携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒载体的构建

目的　构建携带反义多药耐药相关蛋白 (MRP)的重组腺病毒载体以用于肝癌耐药的基因治疗研究。方法　将 MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒 p Ad Track- CMV上 ,与骨架质粒在大肠杆菌 BJ5 183胞内进行同源重组 ,经 2 93细胞包装、扩增后得到携带反义 MRP的重组腺病毒 Ad Easy- GFP- ASmrp。结果　成功地构建了携带反义 MRP的重组腺病毒载体系统 ,经测定病毒滴度可达 2 .5× 10 9。结论　构建的重组腺病毒 Ad Easy- GFP-ASm rp可望有效地将反义 MRP导入人肝癌耐药细胞株 ,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础     

应用AdEasy系统构建携带反义多药耐药相关蛋白的重组腺病毒的实验研究

目的:应用腺病毒载体AdEasy系统构建携带反义多药耐药相关蛋白(multidrugresistance-associatedprotein,MRP)的重组腺病毒载体。方法:将MRP基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒pAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌BJ5183体内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义MRP的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASmrp。结果:成功地构建了携带反义MRP的重组腺病毒载体系统,经测定病毒滴度可达2.5×109efu/ml,感染复数(multiplicityofinfection,MOI)为100时对SMMC-7721/ADM细胞株转导效率可达90%以上。结论:腺病毒载体AdEasy系统能简便、有效地产生重组腺病毒,且生成的病毒滴度高、转导效率好,为进一步研究肝癌耐药机制及其逆转方式提供实验基础。     

人多药耐药基因1(mdr1)的克隆及重组腺病毒制备

目的:构建表达多药耐药基因1(MDR1)的重组腺病毒表达系统.方法:用基因工程技术将多药耐药基因1的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,然后在细菌内与pAdEasy同源重组,经脂质体转染293细胞包装、扩增腺病毒颗粒.将重组腺病毒Ad5-mdr1感染小鼠单个核细胞,通过荧光显微镜及流式细胞仪进行检测.结果:酶切鉴定及PCR结果证明多药耐药基因重组腺病毒载体构建成功,构建的人多药耐药基因1(mdr1)重组腺病毒载体的效价达到8.3×1011 pfu/ml.对小鼠单个核细胞的感染效率可达10%～15%,转染小鼠单个核细胞细胞48h后,可检测到mdr1基因的表达.结论:成功构建了表达多药耐药基因1的重组腺病毒载体,为后续对mdr1的相关研究创造了条件.     

RNAi技术逆转白血病多药耐药的研究进展

RNA干扰（RNAi）是真核生物中普遍存在的一种自然现象，利用双链RNA诱发宿主细胞同源mRNA降解，从而抑制特异目的基因的表达，不仅具有理论意义，而且具有实用价值。白血病是造血系统常见的恶性肿瘤，虽然通过联合化疗大多数患者可以获得完全缓解，但是最终不可避免的是多药耐药（MDR）导致化疗的失败。MDR已成为目前治愈白血病的最大障碍。因此，逆转MDR成为白血病治疗亟待解决的问题。本文以白血病MDR机制的阐述为线索，综述了RNAi技术逆转白血病MDR的研究进展。     

靶向重组腺病毒载体逆转肝癌细胞多药耐药的实验研究

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 将携带AFP启动子和EGFP基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP转染人正常肝细胞LO2(AFP-)、人宫颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测EGFP基因在各细胞的转录水平,证实重组腺病毒载体的靶向性;将携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr转染HepG2R细胞和HepG2R裸鼠皮下移植瘤模型,检测Adeno-asmdr在体外和体内逆转HepG2R的活性.结果 EGFP基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著的转录,而在LO2细胞和HeLa细胞,其转录和表达量极少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性;Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,mdr1转录水平下降;Rhodamine 123在细胞内聚集量有所下降;在裸鼠皮下移植瘤实验中,经Adeno-asmdr+ADM处理组,移植瘤体积无增大,TUNEL法检测移植瘤内凋亡细胞增加,而经PBS和ADM处理组移植瘤体积明显增大(P<0.05),ADM处理组移植瘤中出现少量的凋亡细胞,而PBS处理组移植瘤未见凋亡细胞.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,有效降低mdr1基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞MDR的逆转作用;结合化疗药物的作用,可以导致裸鼠皮下移植瘤细胞凋亡增加,阻止瘤体生长.     

