肿瘤突变负荷位点检测准确性评价

目的 使用肿瘤突变负荷国家参考品中高置信SNP/Indel位点标准集的参考品,评价肿瘤突变负荷检测试剂盒的位点检测准确性.方法 采用TMB检测试剂盒(可逆末端终止测序法)检测肿瘤突变负荷检测国家参考品中高置信SNP/Indel位点标准集的参考品.首先将DNA片段化处理,进行末端修复、接头连接和文库扩增等步骤后构建文库;...     

肺小细胞癌免疫治疗相关的分子标志物检测

目的 探讨肺小细胞癌(SCLC)中免疫治疗分子标志物程序性死亡配体1(PD-L1)及肿瘤突变负荷(TMB)与临床病理特征的相关性及预后分析.方法 回顾性收集北京协和医院2008-2018年间SCLC病例组织标本50例,并收集相应临床病理资料;采用免疫组织化学(IHC)染色检测PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TI...     

数字PCR法检测血液EGFR基因T790M突变的评价

目的 使用血浆循环肿瘤DNA基因突变检测国家参考品,对EGFR基因T790M突变检测试剂盒（数字PCR法）的准确性、特异性和检测限的性能进行评价。方法 提取国家参考品的血浆游离DNA,并测定浓度。取不同浓度的EGFR基因T790M突变的游离DNA样本,加入装有ddPCR和ddPCR MIX3的PCR预混液的PCR管中,混匀后使用全自动样本处理系统进行微滴制备。将微滴转入96孔板内后,使用微滴式数字PCR系统的封膜仪和PCR仪进行封膜和PCR扩增。取PCR扩增样本,加至芯片中,使用生物芯片阅读仪读取结果。结果 对国家参考品中不同突变频率的EGFR基因T790M突变样本,试剂盒能够准确检出T790M突变。对国家参考品中EGFR基因其他突变的样本,试剂盒未检出T790M突变。试剂盒能够准确检测0.05%突变频率的国家检测限参考品。结论 EGFR基因T790M突变检测试剂盒（数字PCR法）具有很好的检测准确性、特异性和灵敏度,国家参考品具有很好的检测方法适用性。     

地贫核酸检测国家参考品对单分子测序试剂的适用性评价

目的 评价地中海贫血核酸检测国家参考品（批号：360014-201701）在单分子测序法试剂的适用性。方法 按照α/β-地中海贫血基因分型检测试剂盒行业标准（YY/T 1527-2017）及国家参考品说明书要求,确定适用性研究项目：准确性、特异性及检测限。取拟研究的试剂盒,对国家参考品中的目标区域进行长片段扩增,在目标DNA长片段两端连接接头,使用消化酶去除非环状片段,最终获得哑铃状文库,构建好的哑铃状文库结合测序引物和酶,在基因测序仪Sequel?Ⅱ CNDx的SMRTCell纳米小孔中进行单分子测序。测序后的基因序列对比到参考基因序列上,通过生物信息软件分析,来判断检测结果与国家参考品的预期结果是否一致。结果 该试剂盒可准确检出范围内相应基因型别的国家阳性参考品,阴性参考品和范围外的国家阳性参考品均未检出突变,且检测限不高于3 ng/μL。结论 地中海贫血核酸检测国家参考品可用于基于单分子测序法的地中海贫血基因检测试剂盒性能评价,此研究扩展了国家参考品的适用范围,并且促进了地中海贫血基因检测试剂盒的标准化。     

胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒评价

目的 使用胚胎植入前染色体非整倍体国家参考品,评价胚胎植入前染色体非整倍体检测试剂盒(半导体测序法)的性能。方法 取国家参考品进行细胞裂解及片段化,制备文库,进行文库的扩增和单细胞扩增后纯化。将纯化的单细胞扩增DNA片段化和纯化后,进行末端修复、加上接头以及PCR扩增等步骤,构建文库。将文库纯化后进行定量。使用基因测序仪BioelectronSeq 4000进行测序。使用试剂盒配套的全自动分析软件对测序数据进行信息分析,报告样本的染色体异常情况。结果 对于65个异常片段大于4 Mb的国家阳性参考品,试剂盒均能检出对应的染色体异常,检出率为100%;国家阳性参考品19-del(7)-25.3 M在7号染色体100.5 Mb-125.8 Mb位置存在片段大小约25.3 Mb的拷贝数缺失,Z-score为-28.6,其他国家阳性参考品的相应异常区域对应的染色体Z-score均>3或<-3。对于15个异常片段小于等于4 Mb的国家阳性参考品,对应的染色体异常检出率为86.7%(13/15);国家阳性参考品22-del(7)-1.5 M在7号染色体72.1 Mb-73.6 Mb位置存...     

同源重组修复检测的评价

目的 使用人实体瘤多基因突变联合检测试剂盒,对国家参考品进行同源重组修复基因(HRR)检测,评价试剂盒的HRR检测能力.方法 使用超声打断仪将参考品基因组DNA打断到180～220 bp.将片段化DNA进行末端修复、加接头和PCR扩增等步骤后制备预文库;然后杂交捕获后获得终文库;最后使用NextSeq550Dx测序仪进...     

耳聋基因突变检测国家参考品的研制

目的建立耳聋基因突变检测国家参考品。方法收集健康人及含20种不同耳聋基因突变位点的志愿者血清,通过Sanger测序,从中筛选出野生型和突变型的血清样本,分装制备成一套含23份样本的候选耳聋基因突变检测国家参考品。用6个厂家8个耳聋基因突变检测试剂盒对参考品进行验证。参考品的均匀性和稳定性通过联合探针锚定聚合测序法进行检测。结果各家试剂对大部分参考品的验证结果基本一致。本实验室对参考品在验证过程中新出现的突变位点进行了测序确认。参考品的均匀性和稳定性满足要求。结论通过协作验证以及均匀性、稳定性评价,该耳聋基因突变检测国家参考品可用于耳聋基因突变检测试剂盒的质量评价。     

染色体微缺失检测准确性评价

目的 使用染色体拷贝数变异检测国家参考品,评价基于高通量测序技术的染色体微缺失检测准确性。方法 使用不同高通量测序平台的染色体拷贝数检测试剂盒,检测国家参考品中的染色体微缺失综合征样本。先将国家参考品进行DNA片段化和接头连接等步骤构建文库,并进行文库纯化。对纯化的文库进行质量控制后,使用不同型号的基因测序仪进行检测。然后使用试剂盒的生物信息分析软件分析获得的测序数据,得到样本的染色体拷贝数的检测结果。结果 不同试剂盒对染色体微缺失综合征样本的结果均能检出标注的染色体拷贝数变异类型,而且试剂盒和对照方法的变异区域的交叠区域均不低于对照方法的变异区域的80%。结论 经评估,不同测序平台的染色体拷贝数检测试剂盒能够检出染色体微缺失的染色体拷贝数变异类型,而且检测的交叠区域均在在变异区域的规定范围内,能够满足染色体微缺失检测准确性的要求。     

