p16β基因重组腺病毒质粒的构建及对喉癌细胞的作用

目的探讨野生型p16β对体外喉癌Hep-2细胞周期信号传导的干预作用。方法以重组腺病毒为载体,构建p16β的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β质粒,并在293细胞中包装、纯化。将已纯化的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β在体外转染Hep-2喉癌细胞,采用MTT实验、流式细胞术（FCM）、免疫组化、Western blot等实验手段检测Hep-2细胞的抑制／杀伤作用及其细胞周期信号、DNA含量、细胞凋亡率的变化;检测P16蛋白的表达和Hep-2细胞的超微结构变化。结果本研究成功地构建和制备了高滴度的AdEasy-GFP-p16β重组腺病毒,并高效地转移到Hep-2细胞内和表达P16蛋白,有效地抑制了Hep-2细胞的生长。被转染的Hep-2细胞被有效地阻滞在G0／G1期,提高了转染细胞的凋亡率。结论重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β能高效感染Hep-2细胞,表达P16蛋白;有效抑制Hep-2细胞增殖;干预Hep-2细胞周期的信号传导机制和细胞周期,诱导凋亡,从而抑制肿瘤细胞增殖活性。     

携带反义热休克蛋白70抑制人喉癌细胞的生长

目的 构建携带反义热休克蛋白70(HSP70)的重组腺病毒载体以用于喉癌的基因治疗研究.方法 将HSP70基因片段反向克隆到腺病毒载体质粒PAdTrack-CMV上,与骨架质粒在大肠杆菌Bj5183胞内进行同源重组,经293细胞包装、扩增后得到携带反义HSP70的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70.结果 成功的构建携带反义HSP70的重组腺病毒载体系统,经测病毒滴度可达8×109.HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达,经Western blotting和免疫组化证实,实验组瘤细胞不能表达或低表达HSP70,而对照和空载体组高表达HSP70.转染反义HSP70的腺病毒载体的Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢,细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰,而空载体组没有.结论 构建的重组腺病毒AdEasy-GFP-ASHSP70可望有效地将反义HSP70导入人喉癌细胞株,为进一步研究喉癌基因治疗提供实验基础.     

SHIP2对喉癌Hep-2细胞生物学行为的影响及对放疗增敏的机制

目的:探究抑制SHIP2对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和侵袭、迁移的影响;探究X射线处理喉癌Hep-2细胞后细胞增殖、凋亡和周期的变化及SHIP2的表达情况;探究靶向抑制SHIP2基因联合放射治疗对喉癌Hep-2细胞增殖、凋亡和周期的影响及对放疗增敏的可能机制。方法:(1)应用小分子干扰RNA技术抑制喉癌Hep-2细胞SHIP2的表达,实验分为5组:空白对照组(Control)、阴性对照组(Negative)、干扰组1(siRNA1)、干扰组2(siRNA2)、干扰组3(siRNA3)],RT-qPCR、Western Blot检测转染24 h后干扰效果;(2)取对数生长期的喉癌Hep-2细胞,分别给予0,4 Gy X射线(SSD=100 cm)处理,CCK-8检测细胞增殖活力,AnnexinPI-FITC/PI双染检测细胞凋亡,PI单染检测细胞周期,RT-qPCR、Western Blot检测SHIP2 mRNA和蛋白的相对表达量;(3)取对数生长期的喉癌Hep-2细胞,实验分4组(空白对照组Control、单纯放射组4 Gy、干扰组siRNA-SHIP2、联合处理组siRNASHIP2+4 Gy)。Western Blot检测SHIP2、pSHIP2、pAKT、caspase-3、P21和P27蛋白的相对表达量。结果:(1)转染24 h后干扰组2 siRNA2下调作用最显著,较空白对照组SHIP2 mRNA下调达60. 1%(P<0. 05)、SHIP2蛋白下调达57. 8%(P<0. 05);与空白对照组对比,siRNA2抑制SHIP2表达后喉癌Hep-2细胞增殖活力、侵袭和迁移能力降低,凋亡增加(P<0. 05)。(2)与0 Gy组比较,放射组各组细胞增殖活力降低,凋亡和G2期阻滞增加(P<0. 05);4Gy射线处理后SHIP2 mRNA、SHIP2和pSHIP2蛋白的相对表达量较空白对照组降低(P<0. 05)。(3)与空白对照组、siRNA-SHIP2组和4 Gy组比较,联合处理组细胞增殖活力降低,凋亡和G2期阻滞增加(P<0. 05),SHIP2和pSHIP2、pAKT的相对表达量降低(P<0. 05),caspase-3、P21和P27蛋白的相对表达量升高(P<0. 05)。结论:靶向抑制SHIP2可与放射治疗协同抑制喉鳞癌Hep-2细胞的增殖活力,促进细胞凋亡和细胞周期G2期阻滞,从而发挥放射增敏的作用。其可能机制是靶向抑制SHIP2表达通过下调PI3K/Akt信号通路活性,进而解除对下游促凋亡因子caspase3和周期阻滞因子P21和P27的抑制作用,与放射线协同增强对喉癌Hep-2细胞的杀伤作用,从而发挥放疗增敏作用。     

