微生物和免疫学检验面貌一新

在第二届全国中青年学术会议中，临床免疫学检验方面涉及面广，新技术、新方法比较多。(一)组织相容性抗原分型：白求恩医科大学第三临床学院康熙雄等报告的《单倍体相同活体肾移植患者HLA-DNA配型及临床意义》以重组DNA技术和细胞工程学为工具的HLA基因群的分析迅速发展，人们希望能从DNA水平，蛋白水平来解释移植免疫应答机制。至今有关血清学以及细胞学方法的HLA配型和肾移植后的关系，均认为各种抗原越相同移植存活率越高，但临床上也有不少血清学分型所制定为HLA抗原一致的配对，移植后的结果并不理想。     

HLA-A,-B和-Cw测序分型结果的再分析:现有的测序分型结果将来有多少不确定?

分子分型方法能够在基因组水平上检测人类白细胞抗原(HLA)基因多样性,其分型能力远远超过血清学方法.分子分型法的出现带动了被确认的HLA等位基因数的大量增长.这些等位基因的命名及其序列信息存储在免疫遗传学(IMGT)/HLA的数据库中,该数据库能够提供有关HLA等位基因最新的信息[http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla].尽管目前有多种不同的基于DNA的方法可用于HLA分型,例如序列特异性引物(SSP)扩增法和序列特异性寡核苷酸(SSO)杂交法,但测序分型技术(SBT)因为能够直接检测核苷酸序列,被证明是最有效的分型技术.     

HLA-A,-B和-Cw测序分型结果的再分析:现有的测序分型结果将来有多少不确定?

分子分型方法能够在基因组水平上检测人类白细胞抗原(HLA)基因多样性,其分型能力远远超过血清学方法.分子分型法的出现带动了被确认的HLA等位基因数的大量增长.这些等位基因的命名及其序列信息存储在免疫遗传学(IMGT)/HLA的数据库中,该数据库能够提供有关HLA等位基因最新的信息[http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla].尽管目前有多种不同的基于DNA的方法可用于HLA分型,例如序列特异性引物(SSP)扩增法和序列特异性寡核苷酸(SSO)杂交法,但测序分型技术(SBT)因为能够直接检测核苷酸序列,被证明是最有效的分型技术.     

一个HLA-A抗原三联体家庭的分子遗传学研究

目的　研究江苏省骨髓库供者SZHD1及其 4名家庭成员的HLA A抗原HLA三联体表型的分子遗传学基础。方法　使用标准微量淋巴细胞毒试验和特异性单克隆抗体 ,测定淋巴细胞HLA血清学抗原特异性。使用PCR SSP方法作HLA基因分型 ,并进一步采用分子克隆和DNA序列方法分析测定相应的基因结构。结果　供者SZHD1的淋巴细胞带有HLA A2、A11.2和A2 4等 3个抗原。分子克隆和DNA序列分析表明相应等位基因为HLA A 0 2 0 6、A 110 2和A 2 4 0 2 0 10 1。家系调查表明该供者的 1条单体型为HLA A 2 4 0 2 0 10 1,A 110 2 ;B 38;DRB1 15。同一条单体型带有 2个表达的HLA A等位基因 ,该单体型按孟德尔定律分离 ,稳定地传递了 3代。供者的父亲、哥哥、妹妹、及其孩子也带有该单体型。结论　供者SZHD1及其 4名家庭成员的 1条HLA单体型上 ,带有 2个表达的HLA A等位基因 ,该单体型稳定地遗传 ,表现出HLA遗传多态性的一种新形式。HLA A座位表达 3种抗原的家庭为世界上首次报告。     

分子生物学技术在HLA分型中的应用

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen,HLA)是人体重要的免疫遗传体系，在免疫反应和造血干细胞与器官移植中发挥着重要的作用，现代医学的发展和器官移植配型要求的提高，促进了分子生物学与HLA分型的结合，提高了分型的准确性及实用性。本综述了限制性处长度多态性，序列特异性寡核苷酸探针，单链构象多态性，序列特异性引物，流式细胞术，基因芯片，以碱基序列为的HLA分型中的应用及虚拟DNA分析的进展。     

