shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制

目的:重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用.方法:根据MDR1基因序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列(sh-MDR1-1,sh-MDR1-2),重组构建psh-MDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC-7721/R,用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的潴留.结果:PCR和DNA测序证实了psh-MDR1-1和psh-MDR1-2重组质粒的成功构建,均能有效地抑制细胞P-gp表达;转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性,P-gp表达水平明显降低,细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高;第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论:体外完成shRNA RNAi载体的构建,能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达,抑制P-gp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi,能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.     

靶向抑制肝癌耐药细胞多药耐药基因表达的实验研究

目的：构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA（shorthairp in RNA,shRNA）表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。方法：利用分子克隆技术,将含MDR1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,RT-PCR分析MDR1mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞P-gp的表达。结果：PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制MDR1mRNA的表达;P-gp的表达阳性率降低了57.3%,P〈0.05。结论：构建的pshRNA-MDR1表达质粒能靶向抵制肝癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达。     

编码大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建Nogo受体(NgR)特异性shRNA重组腺病毒载体,为应用基因沉默技术从转录后水平进行缺血性脑损伤的基因治疗研究奠定基础.方法:将前期构建的大鼠Nogo受体mRNA的shRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含NgR基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌.将pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Adeno-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、PCR产物测序及病毒滴度测定.结果:结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及DNA测序结果证明Adeno-U6-shRNA包被成功.结论:成功构建了大鼠Nogo受体mRNA的shRNA重组腺病毒载体Adeno-U6-shRNA,将为应用基因沉默技术研究NgR在缺血性脑损伤后神经再生中的作用奠定基础.     

转录因子E2F-1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建细胞周期相关转录因子E2F-1RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体。方法：选取E2F-1基因的19nt特异性序列,设计针对E2F-1的shRNA序列,应用基因重组技术克隆到pLentiLox3.7（pLL3.7）慢病毒表达载体中,XbaI和NotI进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,在脂质体的介导下将慢病毒的混合包装载体质粒和包含E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体共转染293FT细胞,包装成病毒48h后,收集病毒颗粒,孔稀释法测定病毒滴度。结果：双酶切证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确;293FT细胞包装E2F-1基因RNAi的重组慢病毒载体成功;收集的细胞培养上清液中,病毒的滴度为5×10^7TU/mL。结论：成功构建人E2F-1基因RNAi慢病毒载体,为研究E2F-1对于胃癌生长的影响提供了稳定的转染细胞载体。     

RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.用脂质体2 000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线.结果 构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞.     

MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达

目的：构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA（MDR1）,并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法：根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。 用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Western blotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果：重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60 bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDR mRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论：逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。     

小鼠动力蛋白激活蛋白1-shRNA慢病毒载体的构建及在足细胞中的敲低效应

目的 构建表达小鼠动力蛋白激活蛋白1 (dynactin-1)特异性shRNA的慢病毒载体,并检测其对小鼠足细胞dynactin-1的敲低效果.方法 针对小鼠dynactin-1 mRNA序列,设计合成3种shRNA,克隆到入门质粒pENTR/pTER中,再利用LR反应重组到pLenti X2 Puro慢病毒目的质粒,经过酶切测序鉴定后,将慢病毒质粒和包装质粒共转染293FT细胞,包装得到病毒颗粒.各组shRNA病毒载体转染小鼠足细胞后,用嘌呤霉素抗性筛选细胞,利用蛋白质印迹法检测各组细胞中dynactin-1蛋白的表达水平.结果 构建的各组shRNA入门质粒和慢病毒载体经酶切及测序鉴定正确;慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,制备病毒颗粒,转染小鼠足细胞,经嘌呤霉素筛选获得稳定表达shRNA的足细胞系;蛋白质印迹检测结果表明转染dynactin-1-shRNA组的dynactin-1蛋白表达降低.结论 构建的小鼠dynactin-1-shRNA慢病毒载体能有效降低小鼠足细胞中dynactin-1蛋白表达,为进一步研究dynactin-1在足细胞中的功能奠定了基础.     

干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定

目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.     

