脐带血血清培养体系扩增人骨髓间充质干细胞及其生物学特征

背景:骨髓内的间充质干细胞含量极少,因此课题立项设计之一即如何得到足够数量的骨髓间充质干细胞,并避免细胞培养过程中因动物血清造成的病原体污染和异种血清所致的过敏反应.目的:拟建立脐带血血清培养系统,以实现体外扩增人骨髓间充质干细胞的目标.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-09/2007-10在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:12份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供,6例采自正常供者,6例采自拟行造血干细胞移植的肿瘤患者.方法:无菌条件下抽取未抗凝的脐带血,静置待血凝块完全析出后吸取血清,离心弃沉淀,取各项病原微生物检测均呈阴性的脐带血血清用于细胞培养,临用前56℃水浴灭活30min.抽取正常供者和肿瘤患者的骨髓液100mL/份,采用Ficoll Paque分离液分离骨髓单个核细胞,加入含体积分数为0.1脐带血血清的DMEM/F12进行传代培养.传至第3代低温、液氮冻存,4～8周后予以解冻复苏,胰蛋白酶消化传代.取第4代骨髓间充质干细胞,锥虫蓝染色后,加入成骨诱导体系培养14d,碱性磷酸酶染色;加入脂肪诱导体系培养14d,油红O染色.主要观察指标:绘制细胞生长曲线,流式细胞仪测定细胞周期及表面抗原的表达,骨髓间充质干细胞定向分化情况.结果:骨髓间充质干细胞扩增培养至第4代,接种后两三天为生长潜伏期,3～5d为对数增殖期,5～7d细胞生长缓慢进入平台期.采自正常供者和肿瘤患者的骨髓间充质干细胞,冻存前后扩增数量均基本相似(P0.05),细胞存活率均96%,CD29、CD73、CDl05阳性率均90%,CD31、CD34、CD45阳性率均5%,诱导2周后成骨细胞和脂肪细胞的阳性率均85%.结论:应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人骨髓间充质干细胞,且冻存前后骨髓间充质干细胞生物学特性没有明显改变.     

胎儿骨髓间充质干细胞的生物学特性

目的:间充质干细胞是普遍存在于人体各组织中的一种成体干细胞,可从骨髓、外周血、脐血、脂肪组织、骨外膜、骨小粱、肌肉、胎肺、胎肾等组织中分离出来.实验观察了人胎儿骨髓间充质干细胞体外分离和培养的方法,观察其生物学特性,以及向各胚层分化的可行性.方法:实验于2006-07/2007-08在苏州大学附属第二医院血液科实验室完成.①实验材料:4个月胎龄的流产胎儿由苏州大学附属第二医院妇产科提供,产妇及家属均签署知情同意书,实验经医学伦理委员会批准.②实验方法:采用Ficoll法分离胎儿骨髓腔冲洗液,离心后取单核细胞层培养、扩增、传代,观察细胞生物学特性,采用MTT法观察细胞生长曲线及分裂指数曲线.取第3代细胞,在含新生牛血清、地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸的DMEM-LG培养基中诱导其成骨分化;在含新生牛血清、地塞米松、胰岛素的DMEM-LG培养基中诱导其成脂分化:在含bFGF、N2、DMEM-LG培养液中诱导其成神经分化.③实验评估:于3周后行von Kossa染色、油红0染色和免疫组织化学检测Nestin、NES、NF的表达以鉴定诱导后的细胞.结果:①接种48 h后,贴壁细胞呈梭形、多角形、成纤维细胞样形态.1周后开始传代,传代培养的潜伏期为24～36 h,对数增殖期约为二三天,第6天进入平台期.传代至8代后生长速度变慢.②FCM榆测显示,细胞高表达CD29、CD44及CD49e分子,低表达CD106、CD54、CD11b,而不表达CD34.③成骨、成脂培养基诱导3周后,Von-Kossa染色呈黑色,油红染色成橘红色.诱导后的胎儿骨髓间充质干细胞于第4天进行免疫组织化学染色显示Nestin、NF、NES表达阳性.结论:采用Ficoll密度梯度离心、贴壁筛选法及单克隆培养法,分离、培养、扩增出具有高度同源性的胎儿骨髓间充质干细胞,并在体外成功的诱导其向成骨细胞、脂肪细胞和神经元细胞分化.     

