色法观察其增殖能力的变化,同时在透射电镜下观察其超微结构的变化。结果与结论:雷帕霉素质量浓度为0.01μg/L时,内皮祖细胞的LC3-Ⅱ蛋白表达与对照组相比并没有明显的增高,当质量浓度为0.1μg/L时LC3-Ⅱ蛋白表达处在一个较高的水平,质量浓度为1μg/L和10μg/L时LC3-Ⅱ蛋白表达虽然也高于对照组,但却明显低于0.1μg/L时,据此推断雷帕霉素在质量浓度为0.1μg/L时自噬尤为活跃。内皮祖细胞的凋亡率呈现随着雷帕霉素质量浓度的升高而增加的趋势,增殖率呈现随雷帕霉质量浓度增加而降低的趋势。结果说明雷帕霉素激活自噬后能够促进细胞的凋亡,明显改变细胞的周期进程,抑制内皮祖细胞的增殖。     

辛伐他汀对实验性脑出血大鼠海马神经细胞自噬的影响

目的:观察辛伐他汀治疗对实验性脑出血大鼠海马区神经细胞自噬激活的调控作用。方法:将72只健康成年SD大鼠随机分三组(n=24):假手术组(Sham组)、脑出血组(ICH组)、辛伐他汀组(SIM组)。应用胶原酶诱导法建立脑出血大鼠模型,术后动物完全苏醒后给予辛伐他汀灌胃(3 mg/kg)。采用Garcia法对各组大鼠进行神经功能行为学评分,干湿比重法测定脑组织的水含量;免疫组织化染色学方法检测各组大鼠海马自噬微管相关蛋白1轻链3(Microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达及分布;Westem blot法检测各组大鼠海马自噬基因Beclin-1表达。结果:与脑出血组相比,辛伐他汀治疗明显提高神经功能学评分(P0.05),减少脑组织含水量(P0.05),下调自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达(P0.05),抑制海马神经元自噬的激活。结论:辛伐他汀能够降低脑出血大鼠海马区神经细胞自噬的激活,进而减轻脑水肿,促进神经功能的恢复。     

脓毒症相关性脑病小鼠模型的建立及其认知功能障碍的初步研究

目的:建立脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)小鼠模型并对其认知功能障碍进行初步研究。方法:选取8～10周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠。第1部分实验将小鼠随机分为4组,即正常对照组,盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)1组和CLP2组(分别用7号和12号针头行小鼠腹腔CLP)和假手术组(小鼠仅开腹分离盲肠)。第2部分实验将小鼠随机分为3组,即正常对照组,假手术组和CLP组。采用Kaplan-Meier法分析小鼠术后存活率;神经行为学评分评价小鼠的神经行为变化;Morris水迷宫实验和避暗实验检测小鼠的认知记忆功能变化;爬杆实验和悬挂实验测试小鼠的运动协调性;ELISA法检测小鼠血清前列腺素E_2(prostaglandin E_2, PGE_2)水平变化。结果:第1部分实验中,CLP术后小鼠出现明显嗜睡、竖毛、寒颤和厌食等症状,CLP1组和CLP2组小鼠48 h死亡率分别为20%和30%。两部分实验中行小鼠腹腔盲肠结扎穿孔术组小鼠神经行为学评分均显著低于对照组和假手术组(P0.01);Morris水迷宫中逃避潜伏期时间均显著延长(P0.01),目标象限停留时间和穿越平台次数减少(P0.01);悬挂实验和爬杆实验中评分均出现显著降低(P0.01);在避暗实验开始后大部分小鼠活动量显著减小甚至未曾进入暗室(P0.05)。第2部分实验中,CLP术后小鼠血清中PGE_2释放量显著增加(P0.01)。结论:通过12号针行盲肠结扎穿孔术可成功建立稳定的脓毒症相关性脑病小鼠模型,用此法建立的SAE小鼠模型存在学习记忆认知功能障碍。     