Kai1对人喉癌Hep-2细胞株增殖及生长周期的影响

目的:探讨肿瘤转移抑制基因Kail对人喉癌Hep-2细胞株增殖能力及生长周期的影响.方法:本研究以喉癌Hep-2细胞株为研究对象,将携带有Kail基因的重组腺病毒(rAd-Kail)进行扩增、纯化并测定其滴度,用适量rAd-Kail转染人喉癌Hep-2细胞株,利用RT-PCR技术对转染效果进行检测,以未转染Kail的喉癌细胞株为对照组,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、流式细胞术测定转染组细胞株的增殖抑制率和细胞周期.结果:rAd-Kail经扩增、纯化后,滴度可达1010 PFU/ml,当病毒量为30MOI时,对Hep-2细胞的转染率达93%以上.MTT实验显示转染Kail的Hep-2细胞株体外增殖能力明显弱于对照组(P＜0.01),抑制率可达29%.流式细胞术显示与对照组比较,转染组G0/G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少,差异有显著性(P＜0.05 o结论:通过重组腺病毒介导,成功地将Kail基因转入喉癌Hep-2细胞株,Kail对喉癌细胞体外增殖能力具有抑制作用,其机制可能是将Hep-2细胞生长周期阻滞于G0/G1期,提示:Kail抑癌基因可能通过阻滞肿瘤细胞生长周期实现抑制肿瘤细胞增殖.     

降低端粒酶表达对人喉癌细胞系Hep-2生长的影晌

目的：用表达端粒酶反义RNA的方法研究端粒酶在喉癌细胞生长中的作用。方法：将端粒酶反义RNA真核表达载体，pBBS212-hTR转染入人喉癌Hep-2细胞系中，采用端粒重复扩增法测定端粒酶活性，用MTT法及流式细胞仪检测细胞周期，并用电镜观察细胞生长状况。结果：端粒酶反义RNA表达后能抑制Hep-2细胞的端粒酶活性，抑制细胞增殖并促进其凋亡.结论：以端粒酶反义RNA降低端粒酶的方法对人喉癌细胞系Hep-2的生长有明显抑制作用。     

腺病毒携带反义HSP70抑制人喉癌细胞的生长

目的：观察HSP70反义RNA对人喉癌细胞Hep-2的作用，探讨其治疗喉癌的可行性．方法：应用电镜、流式细胞仪和免疫组化图像分析技术检测将携带反义HSP70腺病毒感染人喉癌细胞后，诱导细胞凋亡和HSP70基因表达情况。结果：HSP70反义RNA阻断了Hep-2细胞的HSP70的表达，实验组可以见到典型的凋亡细胞，免疫组化证实，实验组瘤细胞低表达HSP70，而对照和空载体组高表达HSP70。转染反义HSP70的腺病毒的。Hep-2细胞比空载体组和对照组的细胞生长缓慢，细胞周期可见实验组出现亚二倍凋亡峰，而空载体组没有。结论：HSP70反义RNA能显减少人喉癌细胞内HSP70的表达，具有抑制肿瘤生长的作用，有望成为抗喉癌的新基因治疗手段。     

