Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP的构建及鉴定

目的 构建特异性强,转染率高,针对人Survivin进行RNA干扰的肿瘤增殖型腺病毒载体(Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP). 方法将针对人Survivin的shRNA的基因序列及EGFP基因序列克隆至肿瘤增殖型腺病毒穿梭质粒pAd-delE1b55kD;HEK-293细胞中包装出毒得到重组腺病毒Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP并测序鉴定.用重组腺病毒感染结肠癌细胞HT-29并检测转染率,用RT-PCR和Western blot分别检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA和蛋白表达的变化. 结果序列测定证明针对人Survivin的shRNA序列及EGFP序列被成功构建到肿瘤增殖型腺病毒载体中;Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP对结肠癌细胞HT-29的转染效率显著高于增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P＜0.01);而对肝细胞的转染率则显著低于对结肠癌细胞株HT-29的转染(P＜0.01).与复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体比较,转染Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低(P＜0.01).结论 构建成功携带针对人Survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒载体Ad-delE1b55kD-shRNA/Survivin-EGFP,其能选择性地高效转染结肠癌细胞株HT-29并有效干扰Survivin,且较之增殖缺陷型腺病毒载体和脂质体载体具有更高的干扰效率.     

高选择性RNA干扰抑制survivin基因对在体结肠癌的治疗作用

目的探讨肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的针对survivin的高选择性RNA干扰对在体结肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响。方法用携带针对人survivin的shRNA的肿瘤增殖型腺病毒Ad-delE1b55KDshRNA/survivin-EGFP转染结肠癌细胞HT-29裸鼠移植瘤模型,以携带相同shRNA的复制缺陷型腺病毒和脂质体载体为对照,检测移植瘤体变化,以及TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡率。结果 Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的高选择性RNA干扰使结肠癌裸鼠移植瘤的瘤体减小、移植瘤细胞凋亡率显著增加,且高于目前常用的复制缺陷型腺病毒载体和脂质体载体(P<0.05)。结论 Ad-delE1b55KD-shRNA/survivin-EGFP介导的高选择性RNA干扰能高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖。     

纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响.方法 用壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA(基因纳米复合物)转染结肠癌细胞株HT-29,并以携带相同shRNA的脂质体载体,以及阴性对照shRNA为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞凋亡率.结果 和脂质体载体比较,转染基因纳米复合物后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低,其细胞死亡率和凋亡率显著提高(P<0.05).结论 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒里介导的Survivin shRNA较之脂质体载体具有更高的干扰效率,且能长期、高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖.     

对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后Survivin基因变化的研究

目的通过对人结肠癌细胞株HT-29转染shRNA重组质粒后观察Survivin基因的变化。方法设计两条针对Survivin基因CDS区不同位点的siRNA片段并构建shRNA表达载体,重组质粒使用阳离子脂质体法转染结肠癌细胞株HT-29。RT-PCR,Western-blot检测转染后mRNA及蛋白表达。结果转染shRNA重组质粒可有效抑制HT-29细胞Survivin的表达,Survivin mRNA和蛋白表达下调,表明Survivin基因沉默效果较高;两个转染组之间相比pshRNA1组Survivin基因的表达量低于pshRNA2组。结论人结肠癌细胞株中的Survivin基因表达率可通过shRNA重组质粒转染而发生变化;siRNA1和siRNA2序列中Survivin基因表达量存在统计学意义,提示我们在今后有关Survivin基因靶向治疗研究中是否需要考虑到序列的选择以提高作用效果。     

mPEG-CS纳米粒介导livin与survivin小干扰RNA杀伤结肠癌细胞

目的 以mPEG-CS纳米粒作为livin基因和survivin基因的干扰RNA的载体,转染人结肠癌细胞HT-29,观察livin和survivin沉默对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 利用离子交联法,制备粒径约60nm的mPEG-CS纳米粒.利用静电吸附法,以纳米粒混悬液与基因溶液配比为3∶1的条件,构建mPEG-CS-livin shRNA纳米粒、mPEG-CS-survivin shRNA纳米粒以及mPEG-CS-(livin shRNA+surviving shRNA)纳米粒,之后,分别转染进人结肠癌HT-29细胞中.利用RT-PCR和Western Blot分别检测livin、survivin基因和蛋白的表达变化;利用MTT法检测livin、survivin基因表达下调对HT-29细胞增殖的抑制效率;利用Hoechst染色检测livin、survivin基因沉默对HT-29细胞凋亡的诱导.结果 各干扰组均能在mRNA和蛋白水平上有效抑制HT-29细胞中livin、survivin的表达.MTT和Hoechst染色结果显示,联合干扰livin和survivin基因可有效抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖,并促进细胞凋亡,且效果均强于单独干扰livin或survivin基因.结论 mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰能有效降低人结肠癌HT-29细胞中livin和survivin基因的表达,抑制HT-29细胞的增殖,并促进HT-29细胞的凋亡,其效果强于单独干扰livin或survivin基因.双基因联合干扰具有协同增强效应.     

RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂敏感性的影响

目的研究ERCC1基因表达与卵巢癌顺铂耐药的关系。构建携带ERCC1基因小发夹干扰RNA的重组质粒表达载体,观察RNA干扰ERCC1基因表达对卵巢癌顺铂敏感性的影响。方法RT-PCR方法检测COC1、COC1/DDP细胞中ERCC1基因表达,基因重组技术构建携带ERCC1小发夹干扰RNA的重组质粒表达载体,脂质体法转染COC1/DDP细胞,RT-PCR及westernblot方法检测转染后细胞内ERCC1mRNA和蛋白的表达,MTT法检测转染后细胞对顺铂敏感性的改变。结果COC1/DDP细胞中ERCC1基因表达明显高于COC1细胞。重组质粒转染后,COC1/DDP细胞中ERCC1mRNA和蛋白表达显著下调。转染后细胞对顺铂的敏感性显著增加。结论COC1/DDP中ERCC1基因表达增强与卵巢癌顺铂耐药相关。RNA干扰抑制ERCC1基因表达能增加卵巢癌耐药细胞COC1/DDP对顺铂的敏感性。     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

分化抑制因子1对结肠癌HT-29细胞增殖的影响

目的探讨检测分化抑制因子1(Id1)对结肠癌HT-29细胞增殖中的影响。方法 HT-29转染Id1表达质粒及合成Id1干扰序列转染HT-29细胞后,RT-PCR和Western blot法检测VEGF mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况。结果 Id1过表达能显著上调VEGF mRNA和蛋白表达(P<0.05),促进细胞的生长,Id1抑制后能显著下调VEGF mRNA和蛋白表达(P<0.05),减缓细胞的生长。结论在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游基因,Id1可通过调控VEGF途径来影响结肠癌细胞增殖,在肿瘤血管生成中发挥重要作用。Id1有望成为结肠癌治疗的一个新靶点。     

C-erbB2基因 siRNA 质粒的构建、鉴定及转染

目的 构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响.方法 利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序.并稳定转染至HT-29细胞.结果 测序证明人C-erbB2 siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Western blot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达.结论 成功构建了人CerhB2干扰载体质粒pGenesil-erbB.稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋向的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础.     

干扰结肠癌上皮细胞Ascl2的表达致其向杯状细胞表型分化

目的探讨转录因子Ascl2对结肠癌细胞分化的影响。方法采用Ascl2分子干扰质粒和对照质粒对结肠癌HT-29和LS174T细胞进行转染,通过G418筛选建立稳定转染的细胞系,采用RT-PCR和Western blot方法检测干扰Ascl2分子表达对肠杯状细胞标志物Muc2和TFF3表达的影响。结果成功构建了shRNA-Ascl2/EGFP质粒以及对照质粒shRNA-control/EGFP,经测序与预期相符,G418筛选获得shRNA-Ascl2/HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-Ascl2/LS174T和shRNA-Ctr/LS174T稳定转染细胞。RT-PCR和Western blot检测证实干扰质粒能够有效地抑制HT-29和LS174T细胞内的Ascl2的表达(P<0.01)。RT-PCR检测发现Muc2和TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的HT-29细胞内均明显上调(P<0.05);Muc2 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T细胞内明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),但是TFF3 mRNA表达水平在Ascl2干扰后的LS174T内升高不明显(P>0.05)。Western blot检测发现Muc2蛋白质表达水平在Ascl2干扰后明显上调(P<0.05)。结论干扰结肠癌HT-29和LS174T细胞内Ascl2的表达导致其向杯状细胞的表型分化。     

丙谷胺、阿司匹林对人结肠癌HT-29细胞增殖的抑制作用

目的 探讨丙谷胺和阿司匹林对人结肠癌细胞株HT-29增殖的协同抑制作用及可能的机制.方法 采用噻唑蓝（MTT）比色法检测胃泌素受体拮抗剂丙谷胺和非甾体类抗炎药阿司匹林分别及联合应用对HT-29细胞增殖的影响;采用实时定量逆转录聚合酶链反应（Real-time PCR）和蛋白印迹法（Western blot）检测丙谷胺和阿司匹林分别干预以及联合用药48h后COX-2和15-PGDH mRNA和蛋白质的表达情况.结果 丙谷胺和阿司匹林分别呈时间和剂量依赖性地抑制HT-29细胞的增殖,且二者具有协同作用;丙谷胺单一用药时,COX-2mRNA和蛋白质表达下调,15-PGDH mRNA和蛋白质表达上调（P＜0.05）;阿司匹林单一用药时,COX-2、15-PGDH mRNA和蛋白质的表达均无明显变化;两药联合应用时,COX-2 mRNA和蛋白质的表达显著下调,15-PGDH mRNA和蛋白质的表达显著上调,与对照组以及各单一用药组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）.结论 丙谷胺、阿司匹林联合应用协同抑制HT-29细胞增殖,此作用可能通过下调COX-2表达,上调15-PG-DH表达这一机制来实现.     

