结核分枝杆菌Rv0901基因重组耻垢分枝杆菌的构建及其细胞作用

目的对结核分枝杆菌Rv0901基因的功能进行研究。方法以PCR扩增Rv0901基因编码序列,定向克隆人穿梭表达质粒pMV261获得重组穿梭表达质粒,将重组质粒电穿孔进入耻垢分枝杆菌,构建重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,对重组耻垢分枝杆菌进行诱导表达,用SDS-PAGE检测表达结果。比较耻垢分枝杆菌和重组耻垢分枝杆菌对THP-1细胞的不同作用。结果成功构建重组穿梭表达质粒及重组Rv0901基因的耻垢分枝杆菌,重组菌诱导THP-1细胞的凋亡率高于耻垢分枝杆菌,其感染THP-1细胞后细胞的存活率低于耻垢分枝杆菌的感染,重组菌感染THP-1细胞后细胞培养液中NO(一氧化氮)的产生高于耻垢分枝杆菌的感染。结论Rv0901基因可能与结核毒力存在一定关系。     

表达绿色荧光蛋白的重组耻垢分枝杆菌的构建

目的 建立可表达绿色荧光蛋白的耻垢分枝杆菌,便于对耻垢分枝杆菌进行直观检测和快速定量.方法 利用PCR技术从真核表达质粒pLVTH扩增获得绿色荧光蛋白的编码基因,克隆入大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,建立重组质粒pMVGFP,并经酶切鉴定证实.利用电穿孔技术将pMVGFP转化入耻垢分枝杆菌,利用卡那霉素抗性筛...     

结核杆菌CFP-10/ESAT-6融合基因在耻垢分枝杆菌中的表达及其抗原性的初步研究

目的构建表达结核分枝杆菌CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌,并观察其对巨噬细胞的作用。方法采用SOE法构建CFP-10／ESAT-6融合基因,克隆人大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261中,将重组质粒电转化耻垢分枝杆菌,SDS-PAGE检测CFP-10／ESAT-6融合蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达。以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞一氧化氮合成酶的表达水平。结果经DNA测序证实CFP-10／ESAT-6融合基因序列正确。重组耻垢分枝杆菌经热诱导后可以表达相对分子质量(Mr)约为18×103的融合蛋白,与预期值一致。重组耻垢分枝杆菌能够诱导小鼠巨噬细胞表达一氧化氮合成酶。结论表达CFP-10／ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌构建成功,该重组耻垢分枝杆菌能够活化巨噬细胞,具有抗原性,为研制结核疫苗提供一定参考。     

机械牵张诱导THP-1细胞高迁移率族蛋白B1移位出核

目的: 探讨机械牵张对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)在THP-1细胞内移位的影响。方法: 构建HMGB1－增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的真核表达载体。通过两步亚克隆的方法,将HMGB1和EGFP的编码序列以融合蛋白的形式克隆到pcDNA3-HA载体上,随后转染THP-1细胞并施加机械牵张应变,荧光显微镜观察HMGB1在细胞内的表达及移位情况。 结果: 重组质粒经酶切鉴定证明构建正确,并在THP-1细胞中大量表达。荧光显微镜观察发现,HMGB1-EGFP融合蛋白主要分布于细胞核,经机械牵张18 h,可见细胞中融合蛋白从细胞核移位到细胞质,在细胞浆中观察到明显的绿色荧光。 结论: 成功构建了HMGB1-EGFP融合蛋白,在THP-1细胞中观察到机械牵张可诱导HMGB1移位出核。     

EGFP-pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的 构建表达增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的EGFP-pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定.方法 从pEGFP-N3质粒上切下EGFP片段,连接到pBABE载体,构建EGFP-pBABE重组质粒;将该重组质粒转染到PT67细胞后,荧光显微镜下观察EGFP的表达;收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达.结果 成功构建EGFP-pBABE重组质粒.该质粒转染PT67细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到EGFP的表达;用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36 h后,在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达.结论 成功构建表达EGFP的EGFP-pBABE逆转录病毒载体,为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础.     