新基因HA117最佳siRNA的筛选及重组腺病毒构建

目的 验证pSOS-HUS筛选目的 基因最佳siRNA的效果,应用pSOS-HUS筛选新基因HA117最佳siRNA,构建携带HA117基因最佳siRNA转录模板DNA的重组腺病毒.方法 构建携带HA117基因及其siRNA模板DNA链的双克隆质粒.把双克隆质粒分别转染293细胞,通过镜下观察、流式细胞仪检测比较绿色荧光表达强度,RT-PCR检测HA117基因mRNA表达,筛选鉴定基因HA117最佳siRNA.构建HA117基因RNA干扰重组腺病毒.结果 从5对模板DNA链中筛选出最有效片段HAi5,构建携带HAi5的重组腺病毒.结论 载体pSOS-HUS可快捷有效地筛选目的 基因的最佳siRNA;在5对模板DNA中,HAi5转录的siRNA对新基因HA117干扰效果最强;成功构建携带HAi5的重组腺病毒.     

mdr1介导的多药耐药及其逆转的研究进展

目的介绍mdr1介导的多药耐药及其逆转的研究进展。方法采用文献回顾的方式对国内外相关文献进行分析整理,对mdr1基因的结构功能、表达调控以及逆转多药耐药的方法进行综述。结果mdr1基因的过度表达是导致肿瘤多药耐药的重要原因,mdr1表达调控网络主要由转录、转录后水平和表观遗传调控构成,各种机制通常同时在细胞中起作用,逆转多药耐药的研究集中在药物和基因治疗两个方面。结论多种方法联合应用有助于逆转多药耐药。     

Livin siRNA重组腺病毒的构建及其对K562细胞增殖、凋亡和耐药的影响

目的 通过改良的重组腺病毒介导方法 研究Livin基因与K562细胞增殖、凋亡及耐药的关系.方法 用基因工程技术将靶向Livin siRNA片段克隆至穿梭质粒pSES-HUS中,然后与骨架质粒pAdeasy同源重组,将重组成功的质粒用脂质体介导的方法 转染HEK293细胞,乒乓感染收获高滴度的重组腺病毒AdS-Livin siRNA,并将其感染K562细胞,采用Real-time PCR、Western blot检测Livin基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测其与K562细胞增殖、凋亡及多药耐药的关系.结果 成功构建重组腺病毒Ad5-Livin siRNA,并感染K562细胞,在mRNA和蛋白2个水平均抑制Livin的表达.证实通过重组腺病毒沉默Livin基因,可抑制K562细胞增殖,促进凋亡,增加其对阿霉素、长春新碱和依托泊苷的敏感性.结论 用重组腺病毒介导的方法 抑制K562细胞中Livin基因的表达,可增加K562细胞的凋亡及对抗癌药物的敏感性.Livin可能成为治疗白血病新的分子靶点.     

多药耐药基因1与肝癌

目前认为肝癌化疗失败的主要原因与多药耐药有关,而多药耐药基因1(Multi-drug resistance 1gene,mdr1)编码的P-gP蛋白(Permeability-glycoprotein)被认为可能是参与肿瘤多药耐药的主要因素之一.目前的研究发现,mdr1参与肝癌的多药耐药可能与多种机制有关,而且mdr1...     

RNA干扰逆转白血病细胞耐药性的研究

目的 用RNA干扰技术下调白血病耐药细胞系K562/A02多药耐药基因mdr1的表达以逆转白血病对化学药物的耐药性.方法 针对mdr1基因已知mRNA序列不同位点,选择两条靶序列,构建靶向mdr1 shRNA真核表达载体,脂质体介导转染白血病耐药细胞株K562/A02.实时荧光定量RT-PCR检测mRNA表达,Western blot检测细胞膜P-gp表达,柔红霉素泵出试验检测P-gp外排泵功能,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性.结果 构建了二条针对mdr1基因的shRNA真核表达载体,分别下调mdr1 mRNA的表达89.74%和87.18%,降低细胞膜P-gp表达,使膜外泵功能明显下降,柔红霉素在细胞内贮留明显增多,60min 时柔红泵出率为13.16%、22.02%,对照组为40.44%、45.31%,对阿霉素药物敏感性的相对逆转率为84.36%和76.69%.结论 RNA干扰技术可有效逆转mdr1所致耐药.     