NF-κB基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的构建转录因子NF-κB的RNA干扰(RNAi)质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路及以其为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法设计针对NF-κB的shRNA特异性序列,应用基因重组技术克隆到pSilencer 1.0-U6表达载体,EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切及DNA测序鉴定重组克隆;脂质体转染RNAi重组载体至前列腺癌细胞PC-3后,Western blot分析各组NF-κB蛋白表达水平。结果双酶切和DNA测序证实shRNA正确插入pSilencer 1.0-U6质粒;Western blot结果显示与空质粒对照组比较NF-κB转染组细胞NF-κB表达明显下调。结论成功构建人NF-κB基因RNAi质粒,为研究NF-κB参与的细胞信号通路提供了稳定转染细胞的干扰质粒,为靶向NF-κB的基因治疗提供了有力工具。     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

靶向大鼠HIF-1α的RNAi慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建靶向HIF-1α的RNAi慢病毒载体,为进一步观察其对难治性癫痫大鼠模型脑内HIF 1α基因过度表达的干扰作用奠定基础。方法根据GenBank报道的大鼠HIF-1α基因序列,选择4个靶序列,设计并合成4对含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,双链退火后,插入经限制性内切酶Age I和EcoR I处理所得的线性化慢病毒载体pGCSIL-GFP(表达绿色荧光蛋白,GFP)的U6启动子下游,合成4种重组病毒pGCSIL-GFP-shRNA1,2,3,4,经酶切和测序鉴定构建正确后,分别与Lipofectamine 2000共转染293T细胞包装,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液浓缩后得到高滴度的慢病毒液,孔稀释法测定病毒滴度。采用同样方法构建阴性对照重组慢病毒。结果酶切和测序分析证实成功构建了靶向大鼠HIF-1α的慢病毒表达载体4对,滴度为(5～7)×108 TU/ml。结论本实验成功构建了针对大鼠HIF-1α基因的RNAi慢病毒载体,为实现在细胞和动物模型以慢病毒为载体的HIF-1α靶向治疗提供了良好的实验基础。     

多药耐药肝癌细胞模型的建立

目的:构建人多药耐药基因(MDR1)的肝脏特异性真核表达栽体,转染HepG2细胞,建立多药耐药肝癌模型.方法:将小鼠清蛋白启动子序列(pALB)克隆到已成功构建的MDR1基因真核表达载体pcDNA-MDR1中,替换其中的CMV启动子序列,构建MDR1肝脏特异性真核表达载体pcDNA-ALBMDR1,利用KeyGenTransⅢ阳离子转染试剂转染HepG2细胞,用G418筛选稳定表达MDR1基因的细胞,并用RT-PCR方法检测MDR1基因的表达,通过测定细胞对阿霉素的耐受性以及阿霉素与多药耐药逆转剂维拉帕米联合用药情况确定MDR1基因在肝脏细胞中的功能.结果:酶切鉴定和测序结果证明构建的重组表达载体pcDNA-ALBMDR1序列正确.RT-PCR分析以及荧光显微镜观察结果表明:该表达载体已在HepG2细胞中有效转录并稳定表达.MTT药敏实验结果显示:转染pcDNA-ALBMDR1质粒的HepG2细胞对阿霉素的耐药性有显著提高,同时维拉帕米能够显著提高转染细胞对阿霉素的敏感性.结论:成功构建了稳定表达MDR1并具有多药耐药特性的肝癌细胞模型,该模型的建立将有助于多药耐药逆转剂的筛选与研究.     

携反义mrp和mdr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(m rp)和反义多药耐药基因(m dr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(M DR)的研究。方法将m rp基因cDNA 5′端500 bp的基因片段与m dr1基因cDNA 5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(m rp m dr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV H e lper-F ree System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS与AAV H e lper-F ree System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pH e lper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS。结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS,病毒滴度达2.5×108efu/m l。结论构建的rAAV 2-(m rp m dr1)AS可望能将反义m rp和m dr1基因片段导入HCC耐药细胞株。     

Modulation of breast cancer resistance protein mediated atypical multidrug resistance using RNA interference delivered by adenovirus

Clinical multidrug resistance (MDR) of malignancies to many antineoplastic agents is the major obstacle in the successful treatment of cancer. The emergence of breast cancer resistance protein (BCRP), a member of the adenosine triphosphate (ATP) binding cassette (ABC) transporter family, has necessitated the development of antagonists. To overcome the BCRP-mediated atypical MDR, RNA interference(RNAi) delivered by adenovirus targeting BCRP mRNA was used to inhibit the atypical MDR expression by infecting MCF-7/MXIO0 cell lines with constructed RNAi adenovirus.     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