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景:间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较.目的:课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成.材料:解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20 mL与2 mL.解放军海军总医院产科10例健康仞产妇脐带血细胞,细胞体积为30 mL.方法:采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基.当细胞生长汇合至80%～90%时胰蛋白酶-EOTA消化,制成5×10~8 L-1细胞悬液,计为P_0.重复上述操作,即为P_1,依此类推P_2～P_5.主要观察指标:细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记.结果:①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞:骨髓间充质干细胞培养5～7 d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性.②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞.③P1～P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均里阴性.④与P_0细胞比较,传代培养至P_5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P＜0.05).⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%,P_0～P_5为55.9%～92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P_0～P_5为19.7%～33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P_0～P_5为35.4%～93.2%.CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低.CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%～28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%～21.3%.结论:结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多.     

脐血与骨髓间充质干细胞生物学性状的比较

背景:实验证实脐带血与骨髓在体外均可分离培养出间充质干细胞,且两种不同来源的间充质干细胞均具有自我更新及多向分化的能力.目的:比较脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的表型和生物学性状差异.设计、时间及地点:对比观察,于2007-10/2008-05在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.材料:3份正常成人骨髓血,取自青岛大学医学院附属医院3例行自体干细胞移植治疗的糖尿病患者(40～50岁),3份胎儿脐带血取自青岛大学医学院附属医院妇产科.方法:在无菌条件下抽取糖尿病患者骨髓血0.5 mL,肝素抗凝后与1.5 mL PBS混匀,然后按1:1比例加入2 mL percoll淋巴细胞分层液中,2 000 r/min离心10 min,吸取其云雾状自膜层,PBS冲洗稀释后1 000 r/min离心10 min.离心后的沉淀细胞加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液,制成单细胞悬液后接种于培养瓶中.取胎儿脐带血,用PBS1:1稀释,分离及培养方法同上.主要观察指标:显微镜下观察第3代培养的间充质干细胞形态变化;四甲基偶氮唑盐法测定细胞生长曲线;碱性磷酸酶染色观察间充质干细胞向成骨的分化.结果:①分离的脐血接种到培养瓶中的白膜层细胞在两三天时开始贴壁,2周左右达到80%～90%汇合.细胞形态不均一,随培养时间延长,细胞体积逐渐增大伸展;骨髓间充质干细胞大部分于24 h内贴壁.倒置显微镜下可见贴壁细胞呈圆形,有小的胞浆突起.瑞特染色后,可见成纤维样细胞形态,细胞呈平行排列生长或漩涡状生长,与脐血间充质干细胞相比,贴壁早,增殖快.②电镜观察可见间充质干细胞为成纤维样细胞,为长形或梭形,少数细胞核质比大,胞浆少,核仁明显,具有干细胞特征.③在细胞生长的对数期,脐血和骨髓间充质干细胞倍增时间分别为150 h和50 h.④脐血和骨髓间充质干细胞成功诱导后细胞形态由原来的梭形变成了立方形,随着细胞生长形成结节结构,碱性磷酸酶染色阳性.结论:两种不同来源的间充质干细胞均具有自我更新及多向分化的能力.骨髓间充质干细胞支持造血、促进造血功能恢复和重建造血的功能强于脐血间充质干细胞.     