重组质粒pEGFP-C1-STAT6的构建及在HeLa细胞中表达

目的 构建以增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)为报告基因的重组质粒pEGFP-C1-STAT6,观察其在HeLa细胞中的表达.方法 以重组质粒pCLNEO-STAT6为模板,PCR法扩增出目的 基因,将扩增片段双酶切后连接到质粒pEGFP-C1上,构建重组质粒pEGFP-C1-STAT6,脂质体法转染HeLa细胞,Western 印迹检测融合蛋白的表达,并在荧光显微镜下观察融合蛋白的定位和分布.结果 成功构建质粒pEGFP-C1-STAT6,并在HeLa细胞中实现表达;Western 印迹检测到融合蛋白EGFP-STAT6;在荧光显微镜下观察到绿色的融合蛋白表达和定位.结论 重组质粒pEGFP-C1-STAT6构建成功,可用于标记STAT6蛋白,为进一步研究STAT6在信号转导中的作用机制奠定基础.     

GFP／HBVX融合蛋白重组载体的构建及稳定表达细胞系的建立

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）与人乙型肝炎病毒（HBV）X基因的重组表达载体，建立稳定表达HBVX蛋白（HBx）与GFP融合蛋白的HepG2细胞系，以进一步研究HBx的生物学功能及其在肝癌发生中的作用。方法应用PCR法从adr亚型HBV质粒pHBVDNA中扩增HBVX基因片段，PCR产物经HindⅢ和KpnⅠ双酶切后定向插入绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1的相应酶切位点，转化宿主菌DH5α，采用上述双酶切及DNA测序鉴定重组质粒pGFP-HBx；采用脂质体转染法将pEGFP-C1质粒、pGFP-HBx重组质粒DNA转染人肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞，G418选择抗性细胞克隆，荧光显微镜下观察GFP表达，挑取表达GFP的抗性克隆扩大培养、传代。采用RT-PCR检测转染细胞HBVX基因的表达。结果经酶切及测序鉴定成功构建了GFP-HBVX重组表达载体pGFP-HBx；将pEGFP-C1、pGFP-HBx重组质粒转染HepG2．，经G418筛选15d获得抗性细胞克隆。将带绿色荧光的抗性克隆细胞扩大培养并经传代70次，细胞仍表达强的荧光蛋白。RT-PCR检测表明转染pGFP-HBx重组体的HepG2／GFP-HBx细胞有HBVX转录、表达。结论成功构建了GFP．HBVX真核重组表达载体pGrP-HBx；获得了稳定表达GFP-HBx融合蛋白的HepG2细胞系，这为进一步研究FIBx的生物学功能以及HBx在肝癌发生中的作用与机制打下了基础。     

结核分枝杆菌Ag85A蛋白的原核表达、纯化和免疫反应性

目的通过原核表达获得结核分枝杆菌Ag85A蛋白。方法用PCR从结核分枝杆菌H37Rv菌株中扩增出编码Ag85A的fbpA基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,产生重组质粒pPro85A后,转化至大肠杆菌感受态细胞BL21并诱导大量表达。用镍纯化系统纯化重组Ag85A蛋白,用不同分枝杆菌感染的小鼠血清通过ELISA确定其免疫反应性。利用PCR技术鉴定fbpA基因在不同分枝杆菌的分布。结果32 ku的Ag85A蛋白获得高效表达和纯化。表达Ag85A蛋白的fbpA基因在结核分枝杆菌H37Rv、H37Ra、BCG、草分枝杆菌、土地分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和次要分枝杆菌中均有表达,但在牝牛分枝杆菌中未表达。结核病患者和结核分枝杆菌毒株H37Rv感染小鼠血清所产生的抗Ag85A抗体滴度最高。结论重组Ag85A蛋白已成功表达纯化,并保留了免疫反应性。     