Survivin siRNA提高人结肠癌HT-29细胞对顺铂化疗敏感性的实验研究

目的 以siRNA抑制结肠癌HT-29细胞内survivin的表达,探讨HT-29细胞对顺铂(cisplatin,cDDP)的增敏效果.方法 转染siRNA于HT-29,检测survivin siRNA处理对survivin、Bax、Bcl-2蛋白表达及胱天蛋白酶-3(caspase-3)活性的影响.cDDP处理后,...     

结肠癌细胞中组织因子/活性凝血因子Ⅶ-表皮生长因子受体通路间交互作用机制

目的：探讨结肠癌细胞中组织因子/活性凝血因子Ⅶ（tissue factor/active coagulation factor Ⅶ，TF/FⅦa）通路与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路之间是否存在交互作用。方法： 在KRAS野生型的HT-29及KRAS突变型的LoVo结肠癌细胞中，以FⅦa活化TF/FⅦa通路，采用qRT-PCR、Western blot检测EGFR配体双调蛋白（amphiregulin，AREG）及表皮调节素（epiregulin，EREG）基因、蛋白表达改变；利用RNA干扰技术敲低TF表达后活化TF/FⅦa通路，检测其对AREG、EREG基因表达的影响，以证实FⅦa对AREG、EREG表达调节作用依赖TF。以表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）激活两细胞EGFR通路后，检测TF/FⅦa通路关键分子TF、FⅦ基因表达改变。结果： TF/FⅦa通路活化后，HT-29细胞AREG、EREG基因表达及EREG蛋白表达水平均较对照组显著下调（AREG、EREG基因表达量分别为0.55±0.09 vs.0.99±0.09、0.67±0.10 vs.1.02±0.02，EREG蛋白表达量0.54±0.09 vs.1.04±0.13，P均＜0.05）；LoVo细胞AREG基因表达及AREG、EREG蛋白表达水平较对照组显著上调（AREG基因表达量1.87±0.39 vs.0.93±0.23，AREG、EREG蛋白表达量3.09±0.73 vs.1.11±0.21、1.53±0.19 vs. 0.97±0.23，P均＜0.05）；TF敲低后均可部分阻断FⅦa对两细胞AREG、EREG表达调节作用；EGFR通路激活后，HT-29细胞TF基因表达较对照组无显著变化，FⅦ基因表达未检测到，而LoVo细胞的FⅦ及TF基因表达均较对照组显著上调，表达量分别为1.53±0.23 vs.1.00±0.23、53.20±6.08 vs.1.00±0.15（P均＜0.05）。结论： 结肠癌LoVo细胞TF/FⅦa通路与EGFR通路的活化可分别上调另一通路的关键分子表达并发生交互作用，KRAS基因突变可能对该交互作用的发生发挥关键作用。     

RhoC-shRNA对结肠癌细胞HT-29细胞生物学行为的影响

目的探讨RhoC-shRNA对结肠癌细胞生物学行为的影响。方法构建RhoC-shRNA表达载体,以脂质体转染法将之稳定转染入HT-29结肠癌细胞株,Western blot检测转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况,观察转染前后结肠癌细胞周期、凋亡和侵袭能力的变化。结果成功构建RhoC-shRNA真核表达载体,并且转染入结肠癌细胞后,细胞中RhoC蛋白表达水平明显受到抑制,并且抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,降低肿瘤细胞侵袭能力。结论下调RhoC蛋白的表达可抑制结肠癌细胞HT-29的体外增殖和侵袭能力。     

Survivin shRNA-APC 双基因对结肠癌细胞中 P21 和FHIT 表达的影响

目的 探究Survivin shRNA-APC 双基因共表达稳转株对HT-29 结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤组织 细胞中P21 和FHIT 表达的影响。方法 选取35 只雌性裸鼠分为双基因组、Survivin shRNA 组、APC 组、空 载组及阴性对照组，每组7 只。培养构建成功的Survivin shRNA-APC 双基因共表达稳转株、Survivin shRNA 稳 转株、APC 稳转株、空载稳转株及HT-29 结肠癌细胞，在每只裸鼠右腋下接种相应的细胞悬液复制移植瘤模型。 测量每组瘤重、计算瘤重抑制率；采用免疫组织化学法测定P21 和FHIT 蛋白的表达。结果 所有裸鼠腋下产 生肿瘤。APC 组、Survivin shRNA 组、双基因组P21、FHIT 蛋白表达量较阴性对照组、空载组升高（P <0.05）， 双基因组的蛋白表达量较APC 组、Survivin shRNA 组升高（P <0.05）。APC 组、Survivin shRNA 组、双基因 组的平均瘤重较阴性对照组和空载组降低（P <0.05）。双基因组平均瘤重较APC 组、Survivin shRNA 组降低 （P <0.05）。APC 组、Survivin shRNA 组、双基因组的瘤重抑制率较空载组升高（P <0.05）。双基因组瘤重抑制 率较APC 组、Survivin shRNA 组升高（P <0.05）。结论 Survivin shRNA-APC 双基因共表达稳转株可能通过上 调P21 和FHIT 蛋白的表达来调节细胞周期，抑制细胞增殖，进而抑制肿瘤生长。其抑制细胞增殖效果比Survivin shRNA、APC 单基因稳转株更显著。