几种骨髓间充质干细胞体外培养特性的比较

背景：骨髓间充质于细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell．BMSC）可分化成多种非造血细胞系及寻踪损伤组织并进行修复，BMSC潜在的临床应用已被广泛研究，其生物学特性有待进一步探讨。目的：观察体外培养条件下几种不同种属骨髓间充质干细胞生物学特性。 设计：随机对照观察。 单位：解放军广州军区广州总医院医学实验科。 材料：实验于2004-06／2005—07在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。选择30只体质量为（16．0&;#177;2.0）g，出生35～40d的昆明小鼠；30只体质量为（160&;#177;20）g，出生约40d的SD大鼠；8只体质量（2．0&;#177;0．2）kg，出生80-90d的新西兰白兔。所有动物为清洁级，购自南方医科大学动物中心；10名健康志愿者的骨髓，所有健康志愿者年龄25—32岁，男女各半。 方法：采用Caplan实验室建立的方法制备小鼠和大鼠BMSC，通过髂骨穿刺取得骨髓液分离免和人的BMSC。光镜和电镜观察各种属BMSC形态，MTT法测各种属BMSC定生长曲线，免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪分析各种属BMSC表面分子Stro-1的表达，并通过试剂盒检测碱性磷酸酶（AKP）活性、免疫组化检测骨钙素表达以及Von Kossa法显示钙盐沉积等手段评价BMSC对成骨诱导液（10nmol／L地塞米松，10mmol／L磷酸甘油和50mg／L抗坏血酸）反应性。成脂分化程度以含Oil Red-O-染色油滴的细胞百分数评估。 主要观察指标：①各种属BMSC的生长形态和生长曲线。②各种属BMSC标志物Stro-1的表达。③对成骨诱导液的反应。 结果：①光镜下观察的各种属BMSC生长形态明显不同，在成熟或老化阶段，小鼠细胞变扁平，呈不规则多角形，破碎时成点状沉积在瓶底；大鼠、家兔和人的细胞老化后体积明显增大。呈多边形，胞浆中出现空泡，呈棉絮状漂起、自瓶壁脱落。各种属BMSC多层重叠生长方式相同。均无接触抑制并分别含有两群细胞（一群可从单细胞长成克隆，迅速扩增；另一群零星散在分布，不进行增殖）。电镜显示所有原代细胞均有微绒毛，根据超微结构可分为2个亚群：一群细胞富有细胞器，以常染色体为主；另一群细胞器少，且以异染色体为主。各种属BMSC生长曲线基本一致。②人原代贴壁细胞BMSC标志物Stro-1的阳性率为（91．4&;#177;8．3）％，小鼠为（83．5&;#177;6．2）％。③在成骨诱导液中，小鼠BMsc向脂肪细胞分化，家免细胞死亡，大鼠和人细胞可被成功诱导为成骨细胞。BMSC在培养中有自发分化现象。 结论：小鼠、大鼠、家兔和人BMSC可在体外被大量扩增，得到以低／未分化细胞为主的、不同分化程度细胞的混合物；不同种属BMsc在形态学和对同一诱导液的反应性上存在差异。     

几种骨髓间充质干细胞体外培养特性的比较

背景:骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,BMSC)可分化成多种非造血细胞系及寻踪损伤组织并进行修复,BMSC潜在的临床应用已被广泛研究,其生物学特性有待进一步探讨。目的:观察体外培养条件下几种不同种属骨髓间充质干细胞生物学特性。设计:随机对照观察。单位:解放军广州军区广州总医院医学实验科。材料:实验于2004-06/2005-07在解放军广州军区广州总医院医学实验科完成。选择30只体质量为(16.0±2.0)g,出生35～40d的昆明小鼠;30只体质量为(160±20)g,出生约40d的SD大鼠;8只体质量(2.0±0.2)kg,出生80～90d的新西兰白兔。所有动物为清洁级,购自南方医科大学动物中心;10名健康志愿者的骨髓,所有健康志愿者年龄25～32岁,男女各半。方法:采用Caplan实验室建立的方法制备小鼠和大鼠BMSC,通过髂骨穿刺取得骨髓液分离兔和人的BMSC。光镜和电镜观察各种属BMSC形态,MTT法测各种属BMSC定生长曲线,免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪分析各种属BMSC表面分子Stro-1的表达,并通过试剂盒检测碱性磷酸酶(AKP)活性、免疫组化检测骨钙素表达以及VonKossa法显示钙盐沉积等手段评价BMSC对成骨诱导液(10nmol/L地塞米松,10mmol/L磷酸甘油和50mg/L抗坏血酸)反应性。成脂分化程度以含OilRed-O-染色油滴的细胞百分数评估。主要观察指标:①各种属BMSC的生长形态和生长曲线。②各种属BMSC标志物Stro-1的表达。③对成骨诱导液的反应。结果:①光镜下观察的各种属BMSC生长形态明显不同,在成熟或老化阶段,小鼠细胞变扁平,呈不规则多角形,破碎时成点状沉积在瓶底;大鼠、家兔和人的细胞老化后体积明显增大,呈多边形,胞浆中出现空泡,呈棉絮状漂起、自瓶壁脱落。各种属BMSC多层重叠生长方式相同,均无接触抑制并分别含有两群细胞(一群可从单细胞长成克隆,迅速扩增;另一群零星散在分布,不进行增殖)。电镜显示所有原代细胞均有微绒毛,根据超微结构可分为2个亚群:一群细胞富有细胞器,以常染色体为主;另一群细胞器少,且以异染色体为主。各种属BMSC生长曲线基本一致。②人原代贴壁细胞BMSC标志物Stro-1的阳性率为(91.4±8.3)%,小鼠为(83.5±6.2)%。③在成骨诱导液中,小鼠BMSC向脂肪细胞分化,家兔细胞死亡,大鼠和人细胞可被成功诱导为成骨细胞。BMSC在培养中有自发分化现象。结论:小鼠、大鼠、家兔和人BMSC可在体外被大量扩增,得到以低/未分化细胞为主的、不同分化程度细胞的混合物;不同种属BMSC在形态学和对同一诱导液的反应性上存在差异。     