福建省汉族人群HLA-B15组和B40组抗原特异性分布的研究

目的：了解福建省汉族人群HLA—B15组和B40组抗原特异性的分布情况。方法：采用反相PCR—SSO技术做基因分型，并分析各等位基因对应的抗原特异性。结果：171名福建省汉族人中HLA—B15基因频率为0.1257，分属3种抗原特异性，其抗原特异性分布与上海地区人群无显著性差异；HLA—B40基因频率为0.2368，分属3种抗原特异性，其抗原特异性分布与上海地区人群存在显著性差异。结论:福建省汉族人群HLA—B15组和B40组抗原特异性的分布有其自身特点。     

SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12

目的 建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法，对1份已知HLA—DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA—DRB1*12位点检测和分型。结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析，有3份标本为DRB1*12，产物用离心柱纯化后，直接进行DNA测序，结果证实为DRB1*12阳性。结论 SYBR Green Ⅰ PCR操作简便，结果准确，可成为一种HLA基因分型的新方法。     

日本不相关骨髓移植临床效果与HLA基因分型

10多年前HLA抗原分型均采用血清学分型方法,近年来已有多种DNA分型技术被介绍,揭开了HLA抗原的不同核苷酸序列。 日本骨髓供者计划始于1991年。登记在册的供者有130,000人,到目前已完成不相关骨髓移植2000多例。在该计划中用血清学的方法选择检测了骨髓供受者的HLA-A、B和DR位点抗原。在本日本干细胞移植研究中,作者回顾分析了440例无关供者骨髓移植病例,在HLA方面11个多态性抗原位点的DNA配型(HLA-A、B、C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1)和骨髓移植效果。     

中华(江苏)骨髓库人群HLA-Ⅰ类抗原的PCR-SSP分型

目的分析中华(江苏)骨髓库HLAⅠ类抗原的分布特点。方法采用序列特异性引物(PCR SSP)基因分型技术,对中华(江苏)骨髓库初期的骨髓捐献志愿者的HLA A、B位点上的等位基因作低分辨基因分型,计算HLA A、B的基因频率、由基因分型结果指定的抗原特异性频率(以下简称抗原频率)、HLA A、B位点单倍型频率和连锁不平衡参数,获取中华(江苏)骨髓库HLAⅠ类抗原多态性分布的初步资料。结果中华(江苏)骨髓库志愿者中,A位点抗原频率较高的是A2、A11和A24,分别为0.5087,0.3505和0.3056;而A74的频率最低(0.0009);B位点抗原频率较高的是B13、B46和B60,分别为0.2372,0.1772和0.1603,频率较低的是B78(0.0002)。连锁不平衡参数>0的单倍型有80余种,最常见的单倍型有A33B58、A2B62、A2B13、A33B44、A30B13等。结论了解中华(江苏)骨髓库志愿者HLA遗传学分布特点,为器官或干细胞移植配型和疾病相关性分析提供了有价值的基础性资料。     

巨核细胞白血病细胞系HLA-Ⅱ等位基因型的研究

目的 研究巨核细胞(MEG)，白血病细胞系表达人类白细胞抗原ⅡHLA—Ⅱ基因组DNA的等位基因型。提高对该细胞的HLA—Ⅱ基因型的认识。为临床上从分子免疫遗传学水平上探讨巨核细胞白血病发病机理莫定基础。方法 采用分子生物学方法。即：聚合酶链反应—限制性片断长度多态性(PCR—RFLP)技术对MEG白血病细胞系HLA—Ⅱ基因组DNA的等位基因型进行探讨。结果 MEG白血病细胞系的HLA—Ⅱ等位基因型分别是：DRBl：^*1406／^*0410,DQBl：^*0401／^*0401,DPBl：^*0501／^*0501。结论 提高对MEG白血病细胞系HLA—Ⅱ基因型的认识。对今后巨核细胞白血病免疫遗传学的研究具有重要的指导意义。     