结核分枝杆菌EIS基因抑制人肺腺癌A549细胞自噬

 目的 构建结核分枝杆菌EIS基因表达质粒,探讨其对人肺腺癌A549细胞自噬的影响。方法 采用PCR技术扩增EIS基因片段并插入空载质粒pcDNA3.1-3flag中,双酶切、测序鉴定克隆质粒的正确性;将重组质粒与对照空载质粒分别与自噬体荧光表达质粒GFP-LC3共转染细胞并以自噬诱导剂雷帕霉素处理,荧光显微镜下观察自噬荧光并计数,Western blot检测EIS蛋白及自噬蛋白LC3II/I的表达水平。结果 成功构建EIS基因重组表达质粒PcDNA3.1-EIS-3flag,该质粒共转染细胞组自噬荧光小点较对照组明显减少（P<0.05）,重组质粒表达42ku看到蛋白并可抑制自噬蛋白表达水平。结论 结核分枝杆菌EIS基因可抑制A549细胞自噬的形成,其抑制作用与结核分枝杆菌持留性相关。     

分枝杆菌表达质粒的快速构建及ClpC2基因功能初步研究

目的通过一种不受到序列限制、酶切连接反应一步进行的分子克隆方法,构建分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,检测其在耻垢分枝杆菌中的蛋白表达并对其功能进行初步探讨。方法利用识别甲基化位点的内切酶Fsp EⅠ进行一步法酶切、连接反应,构建重组质粒PMV261(+)-Clp C2。将重组质粒转入耻垢分枝杆菌,利用SDS-PAGE和Western blot检测Clp C2基因在耻垢分枝杆菌中的表达以及氧化应激、酸应激对其功能进行初步探讨。结果利用Fsp EⅠ快速构建了分枝杆菌表达质粒Clp C2,将其成功电转至耻垢分枝杆菌中,SDS-PAGEA和Western blot检测其蛋白的表达,His单抗和兔多抗均能检测到目的条带,Mr大小27 570。氧化应激及酸应激实验表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌与空载耻垢分枝杆菌在对抗应激方面无明显差异。结论成功构建了一种不受序列限制的分子克隆方法以及分枝杆菌Clp C2重组表达质粒,Western blot表明其具有一定的免疫原性,氧化应激及酸应激表明Clp C2重组耻垢分枝杆菌对抗应激方面无明显改变,为进一步深入研究Clp C2基因的功能奠定了基础。     

SEDL基因及其突变体真核表达载体的构建与鉴定

目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。     

重组小鼠质粒pEGFP-NGB的构建和在培养神经胶质细胞中表达的实验研究

目的：构建重组小鼠质粒pEGFP-NGB并研究其在培养神经胶质细胞中的表达。方法：采用RT-PCR从小鼠脑组织总RNA中扩增出该基因的全序列cDNA,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体中,构建重组质粒pEGFP-NGB表达载体。采用GeneJamer转染试剂和pEGFP-NGB重组子混合后转染至培养神经胶质细胞中,观察NGB在培养神经胶质细胞中mRNA以及蛋白表达。结果：阳性克隆测序结果显示所测序列与Genbank序列一致。RT-PCR和Western-blot结果表明转染重组质粒pEGFP-NGB培养神经胶质细胞NGB mRNA和蛋白均有较高的表达。荧光显微镜下观察发现, 培养神经胶质细胞中有较多绿色荧光蛋白表达。结论：(1)成功构建pEGFP- NGB重组子;(2)构建的pEGFP-NGB重组子可在培养神经胶质细胞中表达。     

稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株的建立

目的建立能够稳定表达红色荧光蛋白-绿色荧光蛋白-微管相关蛋白轻链3(RFP-GFP-LC3)的小鼠RAW264.7巨噬细胞。方法构建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重组质粒载体,将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK293T细胞,收集病毒上清后感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,用荧光显微镜和流式细胞术分析感染效率。饥饿处理稳定感染细胞,荧光显微镜下观察RFP-GFP-LC3斑点。结果成功构建了慢病毒p LV-CMV-RFPGFP-LC3,经感染和嘌呤霉素筛选获得稳定表达RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7细胞;荧光显微镜和流式细胞术显示RFP和GFP荧光率均达到100%,饥饿处理后自噬斑点显著增多。结论成功建立稳定表达RFP-GFP-LC3的RAW264.7细胞株,为自噬研究建立了可靠细胞平台。     

重组双功能域补体受体Ⅰ型分子在Vero细胞中的稳定表达及其抑制补体活化的初步研究

构建包含人重组双功能域人补体受体Ⅰ与绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒,观察融合蛋白在非洲绿猴肾细胞(Vero)内表达并检测其抑制补体活化的能力。PCR方法扩增出重组双功能域CR1分子,限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ将重组分子连入真核表达载体pEGFP-N2中,构建出重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D,脂质体转染Vero细胞中。新霉素G418筛选出稳定表达细胞克隆,荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达。用Vero细胞和免疫小鼠获得的抗Vero细胞多克隆抗体激活补体后,通过检测乳酸脱氢酶的释放来分析重组蛋白抑制补体活化的功能。结果显示pEGFP-N2/CR1-2D质粒经酶切及测序分析证实载体构建正确。转染细胞后,荧光显微镜下观察到重组质粒pEGFP-N2/CR1-2D在Vero细胞中能够大量表达,G418筛选出了稳定表达细胞克隆,乳酸脱氢酶活性检测显示,与对照组相比CR1-2D能够显著的抑制补体的活化(P0.05),初步证实了其能够抑制补体的活化。     

鸡白细胞介素-2基因真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建鸡白细胞介素2(IL-2)真核重组表达质粒,体外鉴定其能否表达。方法:将鸡IL-2cDNA(RT-PCR法获得),克隆入真核高效表达质粒pcDNA3.1( )中,构建pcDNA-IL-2重组表达质粒。PCR和双酶切的方法鉴定克隆的正确性。然后构建pcDNA IL GFP重组表达质粒(即GFP基因与IL2的一段上游基因融合表达),PCR方法鉴定克隆的正确性。脂质体法转染COS1细胞,荧光显微镜下观察荧光。结果:正确构建了真核重组表达质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL-GFP。荧光显微镜下可观察到很强的绿色荧光。结论:鸡IL-2克隆和表达成功。为下一步用重组质粒pcDNA-IL2免疫BALB/c小鼠,研制鸡IL-2单克隆抗体奠定了基础。     

分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin真核表达载体的构建及杀菌试验

目的构建分枝杆菌噬菌体D29 LysinB/Holin融合蛋白真核表达载体, 通过细胞感染模型研究其在胞内对结核分枝杆菌的杀伤效果。方法构建原核重组质粒pET32a-LysinB并诱导表达, 纯化蛋白后制备多克隆抗体;构建真核重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin并转染进单核巨噬细胞RAW264.7, 经制备的LysinB多克隆抗体进行表达鉴定后, 建立细胞感染模型并通过抗酸染色和菌落计数检测LysinB/Holin融合蛋白的杀菌效果。结果成功制备LysinB的多克隆抗体。重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin在真核细胞中有效表达LysinB/Holin融合蛋白且对细胞无明显毒性。LysinB/Holin融合蛋白可有效杀伤胞内的结核分枝杆菌。结论重组质粒pcDNA3.1(+)-LysinB/Holin对胞内结核分枝杆菌有较好的杀伤效果, 且对细胞无明显毒性, 具有治疗结核病的潜能。     