骨髓间充质干细胞的生物学特性及其临床治疗应用

学术背景:骨髓间充质干细胞是来源于骨髓基质的一类具有自我更新能力、可分化为中胚层细胞系的干细胞.可分化为组成组织功能细胞的内在能力,使它们成为细胞和基因治疗的潜在来源.目的:综述骨髓问充质干细胞的生物学特性和治疗应用的研究进展.检索策略:应用计算机榆索Pubmedl999-01/2006-12期间相关文章,检索词为"Bone marrow mesenchymal stem cells,gene therapy,transplant",并限定文章语占种类为English.同时机检索万方数据库1999-01/2006-12期间相关文章,检索词为"骨髓间充质干细胞,基因治疗,移植".对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文.纳入标准:文章所述内容应与骨髓间充质干细胞生物学特性、治疗中应用相关进展研究.排除标准:重复研究或Meta分析类文章.共收集到95篇相关文献,78篇文献符合纳入标准,排除的45篇为内容陈旧或重复文献.文献评价:文献的来源主要是骨髓间充质干细胞的各种生物学特性、细胞移植、基因治疗等基础和临床相关研究.选用符合纳入标准78篇文献中的33篇,4篇关于骨髓间充质干细胞分离,3篇关于骨髓间充质干细胞的表面标志,6篇关于骨髓间充质干细胞生物学特性,3篇关于骨髓间充质干细胞移植与宿主间的免疫反应,17篇关于骨髓间充质干细胞在疾病治疗中的运用.资料综合:骨髓间充质干细胞在合适条件下可分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱、神经样细胞、心肌细胞、支持造血干细胞的基质细胞等多种细胞.研究表明,由于骨髓间充质干细胞具有免疫抑制性和非常低的免疫原性,骨髓间充质干细胞被用于实验和临床的治疗研究中,主要包括4个方面的应用:局部移植:系统移植;结合干细胞的基因治疗:组织工程领域中的应用.尽管目前的研究大部分在动物实验中,但部分临床运用已取得了成功,这些有效的结果尚需临床足够的随机患者的研究.结论:对骨髓间充质干细胞生物学特性已有了一定的认识,这对其运用于临床治疗提供了坚实基础,随着对其特性的不断揭示,骨髓间充质干细胞在临床治疗应用中有着理想前景.     

小儿骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能

背景:国内报道人骨髓间充质干细胞多取材于成人细胞,小儿骨髓间充质干细胞的研究较少.目的:拟分离培养小儿的骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性以及向成骨、成脂肪、成神经分化的潜能.设计:观察对比实验.单位:华中科技大学同济医学院.材料:实验于2006-03109在武汉同济医院骨科实验室完成,小儿骨髓间充质干细胞取自5～8岁因髋关节发育不良行骨盆截骨术的患儿,男1例,女2例,实验经过医院伦理委员会批准许可,并征得所有患儿家属知情同意.地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠、甲基异丁酸黄嘌呤、胰岛素、吲哚醚辛、羟基丁酸苯甲醚均为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amersco公司产品.方法:经Percoll梯度分离接种获得小儿骨髓间充质细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态、排列分布情况.分别采用成骨细胞诱导剂(β-甘油磷酸钠,地塞米松,维生素C)、成脂肪细胞诱导液(地塞米松,甲基异丁酸黄嘌呤,牛胰岛素,吲哚美辛)及二甲摹亚砜和羟基丁酸苯甲醚无血清培养摹诱导剂干预细胞向成骨、脂肪、神经细胞分化,经免疫组织化学染色、PCR、免疫细胞染色方法检测成骨标志物(碱性磷酸酶、骨钙素mRNA、钙结节)、脂肪标志物(脂滴、PPAR Y-2mRNA)、以及类神经标志物(尼克氏体、神经烯醇化酶、神经丝蛋白).主要观察指标:①d,JL骨髓间充质细胞形态以及增殖情况.②成骨、脂肪及类神经标志物检测结果.结果:①小儿骨髓间充质细胞贴壁容易,细胞细长梭形,增殖能力强,融合后呈旋涡状分布.②骨髓间充质细胞分别经各诱导剂诱导后,细胞形态均发生相应的变化,用化学染色、PCR、免疫细胞染色等方法检测成骨标志物、脂肪标志物及类神经标志物有明显阳性表达.结论:小儿骨髓间充质细胞生长具有稳定增殖、传代的能力,具有成骨、成脂肪、成神经等多方向的定向分化潜能.     