6965名汉族骨髓供者HLA多态性分析

目的　分析中国汉族骨髓供者的人类白细胞抗原 (HLA)多态性 ,并寻找和鉴定新的HLA等位基因。方法　采用序列特异性引物聚合酶链反应、DNA测序技术以及分子克隆等以DNA为基础的HLA基因分型技术。结果　共鉴定 6 96 5人份无关汉族骨髓供者的HLA A、B、DRB1座位上的等位基因 ,其中 4 70 7人份为南方汉族个体 ,2 2 5 8人份为北方汉族个体。在受检群体中共检出 72种HLA特异性 ,包括过去很少在汉族人群中被检测到的HLA A2 5、A34、A74、B4 1、B4 2、B5 3、B73、B81等。HLA A、B、DRB1座位上尚未被检测出的空白基因频率分别小于 0 .2 0 % ,0 .2 5 %和 0 .70 %。发现 3个新等位基因 ,已被WHO命名为HLA A 0 2 5 3N ,HLA A 1114和HLA B 5 6 10。结论　在骨髓供者HLA分型中使用以DNA为基础的基因分型技术 ,可以得到精确可靠的基因频率以及发现新的等位基因。一些HLA基因在南北汉族人群中的分布有明显的差异 ,为了能最大限度地募集到带有不同HLA分型的骨髓供者 ,有必要在我国南北多个地区筛选骨髓供者     

改良盐酸胍法提取脐血DNA 用于HLA基因分型

为了比较经典的盐酸胍(Gu·HCl)抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法在提取脐血DNA的效果,探讨这两种方法在脐血组织相溶性抗原(HLA)基因分型中的应用,使用盐酸胍抽提DNA法和改良盐酸胍抽提DNA法提取72例脐血标本的DNA,并分别测定其DNA的浓度和纯度,采用序列特异性引物聚合酶反应方法(PCRSSP)比较这两种方法所提取的DNA.结果表明两种方法提取脐血DNA均获成功;根据对DNA的质量监测发现,用改良盐酸胍抽提DNA在质量上较盐酸胍法好;用于HLA基因分型时,改良盐酸胍抽提DNA法可减少非特异性条带的出现.结论改良盐酸胍抽提DNA法不但操作简便,成本下降,而且在最少血量中能提取出高纯度的DNA,减少非特异性条带的出现.该法完全可以满足脐血库的日常脐血样品DNA的提取以及脐血HLA基因分型的要求.     

应用基因芯片技术进行HLA-A抗原DNA分型

血清学方法是HLA A位点的经典分型方法[1 ] 。血清学之间的交叉反应,尤其是A1 9分裂子之间较强的交叉反应以及淋巴细胞膜抗原的弱表达,常常使分型出现技术上的困难和判断误差,因此HLA A位点的基因分型成为必然趋势。我们在成功研制了DR位点基因分型芯片的基础上[2 ] ,研制了HLA A位点的基因分型芯片并进行了临床验证和应用,现报告如下。材料和方法1　DNA样本　标准DNA包括HLA A 2 0大类,由上海血液中心提供;1 2 0份临床样本由上海市第一人民医院提供。2　引物和分型探针　在HLA A座位的外显子2区域和外显子3区域各设计一对引物,…     

对LABType~SSOP HD试剂的不确定HLA分型结果的分析

目的总结使用LABType～流式磁珠反向杂交法(polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleoti-de probes,PCR-SSOP)高分试剂(high definition,HD)对人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)分型的经验,对其不确定结果进行分析。方法用测序分型(sequencing-based typing,SBT)的方法对SSOP HD试剂HLA分型得到的不确定结果进行验证分析,比较两者之间的差别。结果 2种分型方法在低分水平上是完全一致的,在高分水平上仅1例不符,吻合率为98%,这50份验证样本的SSOP不确定分型结果中,12份样本的SSOP检测结果出现明显的磁珠假性反应,2份为SSOP不能区分的基因型,36份为HLA罕见型。结论用LABType～ SSOP HD试剂进行HLA高分辨分型的结果可靠,对稀有型和调整探针后的结果应进行验证,保证HLA基因分型结果的准确。     