自噬在乙二醇诱导的大鼠肾内晶体形成中的调控作用

目的:探讨自噬在乙二醇诱导的大鼠肾内晶体形成中的调控作用。方法:健康雄性SPF级SD大鼠40只,分为正常对照组、结石模型组、N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理组(0.75%乙二醇+NAC)、雷帕霉素处理组(0.75%乙二醇+雷帕霉素)和氯喹处理组(0.75%乙二醇+氯喹),每组8只。干预4周后,应用Western blot和免疫组化检测各组肾脏组织中自噬关键蛋白LC3-II的表达水平;透射电镜观察各组肾组织中自噬泡的数量;应用试剂盒检测各组24 h尿液中总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的水平;全自动生化仪检测各组血清肌酐及尿素氮的水平;ELISA法检测各组24 h尿液中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和肾损伤分子1(Kim-1)的水平。钙盐染色法观测各组肾脏晶体的沉积情况,评价肾组织的病理学变化。结果:与结石模型组相比,雷帕霉素处理组和氯喹处理组中LC3-II的表达水平和自噬泡数量均增加,而在NAC处理组中LC3-II的表达水平和自噬泡数量均减少(P0.05)。与结石组相比,雷帕霉素处理组中T-SOD和GSH-Px水平降低,而氯喹处理组和NAC处理组中T-SOD和GSH-Px的活性增加(P0.05)。与正常组相比,结石组中血清肌酐、尿素氮、NGAL和Kim-1的水平及肾脏内晶体沉积增加(P0.05);在雷帕霉素处理组中肾脏损伤进一步加重,晶体沉积进一步增加,而在氯喹处理组和NAC处理组中肾脏损伤明显减轻,晶体的沉积明显减少。结论:乙二醇激活自噬后可以促进大鼠肾内晶体的形成。应用抗氧化剂和自噬抑制剂不仅可以降低肾脏内的自噬水平,还可以减轻肾脏损伤,减少晶体沉积,降低肾结石的形成率。     

Wortmannin通过抑制癫痫大鼠海马自噬活性发挥神经保护作用

目的:探讨癫痫大鼠海马自噬活性的变化及自噬抑制剂wortmannin(WM)对致痫大鼠海马神经元的保护作用。方法:实验大鼠分为对照组、致痫2 h、8 h、16 h、24 h、72 h组和WM干预组。应用HE染色和Nissl染色观察癫痫大鼠海马神经元损伤的变化。免疫印迹检测海马组织微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ的比值作为自噬活性的指标。结果:LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值在大鼠癫痫发作2 h时开始升高,24 h达到高峰,持续升高至少72 h。致痫24 h时海马CA1区出现明显神经元损伤和丢失。WM干预组CA1区存活神经元数目(100.88±18.73)显著高于癫痫组(70.16±5.09)(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值低于癫痫组(P0.05)。结论:癫痫发作导致的海马损伤时存在自噬激活现象;WM通过抑制自噬活性减轻癫痫发作所致的海马损伤,具有神经保护作用。     

mir-325-3p激活RIPK3/TFEB信号通路减轻脑出血大鼠神经元损伤

目的 探讨mir-325-3p通过调控RIPK3/TFEB通路对脑出血大鼠神经元损伤的影响。方法雄性SD大鼠随机分为假手术组、脑出血组、agomir NC组、agomir-325-3p组、GSK872(RIPK3抑制剂)组、agomir-325-3p+GSK872组,每组18只。评估大鼠运动功能、肢体协调能力、改良神经功能缺损评分（mNSS）,测定大鼠脑含水量、血肿周围脑组织病理变化、神经细胞凋亡、神经元自噬、LC3与NeuN共定位、海马组织RIPK3/TFEB信号通路、自噬相关蛋白表达。结果 与假手术组相比,脑出血组CA1区神经元肿胀,排列疏松,可见大量溶酶体和自噬小体,前肢放置成功率、左侧转身百分比、TFEB下降（P<0.05）,mNSS评分、脑含水量、神经细胞凋亡率、RIPK3、Beclin-1和LC3-II/LC3-Ⅰ、LC3/NeuN强阳性个数升高（P<0.05）;agomir-325-3p、GSK872可减轻大鼠海马神经元损伤,增强自噬,且两者有协同作用。结论mir-325-3p过表达可通过调控RIPK3/TFEB促进自噬,减轻脑出血大鼠神经元损伤。     

雷帕霉素激活自噬改善嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞损伤

目的:通过观察雷帕霉素对PAN 诱导的足细胞损伤及自噬相关蛋白表达的影响,探讨自噬在雷帕霉素保护PAN 诱导的足细胞损伤中的作用及可能机制。方法:构建PAN 诱导的足细胞损伤模型,将足细胞分成对照组(Control 组),PAN 组(加入50 μg/ ml PAN),雷帕霉素组(RAP 组:分别加入100、200、300 ng/ ml 雷帕霉素),PAN+雷帕霉素组(PAN+RAP组:细胞在用含PAN 的培养液培养前1 h,分别用100、200、300 ng/ ml 雷帕霉素进行预处理1 h)。采用Annexin V/ PI 双染法检测细胞凋亡,透射电镜观察自噬小体,Western blot 检测LC3、p62、4EBP1、P70S6K、mTOR 蛋白表达。结果:与对照组比较,PAN组足细胞凋亡增加,自噬体减少,LC3域蛋白表达下调,p62 上调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平上调;与PAN 组比较,PAN+RAP 组足细胞凋亡率下降,自噬体增加,LC3域蛋白表达上调,p62 下调,mTOR、4EBP1、P70S6K 磷酸化水平下调。结论:PAN 可以抑制足细胞自噬,促进足细胞凋亡;雷帕霉素可通过激活自噬改善PAN 诱导的足细胞损伤,这种作用可能与雷帕霉素抑制mTOR/4EBP1、P70S6K 信号通路有关。     