晚期非小细胞肺癌患者肿瘤突变负荷与靶向治疗疗效相关性

目的:探讨晚期非小细胞肺癌肿瘤突变负荷(TMB)与肿瘤靶向治疗疗效的相关性。方法:纳入2016年1月至2018年1月在复旦大学附属中山医院行靶向治疗的51例晚期非小细胞肺癌患者,采用靶向二代测序技术检测其肿瘤组织标本的TMB水平,并分析TMB与靶向治疗疗效的相关性。结果:51例非小细胞肺癌患者的中位TMB水平为6.2个突变/Mb,其中吸烟患者的TMB水平较不吸烟患者升高(P=0.046)。将所有入组患者分为高TMB组和中低TMB组,生存分析显示:与高TMB组相比,中低TMB组患者的无进展生存期(PFS)更长(410 d vs 217 d, HR=0.331, 95%CI 0.165～0.665,P=0.001 2)。亚组分析显示:在男女性、有无吸烟史、合并TP53基因突变与否患者中,中低TMB组者的中位PFS均长于高TMB组患者(P0.05);在腺癌、表皮生长因子受体(EGFR)突变、EGFR 19外显子缺失、EGFR L858R患者中,中低TMB组患者的中位PFS也长于高TMB组患者(P0.05)。结论:对于具有驱动突变的晚期非小细胞肺癌患者,肿瘤组织TMB水平对靶向治疗疗效具有预测作用,高TMB水平提示靶向治疗患者的PFS更短。     

BCR-ABL融合基因定性检测试剂盒的性能评价

目的 使用BCR-ABL参考品,评价BCR-ABL融合基因定性检测试剂盒的性能。方法 提取参考品的RNA,测定其浓度和纯度。使用白血病融合基因检测试剂盒（荧光PCR法）进行PCR扩增。使用不同平台的荧光定量PCR仪进行检测,并使用仪器软件进行分析,获得参考品的BCR-ABL融合基因结果。结果 阳性参考品在BCR-ABL反应通道扩增曲线有明显对数增长期且Ct值<试剂盒的阳性界值,为BCR-ABL融合突变阳性,BCR-ABL融合基因突变阴性和其他白血病融合基因突变的阴性参考品在BCR-ABL反应通道没有扩增曲线,为BCR-ABL融合突变阴性,不高于100拷贝/反应的检测限参考品在BCR-ABL反应通道扩增曲线有明显对数增长期且Ct值<阳性界值,为BCR-ABL融合突变阳性,重复性参考品的BCR-ABL反应通道Ct值的变异系数（CV,%）为0.4%～1.8%。结论 BCR-ABL融合基因定性检测试剂盒能够准确检出参考品的BCR-ABL融合基因突变,符合《断裂点簇集区-艾贝尔逊白血病病毒（BCR-ABL）融合基因检测试剂盒》标准中的阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、检出限和重复性...     

端粒酶在肿瘤检测中的研究进展

1994年Kim等利用端粒重复序列扩增（telomeric repeat amplification protocol．TRAP）方法检测了101种肿瘤标本和100个独立的永生化细胞系、发现90种肿瘤标本和98个永生化细胞系中含有端粒酶活性，而同时检测的良性肿瘤及正常体细胞中未发现端粒酶活性。     

SLCO1B1&APOE基因多态性检测性能验证

目的对人类SLCO1B1APOE基因检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行性能验证。方法参照产品行业标准要求及相关文献,设计验证方案,对武汉友芝友医疗公司生产的人类SLCO1B1APOE基因检测试剂盒的准确性(与金标准测序法结果比较)、特异性、最低检出限和抗干扰能力4个方面进行性能验证。结果 20个临床样本的荧光定量PCR检测结果与测序法结果比对,符合率为100%,满足试剂准确性验证要求;40个临床样本荧光PCR野生型位点的检测结果用测序方法均未检出突变,满足试剂特异性验证要求;基因检测试剂盒的最低检出限为10 ng/μL;血红蛋白、总胆红素和三酰甘油3种干扰物质加入已知基因型结果的血液样本后进行检测,与对照组结果均符合,满足试剂抗干扰能力验证要求。结论人类SLCO1B1APOE基因检测试剂盒各项性能验证参数与厂家声明基本一致,符合相关质量管理要求,可应用于临床标本检测。     