AG490对喉癌细胞STAT3信号传导通路的抑制作用

目的 探讨JAK激酶抑制剂AG490对人喉鳞癌细胞株Hep-2的增殖及凋亡的影响,揭示AG490对STAT3信号传导通路的抑制作用,探讨AG490在喉癌治疗中的意义.方法 应用AG490作用于Hep-2细胞,MTT法检测细胞增殖状态,流式细胞术检测细胞周期与凋亡,固定化蛋白质印迹法(Western b1ot)检测STAT3和p-STAT3蛋白的表达.结果 AG490能有效抑制体外培养的Hep-2细胞的增殖,该抑制作用具有时间与浓度依赖性的特点.AG490诱导喉癌细胞凋亡,且随作用时间延长,凋亡率增加.AG490能抑制STAT3和p-STAT3蛋白在Hep-2细胞的表达.结论 AG490可以下调Hep-2细胞中STAT3和p-STAT3蛋白的表达,抑制喉癌细胞增殖,促进喉癌细胞凋亡.     

靶向survivin基因siRNA对喉癌细胞增殖、凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因的siRNA对喉癌细胞Hep-2增殖和凋亡的影响,为喉癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将靶向survivin基因的siRNA转染至喉癌细胞株Hep-2;MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测对喉癌细胞Hep-2增殖的影响;RT-PCR检测喉癌细胞Hep-2survivin基因mRNA表达的变化;Western Blot检测survivin基因蛋白表达;流式细胞技术检测喉癌细胞Hep-2凋亡情况。结果各浓度survivin-siRNA转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组（〈0.05）,survivinmRNA和蛋白表达有不同程度减弱,并且有明显的浓度依赖性,随着浓度的上升表达率下降。结论利用RNA干扰技术沉默survivin基因表达可以显著抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,不同浓度survivin-siRNA转染能下调survivinmRNA和蛋白表达,靶向survivin基因的RNA干扰技术在喉癌的基因治疗中具有一定价值。     

外源性p16基因稳定转染对喉癌细胞周期和增殖的影响

目的：探索p16基因在喉癌细胞内的表达作用及基因治疗方面的应用前景。方法：采用亚克隆技术，构建p16真核表达载体pCDNA3-p16.利用lipofectamine介导，将外源野生型p16基因导入喉癌细胞系Hep-2，筛选阳性克隆，采用打点杂交技术、免疫荧光、免疫组化、图像分析法观察和分析p16基因的表达。同时以空载体质粒pCDNA3为对照，用流式细胞仪分析瘤细胞生长周期、荧光染色检测细胞凋亡。结果：打点杂交、免疫荧光、免疫组化及图像分析法分析证实转染p16基因的Ｈep-2细胞有外源p16基因的表达，外源基因p16在Hep-2细胞系中的表达能抑制Hep-2细胞系的生长。流式细胞仪计数和免疫荧光检测证实p16能诱导喉癌细胞系Hep-2发生凋亡并导致其发生G1期阻滞。结论：导入外源野生型p16基因可抑制喉癌细胞恶性增殖。     

鸦胆子油乳注射液对喉癌Hep-2细胞抑制作用研究

目的 探讨鸦胆子油乳注射液对喉癌Hep-2细胞增殖活性、凋亡水平、细胞周期及侵袭迁移的影响.方法 不同浓度鸦胆子油乳注射液作用Hep-2细胞后,利用MTT法检测鸦胆子油乳注射液作用后细胞增殖抑制情况;利用Hoechst33258观察细胞的凋亡现象;流式细胞仪检测分析细胞周期分布、凋亡情况;Transwell实验分析细胞侵袭迁移能力的变化情况.结果 经鸦胆子油乳注射液处理后,Hep-2细胞的增殖能力明显受到抑制(P＜0.05),且在一定浓度范围内,呈时间和剂量依赖性;细胞核出现致密的固缩形态及颗粒状荧光,鸦胆子油乳注射液诱导了细胞凋亡;细胞周期都被阻滞在G2/M期;鸦胆子油乳注射液呈剂量依赖性的抑制Hep-2细胞侵袭迁移能力(P＜0.05).结论 鸦胆子油乳注射液可抑制喉癌Hep-2细胞的增殖及侵袭迁移能力,可能与其引起肿瘤细胞周期阻滞,诱导细胞凋亡有关.     