AngRem104基因与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及在COS-1细胞中的表达定位

构建以绿色荧光蛋白（Green fluorescence protein,GFP)为报告基因的重组表达质粒AngRem104-pEGFP-N1，利用脂质体转染体外培养的COS-1细胞，在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察AngRem104-EGFP融合蛋白在细胞中的分布和定位，用RT-PCR和Western blot方法验证其mRNA和蛋白的表达。结果表明在空载体pEGFP-N1转染组中，COS-1细胞内绿色荧光呈弥散分布；重组质粒AngRem104-pEGFP-N1转染组中，绿色荧光集中在细胞核中，随着表达量的增高，绿色荧光在细胞核中聚集成团块状，颗粒状，RT-PCR的结果表明AngRem104在重组质粒转染组中的表达明显高于空载体和空白对照组。Western blot的结果也确证了AngRem104-EGFP融合蛋白的表达。提示新基因AngRem104/pEGFP融合基因真核表达载体在真核细胞COS-1中获得了表达，细胞所表达的融合蛋白具有An-gRem104和EGFP的双重活性，可用荧光显微镜直接观察其表达情况及亚细胞定位，为基因功能研究提供了线索。     

增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与轮状病毒（RV）VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布。方法提取A组人RVTB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段。将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况。结果成功构建了融合表达质粒;转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中。结论RVVP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别。     

人KLK1和EGFP双顺反子重组腺病毒构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建携EGFP为报告基因和人组织激肽释放酶1(hKLK1)基因双顺反子的重组腺病毒（Ad-hKLK1-IRES-EGFP）,并观察在自发性高血压大鼠（SHR）血管平滑肌细胞（VSMCs）中的表达变化。方法:通过双酶切质粒pBluescritII KS-hKLK1，将hKLK1基因定向克隆至带有IRES-EGFP的腺病毒穿梭质粒pDC316中，构建成重组穿梭质粒 ，将其与腺病毒骨架质粒BHGloxE1，3Cre共转染293A细胞，经包装并获得重组腺病毒，用PCR、酶切及测序方法对其进行鉴定，测定病毒滴度；用重组腺病毒感染VSMCs，用荧光显微镜下观察到的绿色荧光来测定感染率，用RT－PCR和Western blotting法测定hKLK1基因在VSMCs中的表达。结果:PCR、酶切和测序表明携EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hKLK1-IRES-EGFP构建正确，并与骨架质粒在293A细胞中成功包装出重组腺病毒Ad-hKLK1-IRES-EGFP，其滴度为4.5×10¹¹/L。重组腺病毒感染VSMCs后，在荧光显微镜下观察到明亮绿色荧光蛋白表达，感染率高达90％以上，可检测到hKLK1基因的mRNA及蛋白表达，并与感染时间(1 d-7 d) 有显著依赖关系，峰值感染复数为100 MOI。结论:成功构建并包装了携EGFP和hKLK1基因的双顺反子重组腺病毒载体系统Ad-hKLK1-IRES-EGFP；感染VSMCs可检测到基因hKLK1和EGFP的独立共同高表达，该系统为一直观、安全、高效的基因转移系统。     

pLXSN—EGFP逆转录病毒载体的构建及体内外表达的研究

目的构建携带有绿色荧光蛋白（GFP）基因的逆转录病毒载体,观察该报告基因在动物体内外表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。方法以质粒pEGFP-C。为模板进行PCR反应,获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN获得重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP,转染PA317包装细胞后收集具有感染能力的病毒颗粒,转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察EGFP作为报告基因在体内外的表达情况以及对靶细胞生物特性的影响。结果成功克隆携带有EGFP基因的逆转录病毒载体,该载体经包装细胞包装后可有效转染人多型性脑胶质瘤细胞SW038-C2并在体内外稳定表达,对靶细胞及其所成肿瘤的生长无抑制。高表达GFP的靶细胞形态变得细长,FACS检测约有98％的细胞表达GFP,体外培养6个月荧光强度没有明显的衰减,而低表达GFP的靶细胞形态无变化,FACS检测有30．7％细胞表达GFP。结论该载体可在体内外成功表达,对靶细胞的生长无明显抑制,高表达GFP的靶细胞有一定形态上的变化：使用GFP作为报告基因,检测到的病毒载体转染率比实际偏低。