利用等位基因特异性扩增检测人结直肠癌BRAF基因V600E突变

目的建立一种基于等位基因特异性扩增技术检测人BRAF基因V600E突变的技术,用于检测低水平肿瘤点突变。方法设计选择性扩增人BRAF基因V600E的引物,利用BRAF V600E突变型大肠癌细胞系HT29核酸混合于BRAF野生型大肠癌细胞系SW480中进行灵敏度检测,通过与Sanger测序法比较,利用其检测40例结直肠癌石蜡标本的BRAF V600E突变情况。结果模拟细胞系混合检测显示该方法可检测出6.2%混杂于野生型基因里的BRAF V600E突变,利用该方法在40例大肠癌标本中成功检测出3例BRAF V600E突变,与测序法检出结果一致。结论成功建立了利用等位基因特异性扩增技术检测人BRAF基因V600E突变的实验技术并用于检测实体肿瘤标本,与测序法相比该方法具有灵敏、简便、快速的特点,可用于人肿瘤BRAF V600E突变的筛查应用。     

肿瘤突变负荷与肿瘤浸润性免疫细胞在结直肠癌预后及进展中的作用

目的：本文旨在通过分析结直肠癌(colorectalcancer,CRC)中肿瘤突变负荷(tumormutational burden,TMB)、肿瘤浸润性免疫细胞(tumor-infiltratingimmunecells,TICs)及临床病理特征三者之间的相互关系,探讨TMB及TICs在CRC进展中的相互作用及临床意义。方法：下载癌症基因组(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中CRC患者的相关数据,包括肿瘤突变、基因表达及相关临床信息等。利用R语言分别计算每个肿瘤样本的TMB值及TICs百分比,并分析TMB值及TICs百分比与临床病理参数和5年总生存率的相关性。根据TMB中位值将肿瘤样本分成高TMB组(n=224)和低TMB组(n=246),比较2组5年总生存率。筛选出差异表达基因和差异表达TICs,通过基因本体论(Gene Ontology,GO)、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)及基因集富集分析(GeneSetEnrichmentAnalysis,GSE A)寻找其...     

肿瘤突变负荷水平在非小细胞肺癌患者术后接受铂类药物为基础辅助化疗的临床意义

目的 探讨肿瘤突变负荷（TMB）在接受铂类药物为基础辅助化疗的非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）患者中的临床意义。方法 研究纳入78例术后接受铂类药物为基础辅助化疗的非鳞NSCLC患者。通过二代测序技术进行体细胞突变检测和TMB分析。随后通过电话随访获取患者的复发情况和长期生存数据。进行TMB状态和预后的生存分析,并通过Cox多变量分析进行校正。结果 78例NSCLC患者中最常见的突变基因为TP53、EGFR、LRP1B、DNMT3A和FAT3。此外,以中位TMB值为阈值将患者分为低TMB组和高TMB组。关联分析表明高TMB患者的OS较差。此外,Cox多变量分析结果提示TMB对患者的OS仍具有独立的影响。结论 高TMB对术后接受铂类药物为基础辅助化疗的非鳞NSCLC患者的OS具有较差的影响。     

DNA微阵列芯片法检测慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韦酯耐药突变

目的 评价一种新研制的DNA微阵列芯片HBV基因型耐药检测试剂盒的临床应用性能.方法 收集2008年12月至2010年6月224份CHB患者血清标本,提取HBV DNA,应用DNA微阵列芯片法和直接测序法平行检测HBV逆转录酶区(rt区)位点rtL180、rtA181、rtM204和rtN236的耐药突变.对结果不一致的标本进行克隆测序,以验证检测的准确性.结果 芯片法和直接测序法均成功检测224份标本全部896个位点的耐药基因型,214份标本结果完全一致,其中82份检测到突变,132份为野生型HBV.2种方法检测HBV耐药突变结果的完全符合率为95.5%(214/224).其余10份标本只用芯片法检测到突变:2份rtL180M突变、2份rtA181V突变、3份rtM204I突变、2份rtM204V突变、1份rtN236T突变,但是直接测序未检测到相应突变.包含突变序列的克隆所占比例为5.0%～15.0%.经克隆测序验证结果与芯片法完全一致.结论 DNA微阵列芯片法检测HBV耐药突变与直接测序法相比符合率高,并可检出低比例耐药突变毒株,有助于早期提示耐药的发生.     