体外全骨髓法培养人骨髓间充质干细胞的生物学性状

目的:现阶段多以动物为材料培养观察骨髓间充质干细胞的生长特性,对人骨髓间充质干细胞培养和生长特性的研究相对较少.为此实验培养人骨髓间充质干细胞,拟建立稳定的培养方法.方法:实验于2007-03/09在泸州医学院中心实验室省级重点实验室完成.①实验材料:6个月以上流产胎儿由泸州地区妇产医院提供,产妇及家属对实验知情同意,并经医院伦理委员会批准.②实验方法:应用全骨髓培养法培养人骨髓间充质干细胞,采用差速贴擘对细胞进行纯化.③实验评估:倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态及生物学特点,应用MTT法间接测定骨髓间充质干细胞活性.结果:①培养4 h,见骨髓间充质干细胞已开始贴壁,胞体由圆形变为不规则形或三角型,培养第2-4天,见间充质干细胞胞体向两端伸出二三个粗短突起,此时细胞形态渐变为梭型,呈成纤维细胞样生长,并聚集成集落;随着细胞的生长,贴壁细胞逐渐表现为脊梁状、旋涡状生长,细胞突起增长、增粗,并可发出更细的分支,突起间可相互交织成网.培养7 d时,见细胞铺满瓶壁面积的70%～80%,细胞排列紧密,此时骨髓间充质干细胞铺成单层.苏木精-伊红染色见细胞多为长梭型,有突起及分支,胞体较大,核一个,较大,呈椭圆,着色浅,可见多个的核仁,胞质浅红色.②骨髓间充质干细胞表面标志CD44免疫组织化学榆测,可见胞膜出现棕黄色阳性反应.③MTT法分别检测结果显示,2～6代细胞于酶标仪490 nm波长处吸光度值无明显差异,但均高于七八代细胞.结论:利用全骨髓培养法成功地培养出人胎儿骨髓间充质干干细胞,且第3～6代细胞纯度高、活性好.     

脂肪与骨髓来源间充质干细胞生物学特性的比较

背景:近几年来脂肪来源的间充质干细胞因其取材容易也被广泛研究。目的:比较脂肪来源和骨髓来源间充质干细胞的生物学特性。方法:分离及体外培养人骨髓源间充质干细胞和脂肪源间充质干细胞,比较它们的表型、细胞倍增时间及分泌因子水平等。结果与结论:脂肪来源和骨髓来源的间充质干细胞在细胞表型上类似,只有CD106的表达有差异。脂肪来源间充质干细胞增殖速率比骨髓来源的间充质干细胞快。在相同体积的脂肪组织中能够得到的干细胞前体细胞的数量是骨髓的10倍以上。提示脂肪来源和骨髓来源的间充质干细胞具有相同功能,但脂肪组织是一个更有应用前景的干细胞来源。     

脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的:比较脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法:实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所及江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料:脐带血9份,由南昌大学第二附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。正常骨髓9份,由南昌大学第二附属医院血液科门诊及住院患者提供,均附有捐赠同意书。外周血9份,取自正常自愿者。本实验经医学伦理委员会批准。②实验方法:无菌条件下采集脐血、骨髓和正常人外周血,分离单个核细胞。脐血及骨髓单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、1×10-3mol/L氢化可的松的IMDM培养液,7d后换液,去除悬浮细胞,以后每3～4d换液1次,待细胞90%融合后,胰蛋白酶 乙二胺四乙酸混合消化,传代培养,取第3代细胞用于实验。正常人外周血单个核细胞以1×109 L-1接种于培养瓶中,加入含体积分数为0.1的小牛血清、10mg/L植物血凝素的IMDM液,培养3d后收集细胞用于实验。③实验评估:采用流式细胞术检测脐血间充质干细胞及淋巴细胞表面分子。取第3代的脐血和骨髓间充质干细胞,体外诱导培养后以脂肪染色液鉴定其向脂肪细胞的分化情况。将不同细胞浓度的脐血和骨髓间充质干细胞分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较两种不同来源的间充质干细胞对淋巴细胞增殖的调控作用。结果:①脐血间充质干细胞和骨髓间充质干细胞的培养及鉴定:第3代脐血间充质干细胞表面分子标记率CD29为85.18%,CD166为72.52%,CD54为33.70%,CD45为6.70%,CD13为1.51%,CD34为0.23%。正常人外周血单个核细胞中的CD3 T细胞为60%～70%,CD20 B细胞为3.5%～4.5%。脐血间充质干细胞诱导培养3周,可见呈桔黄色的脂肪细胞。②脐血间充质干细胞及骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制:淋巴细胞:间充质干细胞为1∶1,1∶0.5,1∶0.1,1∶0.05,1∶0.02,1∶0.01时,脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(49.5±4.8)%,(58.4±6.0)%,(38.1±4.0)%,(31.4±3.2)%,(24.3±3.2)%,(12.6±6.7)%,而骨髓间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率分别为(52.4±8.4)%,(65.1±9.7)%,(34.7±4.5)%,(13.0±6.4)%,(-10.7±12.6)%,(-43.9±9.4)%。后3种细胞浓度比例脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞(t=7.72,8.14,14.68,P均<0.05)。结论:脐血间充质干细胞与骨髓间充质干细胞一样,也具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,抑制效果与间充质干细胞数量有关。低浓度的脐血间充质干细胞对淋巴细胞的抑制作用明显强于骨髓间充质干细胞。     