氯化锂通过调节自噬通路促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:研究氯化锂(Li Cl)对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)神经分化的影响,并探讨自噬通路在其中的作用。方法:体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,细胞分为Li Cl组和对照组,采用β-巯基乙醇诱导MSCs向神经细胞分化,免疫荧光法和Western blot法检测诱导后神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶(NSE)和微管相关蛋白2(MAP-2)以及自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达变化。进一步采用自噬激活剂雷帕霉素(rapamycin)及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预自噬,Western blot法观察NSE和MAP-2的表达变化。结果:诱导分化后,Li Cl组及对照组细胞均有NSE和MAP-2表达,Li Cl组细胞NSE和MAP-2蛋白阳性表达率及表达量均大于对照组(P0.05);此外,Li Cl组细胞LC3阳性荧光点以及LC3-Ⅱ表达量亦多于对照组(P0.05)。加用雷帕霉素可进一步促进Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05),而3-MA则抑制Li Cl处理的细胞NSE和MAP-2蛋白的表达(P0.05)。结论:氯化锂可能通过调节自噬通路促进大鼠骨髓骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。     

结核分枝杆菌Hsp16.3蛋白影响小鼠巨噬细胞自噬形成的实验研究

目的:观察热休克蛋白Hsp16.3对感染结核分枝杆菌(MTB)的巨噬细胞自噬体形成的作用.方法:以50 ng/μL雷帕霉素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体形成后,用结核分枝杆菌毒株H37Rv感染巨噬细胞,再用Hsp16.3蛋白作用于巨噬细胞,电镜观察自噬体相成的变化,抗酸染色观察胞内细菌形态,计数MTB的菌落数.提取巨噬细胞总蛋白,Western blot方法检测自噬相关蛋白LC3表达水平的变化.结果:雷帕霉素诱导巨噬细胞形成自噬后感染结核分枝杆菌可使胞内细菌局限化,加入Hsp16.3蛋白可明显抑制了自噬体的形成,影响了结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存,显著增加了细菌的菌落形成单位,降低了自噬相关蛋白LC3的表达(P＜0.05).结论:Hsp16.3蛋白可能通过调节Atg8的表达水平抑制自噬体的形成.     

细胞自噬缓解氧-糖剥夺诱导原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤

目的 在离体细胞水平,探讨氧-糖剥夺(OGD)致原代培养小鼠脑皮质神经元缺血损伤过程中,细胞自噬的变化情况和可能作用.方法 出生24h内C57BL/6J乳鼠脑皮质神经元原代培养7d后,分为常氧(Nor.)、15、30、60、90和120 min OGD后24h复糖复氧等6组,每组n=6;免疫印迹(Western blot)法检测细胞自噬相关蛋白Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值;借助MTT比色法和乳酸脱氢酶(LDH)漏出率,检测神经元的损伤;用细胞自噬下游抑制剂巴弗洛霉素A1(BafA1 100 nmol/L)抑制自噬后,观察神经元的损伤.结果 与对照组相比,随OGD时间的延长,自噬相关蛋白Beclin-1表达水平和LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高,30 min达到峰值,之后略有回降(P＜0.05);在OGD处理30和60 min致使神经元显著损伤的基础上,细胞自噬抑制剂BafA1可明显加重60 min OGD处理神经元的损伤和提高LC3Ⅱ/Ⅰ的比值(P＜0.05).结论 OGD可诱发原代培养小鼠脑皮质神经元自噬发生,且细胞自噬可缓解OGD处理皮质神经元的缺血损伤.     

红景天苷对缺氧缺血性脑损伤大鼠海马神经元自噬的影响

目的:探讨红景天苷(Sal)对缺氧-缺血(H/I)大鼠海马神经元自噬的影响。方法:36只成年雄性SD大鼠分为假手术组(Sham)、H/I组(H/I)、H/I联合Sal治疗组(H/I+Sal),利用双侧颈总动脉结扎及低氧处理制备H/I模型,通过腹腔注射给予大鼠Sal治疗3 d,Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力,TUNEL染色检测海马神经元凋亡,Western Blot检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)的表达。结果:与sham组相比,H/I大鼠学习记忆能力受损明显(P 0. 05),海马细胞凋亡增加明显(P 0. 05),LC3-II/LC3-I比值增加(P 0. 05);经过Sal治疗后,与H/I大鼠相比,Sal治疗组大鼠学习记忆功能得到明显改善(P 0. 05),凋亡细胞减少(P 0. 05),LC3-II/LC3-I比值降低(P 0. 05)。结论:Sal能够通过抑制H/I模型大鼠海马神经元自噬减轻凋亡,发挥神经保护作用。