EGFR19基因体细胞突变焦磷酸测序法室内质量控制的建立

目的试建立适用于表皮生长因子受体基因(EGFR19)体细胞突变焦磷酸测序法日常检测的室内质量控制体系。方法选择EGFR19E746_A750del(1)突变为10%的样本作为外部质控品,前20次的检测数据采用即刻法控制其检测质量,建立EGFR19基因体细胞突变焦磷酸测序的L-J质控图。结果该质控品前20次的SI上限和SI下限均在n2s内,用L-J质控图计算在即刻法质控的基础上获得的前20次外部质控品9C/14G的突变比例,其均值(x珋)为11.78%,标准差(s)为1.70%,变异系数(CV)为14.46%。结论用EGFR19质控品绘制L-J质控图,可对实验误差进行控制。     

PD-L1和PD-1在T4期结直肠癌组织及周围转移淋巴结中的表达情况及与预后相关性研究

目的 探讨程序性死亡受体1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)在T4期结直肠癌组织及周围转移淋巴结中的表达情况及与预后相关性.方法 选取2017年12月至2021年5月常州市第七人民医院收治的T4期结直肠癌患者80例,采取免疫组化法对结直肠癌组织及周围转移淋巴结中的PD-L1、PD-1表达进行检测,比较PD-L...     

c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系的建立与鉴定

目的通过在c-kit突变型人胃肠间质瘤原代细胞中过表达人端粒酶逆转录酶(h TERT),建立c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术获得h TERT目的基因片段,测序正确后,体外构建端粒酶亚单位(h TERT)逆转录病毒表达载体,转染c-kit突变型胃肠间质瘤原代细胞,通过RT-PCR及western bloth技术检测h TERT在原代细胞内的表达变化,选取h TERT表达升高的细胞,利用有限稀释法获得高表达h TERT的单克隆细胞株。结果实验中成功获得h TERT目的基因片段,获得的细胞株与原代细胞相比h TERT表达上调,且体外传代50次后依然保持很好的细胞形态及活力。结论成功获得c-kit突变型人胃肠间质瘤永生化细胞系,为进一步研究c-kit突变对胃肠间质瘤的影响奠定基础。     

非小细胞肺癌PD-L1蛋白表达、EGFR基因突变状态及二者相关性研究

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中程序性死亡因子配体1(PD-L1)蛋白的表达、表皮生长因子受体(EGFR)基因突变状态及二者的相关性。方法采用免疫组织化学EnVision两步法检测93例NSCLC石蜡组织标本中PD-L1蛋白的表达情况,同时运用突变扩增系统(ARMS)-qPCR法检测EGFR基因突变状态;结合患者临床资料,对PD-L1蛋白表达、EGFR基因突变的临床病理特征及两者的相关性进行研究。结果 93例肺癌组织中PD-L1蛋白表达阳性率为55.9%(52/93)。PD-L1蛋白表达与TNM分期相关,TNMⅡ、Ⅲ期的阳性率显著高于Ⅰ期(P0.05),而与性别、年龄、吸烟史、病变部位、肿瘤大小、淋巴结转移、组织学类型及分化类型无关(P0.05)。EGFR基因突变状态与性别、吸烟史、肿瘤大小和组织学类型相关(P0.05),更易发生于女性、无吸烟史、肿瘤大小≤3cm、腺癌患者,而与患者的年龄、病变部位、淋巴结转移、分化类型和临床分期无关(P0.05)。Logistic回归分析发现,性别可显著影响EGFR基因突变状态(P0.05)。Spearman等级相关分析发现,PD-L1蛋白表达与EGFR基因突变状态无相关性(P0.05)。结论检测PD-L1蛋白表达、EGFR基因突变状态,有助于高效筛选免疫治疗和靶向治疗的检测对象,为临床用药提供理论依据。