羊水、脐带和骨髓来源间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制效果比较

目的：比较羊水来源间充质干细胞（ AF-MSC）、脐带来源间充质干细胞（ UC-MSC）和骨髓来源间充质干细胞（ BM-MSC）对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的抑制作用。方法从妊娠中期羊水、新生儿脱落脐带、正常成人骨髓中分离获取原代AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC。观察形态并采用流式细胞术检测表面分子。取传代培养的第3代的AF-MSC、 UC-MSC和 BM-MSC体外诱导培养后,观察体外诱导成骨成脂多向分化情况。将不同细胞浓度的AF-MSC, UC-MSC和 BM-MSC分别加入到植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,比较3种不同来源的MSC对淋巴细胞增殖的调控作用。结果分离培养的AF-MSC, UC-MSC和BM-MSC分别表达MSC特异性表面分子CD29、CD70、 CD90,不表达造血干细胞表面分子CD45。体外传代培养的AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC对淋巴细胞增殖的抑制中,当淋巴细胞∶MSC为1∶1、1∶10、1∶50、1∶100时,对淋巴细胞增殖的抑制率AF-MSC最强, BM-MSC最弱。结论 AF-MSC、 UC-MSC和BM-MSC均具有抑制植物血凝素诱导淋巴细胞增殖的作用,其中以AF-MSC抑制效果最强, BM-MSC最弱,其抑制效果与MSC数量有关。     

脐血单个核细胞与骨髓间充质干细胞滋养层的共培养

背景:骨髓间充质干细胞具有维持骨髓正常造血功能,在造血调控中发挥重要的作用。目的:观察骨髓间充质干细胞的生物学性状和多向分化能力,并检测其在体外支持造血的能力。方法:利用密度梯度培养法分离骨髓单个核细胞进行培养,流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表型;接种脐血单个核细胞于骨髓间充质干细胞滋养层培养板上共培养,观察粒-单系祖细胞集落变化。结果与结论:骨髓间充质干细胞呈典型的成纤维样细胞形态,强表达CD44,CD29,不表达CD34和CD106。可促进脐血单个核细胞扩增并形成造血祖细胞集落。提示骨髓间充质干细具有造血支持作用。     

人脐带血和骨髓来源间充质干细胞的体外分离、培养、分化及生物学特性比较

背景:间充质干细胞由于具有自我更新能力且在适宜微环境下具有多向分化潜能,近年来已成为细胞领域的研究热点.目的:对比观察脐带血与骨髓来源的间充质干细胞其体外分离、纯化及培养条件,并对其进行生物学特性比较.设计:体外细胞学对比观察.材料:新鲜脐带血在征得产妇同意后采集.骨髓由健康的成年志愿者捐赠.方法:取脐带血和成人骨髓分离、培养并纯化间充质干细胞,对获得的间充质干细胞进行形态学观察.主要观察指标:两种来源间充质干细胞的形态和生长特性;流式细胞仪检测脐带血间充质干细胞表面抗原的表达情况;对脐带血间充质干细胞多向分化的能力进行鉴定.结果:两种来源的单个核细胞经体外培养贴壁后均出现间充质样细胞,原代骨髓间充质干细胞的贴壁时间和培养时间均短于脐带血间充质干细胞,两种细胞传代生长呈共同特性:传代培养潜伏期为24～36h,传代培养对数增殖期为接种后3～7d,接种后八九天,生长进入平台期:脐带血来源的间充质干细胞表达相关抗原CD29、CD44、CD105;但不表达造血细胞抗原CD34、CD45:脐带血间充质干细胞可诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞.结论:人脐带血和骨髓来源间充质干细胞均可在体外分离培养、扩增:脐带血的间充质干细胞原代贴肇时间、形成细胞克隆的时间、集落交错融合的时间均较骨髓间充质干细胞晚,传代培养的细胞形态,生长速度均无明显差异;两种来源的间充质干细胞具有相同的表面标志物;脐带血间充质干细胞有多项分化潜能,可诱导为脂肪细胞、成骨细胞.     

脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的比较

背景:为避免骨髓间充质干细胞培养过程中应用异种血清的排斥以及提高骨髓间充质干细胞培养效率,制备脐带血清体外扩增培养骨髓间充质干细胞是目前的研究热点.目的:比较脐带血清和成人自体血清体外培养人骨髓间充质干细胞的生物学特性.设计、时间及地点:开放性实验,于2006-10/2008-06在中南大学湘雅二医院细胞生物实验室完成.材料:16份骨髓标本由中南大学湘雅二医院和湖南省湘潭市中心医院提供.方法:采用Ficoll Paque细胞分离液从16例新鲜成人骨髓穿刺液中分离骨髓间充质干细胞,分别用含体积分数为10%脐带血清、成人自体血清的DMEM/F12培养基培养,取第4代细胞进行实验.流式细胞仪检测细胞表面抗原,成骨诱导体系及脂肪诱导体系分别诱导各组骨髓间充质干细胞定向分化.通过细胞形态观察、免疫表型及免疫化学染色进行鉴定.主要观察指标:①细胞形态.②骨髓间充质干细胞计数和细胞周期.③表面标志物的鉴定.④免疫组织化学染色观察骨髓间充质干细胞诱导成骨、成脂情况.结果:①脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞在增殖数量和速度上优于成人自体血清组(P＜0.05).两种血清培养条件下,只有少数细胞处于活跃的增殖期,脐带血清组S期细胞多于成人自体血清组(P＜0.05).②脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞表达CD29、CD73、CD105的阳性率均在90%以上,高于成人自体血清组(P＜0.05);而CD31、CD34、CD45的阳性率均在2%以下,CD31阳性率低于成人自体血清组(P＜0.05).③脐带血清培养的骨髓间充质干细胞诱导为成骨细胞阳性率和脂肪细胞阳性率均高于自体血清组(P＜0.05).结论:脐带血清组培养的骨髓间充质干细胞的纯度和体外诱导分化能力比成人自体血清组高,更适合临床应用.     

人脐带和骨髓源间充质干细胞对脐血单个核细胞增殖能力的影响

目的：探讨人脐带间充质干细胞（UCMSCs）与骨髓间充质干细胞（BMMSCs）在体外对造血干细胞的支持作用。方法分别从人脐带和骨髓中分离、培养间充质干细胞,通过免疫细胞化学染色等方法对其进行表型鉴定;采用流式细胞仪测定脐血单个核细胞的周期分布,采用甲基纤维素法测定脐血单个核细胞混合集落形成单位（CFU-Mix）,比较 UCMSCs和BMMSCs对脐血单个核细胞细胞周期、CFU-Mix形成能力的影响。结果成功培养获得 UCMSCs和BMMSCs,鉴定结果符合预期;与非共培养组细胞相比,UCMSCs和 BMMSCs共培养均能促进脐血单个核细胞进入增殖周期,并增加其形成CFU-Mix的能力（P＜0．05）,但UCMSCs和BMMSCs共培养组之间比较差异无统计学意义（P＞0．05）。结论成功从人脐带和骨髓组织中培养获得间充质干细胞,两种来源的间充质干细胞均能提高脐血单个核细胞的体外增殖能力及 CFU-Mix形成能力,均具有造血支持作用。     