以AdMax载体系统构建携带HCV NS5B基因的重组腺病毒表达载体

目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS5B的重组腺病毒表达载体,并对其相关指标进行鉴定,为进一步研究防止丙型肝炎感染的基因免疫和基因治疗奠定实验基础。方法应用基因工程技术将HCVNS5B基因定向克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGloxΔE1、3Cre和穿梭质粒pDC316-NS5B共转染293细胞,进行同源重组,产生重组腺病毒pAd-NS5B并进行鉴定、反复感染293细胞进行扩增,扩增后测定重组病毒滴度。结果重组病毒颗粒pAd-NS5B经双引物PCR、凝胶电泳证明插入片段与HCV非结构基因NS5B片段大小相符;经测序证明其插入序列与设计HCV NS5B基因序列完全一致,扩增后重组病毒滴度达到2.3×1013IU/L。结论成功构建了表达HCV NS5B基因的重组腺病毒载体。     

hNET基因重组腺病毒载体构建和体外表达

目的以复制缺陷的腺病毒为载体,用细菌内同源重组法构建含有人的去甲肾上腺素转运子(human neurotransmitter transporter,hNET)基因的腺病毒载体。方法利用限制性内切酶KpnⅠ XbaⅠ从pCMV5质粒中切下目的基因hNET,亚克隆至经同样酶切的腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV,形成重组穿梭质粒pAdtrack-CMV-hNET,PmeⅠ酶切线性化后,与pAdeasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,获得含目的基因的重组体质粒Ad-hNET,PacⅠ酶切后用脂质体Lipofectamine2000转染HEK293细胞,包装成重组体腺病毒。采用PCR技术和Western Blotting对重组体腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒pAdTrack-CMV中带有绿色荧光蛋白报告基因检测表达,经过扩增和纯化,测定病毒滴度。结果测序结果证明hNET序列的正确,PCR、PacⅠ酶切电泳和Western Blotting证实腺病毒重组质粒Ad-hNET构建成功。扩增纯化后测定重组病毒Ad-hNET的滴度为1.2×1010pfu/mL。结论成功构建了能表达hNET基因的重组腺病毒载体,为肿瘤的靶向治疗提供前期的研究工作。     

RNA干扰技术在逆转肿瘤多药耐药中的应用研究

RNA干扰（RNAi）指与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞时，该序列mRNA发生特异性的降解，并导致基因表达的沉默。小干扰RNA（siRNA）是RNAi作用的主要介质。其可经体外合成再转入细胞，也可通过各种载体内源性表达。RNAi为肿瘤的基因治疗提供新的思路，通过RNAi抑制肿瘤相关耐药基因的表达有望成为一种逆转肿瘤耐药新的策略。     

携反义mrp和mdr1双耐药基因的重组腺相关病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带反义多药耐药相关蛋白基因(m rp)和反义多药耐药基因(m dr1)双耐药基因的重组腺相关病毒载体,以用于逆转肝细胞癌(HCC)多药耐药(M DR)的研究。方法将m rp基因cDNA 5′端500 bp的基因片段与m dr1基因cDNA 5′端600 bp的基因片段,用基因片段重叠法连接成为新的基因片段(m rp m dr1),并反向克隆到重组腺相关病毒载体系统(AAV H e lper-F ree System)表达质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建出重组表达质粒pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS;再将pAAV-IRES-hrGFP-(m rp m dr1)AS与AAV H e lper-F ree System中的控制质粒pAAV-RC和辅助质粒pH e lper用脂质体转染法共转染293细胞,生成新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS。结果成功构建并包装出新型重组腺相关病毒载体rAAV 2-(m rp m dr1)AS,病毒滴度达2.5×108efu/m l。结论构建的rAAV 2-(m rp m dr1)AS可望能将反义m rp和m dr1基因片段导入HCC耐药细胞株。     

卵巢癌中多药耐药基因的表达及其意义

为探讨卵巢癌隐含的耐药机制及其对化疗的影响,用RT－PCR方法对7例正常卵巢组织及32例卵巢癌进行了多药耐药基因（mdr1)检测,结果表明：正常卵巢组织中,rdr1基因均无表达,32例卵巢癌中,mdr1表达阳性率为28．1％,mdr1基因表达与病理类型有关（P＜0．05）,而且mdr1表达阳性者耐药发生率（55．6％）显著高于阴性者（8．6％,P＜0．01）。结果提示：卵巢癌中隐含有由mdr1介导的多药耐药机制,mdr1的表达与卵巢癌的化疗耐药有一定的关系。     

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。     

西比灵逆转抗癫痫药诱导的多药耐受基因表达

目的 研究西比灵逆转抗癫痫药（ＡＥＤｓ）诱导的星形胶质细胞多药耐受基因（ＭＤＲ１）表达的规律。方法 将苯巴比妥钠（ＰＢ）和丙戊酸钠（ＶＰＡ）分别加入培养的星形胶质细胞内,３０天后用免疫细胞化学检验ＭＤＲ１的表达产物Ｐ－糖蛋白（Ｐｇｐ）,继之将终浓度为５μｇ／ｍｌ的西比灵分别加入培养的正常细胞（亲本细胞）及ＭＤＲ１表达增强的细胞（耐药细胞）内,用四甲基偶氮唑盐（ＭＩＴ）法计算逆转倍数和相对逆转效率,     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。