嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

嗜肺军团菌mip基因真核表达重组质粒构建与表达

目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1( )转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lvgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达。方法采用PCR方法将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞。结果通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpG中lvgA/CpG克隆片段长为657bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合。用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达。结论本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号。     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达.方法 采用PCR方法 将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆人真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞.结果 通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpC中lvgA/CpC克隆片段长为657 bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7 Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合.用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达.结论 本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号.     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

嗜肺军团菌mip基因重组质粒GFP-mip的构建及表达

目的构建嗜肺军团菌mip基因的真核重组质粒GFP-mip,并观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以嗜肺军团菌DNA为模版,通过PCR扩增获得mip基因,将其定向克隆到绿色荧光质粒pEGFP-C1中,构建真核重组质粒GFP-mip。经限制性核酸内切酶XhoI和BamHI酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,通过脂质体法转染到NIH3T3细胞中,利用荧光显微镜观察重组质粒的稳定表达。结果扩增出了702bpmip基因,在细胞质和细胞膜观察到较强绿色荧光。结论成功构建了真核重组质粒GFP-mip,并在NIH3T3细胞中得到了表达。     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达.方法 以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因.序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况.结果 PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1, 经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和 850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank 序列号NM_000209)序列一致.证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1 中.Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达.     

人PDX-1基因真核表达载体的构建及表达

目的构建人胰十二指肠同源盒(PDX-1)基因的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达。方法以人胰岛细胞瘤cDNA为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增PDX-1基因编码区的全部序列,克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中,经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因。序列正确的重组质粒用脂质体转染NIH3T3细胞,Western blot观察基因表达情况。结果PCR扩增的特异性片段长度为852 bp,以此构建的重组质粒pcDNA3.1-PDX-1,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后显示5.5 kb和850 bp左右的两条片段,测序结果与GenBank中的人PDX-1基因cDNA(GenBank序列号NM_000209)序列一致。证明PDX-1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1中。Western blot证实pcDNA3.1-PDX-1转染NIH3T3细胞24 h后有PDX-1的表达。结论成功构建了pcDNA3.1-PDX-1重组真核表达载体,并在NIH3T3细胞中表达。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

嗜肺军团菌mip基因的原核与真核表达重组质粒的构建

目的　扩增嗜肺军团菌 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒 p L pmip和pc DNA3.1- mip。方法　采用 PCR从嗜肺军团菌扩增得到 mip基因 ,导入载体 p UC18和 pc DNA3.1( ) ,构建重组质粒p L pmip和 pc DNA3.1- mip并转化大肠杆菌 ,用限制性酶切分析、PCR、序列分析进行鉴定。结果　扩增出 82 8bp的 mip基因 ;构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。结论　成功扩增 82 8bp的嗜肺军团菌 Mip基因 ,构建重组质粒 p L p Mip和 pc DNA3.1- mip。     

嗜肺军团菌热休克蛋白60基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建嗜肺军团菌热休克蛋白60(HSP60)基因的真核表达载体pcDNA3.1/HSP60,并对其进行鉴定。方法应用聚合酶链式反应(PCR)技术从嗜肺军团菌扩增得到HSP60基因,并将其克隆至载体pUC18进行序列测定。将重组质粒pUC18/LpHSP60中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组子pcDNA3.1/HSP60,通过限制性内切酶酶切及PCR进行鉴定。结果克隆的LpHSP60基因序列与GenBank公布的一致性为98%,限制性内切酶酶切及PCR分析表明HSP60基因已成功插入pcDNA3.1中。结论成功构建了LpHSP60基因的真核表达载体,为进一步研究军团菌病HSP60基因DNA疫苗奠定了基础。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建及对NIH3T3细胞的转染

目的: 构建pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞.方法: 提取大肠癌细胞株(SW480,Lovo,HT29)mtDNA,扩增D-loop区,产物用DNA自动测序法进行序列分析.利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3. 1( ),并用脂质体法导入NIH3T3细胞.结果: 大肠癌细胞株SW480,Lovo,HT29细胞mtDNA D-loop分别有10,9,8个突变位点.成功克隆1119 kb的mtDNA D-loop区至表达质粒pcDNA3. 1( ),并导入NIH3T3细胞中.结论: 成功构建了pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中.