慢病毒介导基于microRNA系统的HBs RNAi技术抑制HBV复制

目的:构建HBs基因RNAi慢病毒载体,观察其对HBV复制和抗原表达的作用。方法:针对已经筛选确定的HBs基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluⅠ和ClaⅠ酶切后的pGCLM-GFP载体连接产生慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pGCLM-GFP、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染包装细胞293T,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。培养HepG2.2.15细胞系,用慢病毒（MOI=1和MOI=10）对肝癌细胞进行感染,感染后细胞培养上清进行ELISA、Western印迹、HBV DNA定量分析。结果:PCR和测序结果证实,成功构建HBs shRNA的慢病毒载体。包装慢病毒后浓缩病毒悬液的滴度为5×108~2×109 TU /ml。慢病毒HBs RNAi后,对HBV复制和抗原表达的抑制作用显著。感染4 d后,抑制效应开始出现,一直持续到第9天,抑制效应达到高峰(P<0.05)。相对于阴性对照,HBs shRNA作用后细胞上清中HBsAg分泌量下降70％以上(P<0.05),而Western印迹和real-time PCR结果进一步证实了上述结果,在蛋白水平和mRNA水平都得到了进一步验证。经HBV DNA定量,发现慢病毒RNAi后DNA水平也显著下降(P<0.05)。结论:成功构建HBs基因RNAi慢病毒载体,以HBs基因为靶点的慢病毒介导的基于microRNA系统的RNAi技术能有效抑制HBV的复制和抗原表达。     

短发夹RNA靶向抑制suvivin基因对人胶质瘤U251细胞凋亡和细胞周期的影响

目的: 构建表达靶向抑制survivin基因的表达短发夹结构 (shRNA)的RNA干扰载体,导入人胶质瘤细胞U251中,研究靶向抑制survivin基因对U251细胞的凋亡诱导以及细胞周期阻滞作用. 方法: 在survivin全长序列中选取设计3条含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,中间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,分步酶切连接,构建出含有3条shRNA模板且能独立编码shRNA的重组干扰载体pGenesil-1/survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞U251;采用荧光定量PCR以及Western bloting分别从mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V/PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡,PI染色检测细胞周期阻滞. 结果:实时荧光定量PCR以及Western blotting检测显示,survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测分析显示,survivin基因表达被抑制后,U251细胞凋亡率明显增高,细胞周期出现明显的G2/M阻滞. 结论: 靶向survivin基因的重组siRNA干扰载体pGenesi-l/survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞U251中的表达, 并明显地诱导了U251细胞发生凋亡和G2/M期细胞周期阻滞.     

Reversal of multidrug resistance in renal cell carcinoma by short hairpin RNA targeting MDR1 gene

目的 研究RNA干扰（RNA interference,RNAi）对肾癌细胞多药耐药基因(MDRl)表达的抑制作用,并分析干扰前后肾癌细胞对化疗药物敏感性的变化。方法 根据MDRl基因设计3条小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）序列,在质粒的介导下转染肾癌A498细胞,RT-PCR法分析转染前后MDR1 mRNA表达水平,筛选出干扰效率最高的siRNA序列;进而利用慢病毒包装siRNA重组质粒,感染A498细胞,RT-PCR法筛选沉默效果最好的细胞株进行克隆,Western bolt法检测MDR1蛋白表达水平,MTT法对比干扰前后多种化疗药物对细胞半抑制浓度（IC50）的变化;相关数据统计通过SPSS10.0软件进行。结果 3条siRNA序列均能不同程度地抑制细胞MDR1基因的表达,其中siRNA-1序列能更有效地封闭MDRl基因,使MDRl mRNA表达水平下降;筛选出的稳转细胞株与未干扰细胞株相比,MDR1蛋白表达量明显下降,并使多种化疗药物对细胞的IC50明显降低。结论 RNAi技术可有效抑制肾癌A498细胞MDRl基因的表达,并可显著增加其对多种化疗药物的敏感性,从而使肾癌细胞化疗耐药逆转成为可能。     

人组织因子RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用RNA干扰(RNAi技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体.方法:根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序.结果:构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致.结论:成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法.