熊果酸对Hep-2细胞增殖的影响及机制研究

目的 探讨熊果酸对人喉癌Hep-2细胞增殖的影响及其机制.方法 熊果酸处理人喉癌Hep-2细胞后,检测细胞的增殖活性和细胞周期及周期相关基因p-STAT3和CyclinD1蛋白表达的变化.结果 熊果酸对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制作用(P＜0.01).以熊果酸处理Hep-2细胞后,G0/G1期细胞比例呈浓度依赖性上升(P ＜0.01);p-STAT3和CyclinD1蛋白表达呈浓度依赖性下调(P＜0.01).结论 熊果酸对人喉癌Hep-2细胞具有明显的增殖抑制和周期阻滞的作用,其作用机制与下调p-STAT3和CyclinD1蛋白表达有关.     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响

目的观察反义VEGF基因转染对HEP-2细胞生物学行为的影响.方法克隆人VEGF基因,将VEGF-cDNA反向克隆到真核表达载体pcDNA3,构建反义VEGF表达载体pcDNA3-VEGF(-);利用阳离子脂质体载体,稳定转染人喉癌Hep-2细胞,并通过流式细胞仪检测,观察转染细胞细胞周期的改变,在透射电镜下观察转染细胞超微结构的改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况.结果成功克隆了人VEGF基因,并构建了携带反义VEGF基因的真核表达载体pcDNA3-VEGF(-);将其稳定转染人喉癌Hep-2细胞,获得了稳定表达反义VEGF的细胞系,与正常Hep-2细胞相比,该细胞系细胞周期及超微结构均无明显改变;将转染细胞注入裸鼠皮下,与对照组相比,肿瘤的生长速度明显减缓.结论反义VEGF基因转染可以有效地抑制喉癌的生长.     

紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的作用研究

目的:研究紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的作用。方法:以不同浓度的紫草素作用于人喉癌Hep-2细胞,MTT法检测紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的抑制率,荧光显微镜观察人喉癌Hep-2细胞凋亡情况,流式细胞仪分析细胞周期分布及凋亡率变化,荧光定量PCR法测量人喉癌Hep-2细胞增殖诱导配体(APRIL)的表达量。结果:紫草素对人喉癌Hep-2细胞的增殖有明显抑制作用,并呈明显的量效关系和时间依赖性。紫草素主要阻滞细胞G1期向S期的发展。紫草素作用人喉癌Hep-2细胞后其APRIL mRNA表达量随时间的延长和浓度的增加而升高,48 h后各紫草素浓度组APRIL mRNA表达与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:紫草素可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,未凋亡的人喉癌Hep-2细胞因APRIL表达升高而有增殖能力增强的潜在趋势。     

腺病毒介导的rHSG-1基因转染对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:应用腺病毒介导的转基因方式转染大鼠增殖抑制基因(rHSG-1),以观察rHSG-1对自发性高血压大鼠(SHR)主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响.方法:体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞并转染含有rHSG-1基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(Ad5rHSG-1),采用细胞计数、MTT和3H-thymidine参入法,观察rHSG-1对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪分析rHSG-1对细胞周期的影响;应用Western Blot方法检测rHSG-1对细胞周期调控蛋白p27Kip1、p21Cip1和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear angitin,PCNA)的作用.结果:Ad5rHSG-1转染培养的SHR VSMCs后,能明显抑制细胞增殖,与对照组相比抑制率为40%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期,周期调控蛋白p27Kip1、p21Cip1表达升高,PCNA表达降低.结论:rHSG-1基因过表达可以抑制培养的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖,并可能是通过参与细胞周期调节发挥作用.     