大鼠脂肪和骨髓来源间充质干细胞基本生物学特征的比较

目的:分离大鼠脂肪和骨髓来源的间充质干细胞,比较两种间充质干细胞的生物学特征。方法:实验于2003-09/2006-11在广州市第一人民医院、湘雅医院中心实验室完成。取SD大鼠的股骨、胫骨、肱骨及腹股沟处脂肪垫进行骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞的分离。将骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞在含10%血清,1%双抗的低糖DMEM培养基,37℃、体积分数为0.05的CO2条件下进行培养。在细胞达到80%～90%融合时,使用0.25%胰酶消化传代。传代至第3代使用倒置显微镜观察骨髓和脂肪两种不同来源细胞的传代后的形态、贴壁、生长增殖、集落等情况。取消化传3代的两种细胞分别制成单细胞悬液进行细胞贴壁率的检测,贴壁率=贴壁细胞总数/接种细胞总数×100%。取第2代和第5代骨髓间充质干细胞和脂肪间充质干细胞以1×107L-1密度培养。每天同一时间,随机抽取5孔细胞,加入5%噻唑兰20μL/孔,培养4～6h,吸出孔内液体,每孔加150μL二甲基亚砜震荡10min,酶联免疫测定仪测定波长490nm处的吸光度,取5孔吸光度的均值,以时间为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制生长曲线。采用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44标记,免疫化学检测细胞CD29、CD34、CD44。结果:①在单位质量骨髓和脂肪组织中获得的间充质干细胞数量相当。两种细胞形态均为条索样,呈成纤维细胞形态。②应用直线相关分析,考察骨髓贴壁率与脂肪贴壁率之间的关系,相关系数r=0.999,决定系数r2=0.997(F=5862.949,P<0.001),两贴壁率之间有直线相关关系,不同的时间点两种细胞的贴壁率相似,并且有同向变化的趋势。③脂肪间充质干细胞的增殖能力与骨髓间充质干细胞相当。④脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞表面表达CD29、CD44,不表达CD34。结论:自大鼠脂肪中可提取出与骨髓间充质干细胞生物学特征类似的脂肪间充质干细胞。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记人骨髓和脐带间充质干细胞：

背景：优化人源细胞安全、有效的标记参数及细胞移植后的定位是评价其治疗效果至关重要的环节。目的：比较核磁影像对比剂超顺磁性氧化铁纳米粒子体外标记入骨髓和脐带间充质干细胞的细胞活率、标记效率及核磁共振T2＊WI成像的效果,优化标记细胞处理细节。方法：培养第3代人骨髓和脐带间充质干细胞,以5-30mg／L菲立磁（FeridexIV）结合硫酸鱼精蛋白标记细胞。结果与结论：人骨髓和脐带间充质干细胞标记前后细胞的存活率接近（P〉0．05）。以530mg／L菲立磁标记骨髓间充质干细胞的阳性标记率差异无显著性意义（P〉0．05）：而5mg／L菲立磁标记脐带间充质干细胞的阳性标记率与20和30mg／L菲立磁标记的差异有显著性意义（P〈0．05）：10mg／L菲立磁标记脐带间充质干细胞的阳性标记率低于骨髓间充质干细胞（P〈O．05）。当≥20mg／L菲立磁标记细胞时,2种来源的细胞悬液中均出现不易洗脱和过滤去除的氧化铁颗粒。标记后细胞在3.0T MR GRE T2＊WI扫描均见随菲立磁的浓度升高,信号强度减弱。提示这2种组织来源的间充质干细胞,以10mg／L的菲立磁硫酸鱼精蛋白复合物标记是安全有效的,可用临床T2＊WI的MR成像观察。     

脐血间充质干细胞的分离培养及生物学特性

背景:脐血富含干细胞,刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血干细胞。目的:建立一种分离纯化、培养扩增脐血间充质干细胞的方法,并观察体外培养脐血间充质干细胞的生物学特性。方法:密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,分离纯化脐血间充质干细胞。观察细胞形态,绘制细胞生长曲线,应用流式细胞仪测定细胞周期,以免疫组织化学法(SP 法)测定 CD29,CD44,CD34。采用体积分数 20%马血清诱导脐血间充质干细胞分化为脂肪细胞,以油红 O 染色鉴定;0.1 μmol/L 地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和 50 μmol/L 抗坏血酸诱导脐血间充质干细胞分化为成骨细胞,以碱性磷酸酶染色鉴定。结果与结论:分离获得了高纯度贴壁生长的间充质干细胞,间充质干细胞呈梭形,细胞传代稳定,在体外连续传代培养 9 代,未发生形态学改变,无衰老征象。第 3 代间充质干细胞体外可以分化为脂肪细胞和成骨细胞。提示采用淋巴细胞分离液密度梯度离心,贴壁培养和消化时间控制相结合,可以获得纯度较高的脐血间充质干细胞,脐血间充质干细胞体外增殖和传代能力强。