RNAi沉默STAT3基因联合化疗对人喉鳞癌细胞增殖的影响

目的利用RNAi沉默STAT3基因联合化疗,探讨其对喉鳞癌细胞凋亡的影响。方法体外培养人喉鳞状细胞癌hep—2细胞株,重组质粒脂质体包裹转染Hep-2细胞,实验分为五组。MTT法检测不同实验组转染24h、48h及72h的细胞增殖情况。流式细胞技术检测不同实验组转染后的细胞周期变化情况,及不同实验组转染后p-STAT3及其靶基因产物CyclinD1的蛋白表达水平。结果 （1）STAT3-siRNA增强了DDP对Hep-2细胞的增殖抑制作用和对细胞周期的阻滞作用;（2）转染72h后,流式细胞仪检测结果显示,重组质粒转染＋化疗组的STAT3信号传导通路相关蛋白的表达受到明显的抑制。结论 RNAi沉默STAT3基因能够降低相关调控蛋白的表达,提高人喉鳞状细胞癌hep—2细胞株对化疗的敏感性。     

微小RNA-134-5p靶向作用于EGFR对卵巢癌SKOV3和A2780细胞生长的影响

目的 探讨微小RNA-134-5p(miR-134-5p)靶向作用于表皮生长因子受体(EGFR)基因对卵巢癌细胞生长的影响.方法 以卵巢癌细胞系SKOV3和A2780为研究对象,根据处理方法分为对照组(转染miR-NC)和实验组(转染miR-134-5p).采用qRT-PCR和Western blot检测EGFR基因及下游靶蛋白的表达量;流式细胞术检测细胞周期分布和细胞凋亡情况;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验检测卵巢癌细胞增殖能力.结果 实验组EGFR基因及下游靶蛋白表达显著下调,其中SKOV3细胞中EGFR mRNA下调至48％(P＜0.05),A2780细胞中EGFR mRNA下调至47％(P＜0.05).实验组细胞的细胞周期明显受到抑制(P＜0.05),miR-134-5p通过EGFR靶蛋白诱导细胞凋亡(P＜0.05).实验组细胞的增殖活性和集落形成能力明显受到抑制(P＜0.05).结论 miR-134-5p可通过靶向抑制EGFR基因,促进细胞周期停滞和细胞凋亡,降低卵巢癌细胞的增殖能力.     

反义细胞周期素D1基因对肝癌细胞的作用

目的研究反义基因封闭技术体外抑制细胞周期素D1（cyclin D1）表达后对肝癌细胞增殖的影响。方法肝癌HepG2细胞被转染表达cyclinD1反义互补脱氧核苷酸（AScDNA）的质粒后，观察其cyclinD1表达及体外增殖活性的改变。结果cyclinD1反义cDNA可特异性地抑制肝癌细胞，cyclinD1蛋白的表达。从而调控细胞周期，抑制肝癌细胞增殖。结论利用cyclin D1反义cDNA进行细胞周期干预对肝癌的治疗具有潜在的意义。     

孤儿受体ROR2诱导慢性髓细胞白血病细胞株K562凋亡的研究

目的 研究ROR2抑制慢性髓细胞白血病细胞株K562增殖并诱导其凋亡的作用,初步探讨可能的机制.方法 采用重组ROR2腺病毒(AdROR2)感染K562细胞为实验组,重组RFP腺病毒(AdRFP)感染K562细胞为对照组.采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期变化和细胞凋亡.Western blot检测实验组和对照组促凋亡基因caspase3和抗凋亡基因survivin的表达.结果 与对照组比较,实验组ROR2感染K562细胞48 h后,细胞增殖明显受抑(P＜0.05),细胞周期主要阻滞在G2/M期(P＜0.05),细胞凋亡增多,48 h凋亡显著(P＜0.05),同时促凋亡蛋白caspase3表达升高(P＜0.05),抗凋亡蛋白survivin表达下降(P＜0.05).结论 过表达ROR2能够抑制K562细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与上调了促凋亡蛋白caspase3和下调了抗凋亡蛋白survivin表达有关.