优化聚合酶链反应产物银染测序法鉴定白细胞抗原-DQA1*0102等位基因纯合子

聚合酶链式反应-序列特异引物(PCR-SSP)技术在人类白细胞抗原(HLA)基因分型中被广泛使用。然而，分型过程中常出现“空白基因”而影响整个结果的可靠性。对此，目前多采用DNA测序以确定各等位基因纯合子或存在新突变或结合PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法进行确认。我们用PCR-SSP对109名广西巴马县壮族长寿老人和71名对照组进行HLA-DQA1座位基因分型，发现了33个HLA．DQA1*0102／一个体，经本室优化DNA直接银染测序法测定，确定均为HLA-DQA1*0102／*0102等位基因纯合子，现报告如下。     

反相PCR-SSO技术应用于福建省汉族人群HLA基因多态性研究

自20世纪90年代末期起，以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟，成为目前HLA遗传多态性调查和造血干细胞库HLA分型的主流技术。本研究采用反相PCR-SSO技术对近期在厦门登记的造血干细胞捐献志愿者做HLA-A，B，DRB1基因分型，并对其中171名福建省汉族人的HLA基因多态性进行了分析。     

应用双重耐突变系统放大进行HLA分型

应用多聚酶链反应(PCR)和寡核苷酸探针可对HLA-Ⅱ类抗原DR 等位基因进行准确分型,但后者常需放射性标记,不能普遍用于常规实验室耐突变系统放大(ARMS),虽可使具等位基因特异性的DNA 放大以用于HLA 分型,但单一的ARMS 作引物的单一等位基因特异性放大对HLA 缺乏鉴别作用,而大量的HLA 等位基因需要相当数量的ARMS反应数。应用双重ARMS 进行HLA 分型可提供更强的鉴别能力,通过ARMS 引物使不同HLA 等位基因产生不同长度的PCR 产物,是以将许多不同的等位基因分型。     

骨髓库和脐血库中的HLA分型技术和策略

造血干细胞移植要求供者和患者的人类白细胞抗原(HLA)有最大程度的配合.供者来源包括HLA配合的患者亲属以及无亲缘关系的个体或脐带血.为了找到HLA配合的无亲缘关系供者,自20世纪80年代末起,在世界范围内建立了各种骨髓供者登记(以下简称骨髓库)和脐血库.根据世界骨髓供者联网(BMDW)的统计,目前已有37个国家或地区的48个骨髓库和15个国家的23个脐血库参加该组织.到2001年3月止,登记在册的骨髓供者和脐血总数已超过700万例(http:/www.bmdw.org).在建立骨髓库和脐血库中,都涉及HLA分型的问题.特别是在目前HLA分型技术转向DNA方法的过渡阶段,究竟采用什么样的HLA分型策略显得格外重要.本文将综述目前国际上通用的HLA分型标准,为制定中国骨髓库和脐血库的HLA分型策略提供依据. 1 HLA-DNA分型已取代血清学分型 血清学方法是HLA分型的经典技术,它需要有活力的T和B淋巴细胞,以及特异性明确的HLA分型标准血清.由于HLA抗血清本身的交叉反应,弱反应以及额外反应等特性,造成HLA血清学分型错误率高.美国国家骨髓库(NMDP)在一项大规模研究中,比较了42160例骨髓供者的HLA-AB血清学分型和DNA分型结果,发现血清学方法错误率HLA-A为8%,HLA-B为13%,HLA-A和B为3%,总错误率达24%[1].此外由于淋巴细胞的保存相对比较困难,以及高质量的单价HLA分型血清,特别HLA-DR分型血清来源有限,这些因素导致血清学方法被淘汰.自1996年第12届国际组织相容性讨论会后,以DNA为基础的HLA基因分型技术日趋成熟,并逐渐取代血清学方法.HLA血清学也不再被列入以后的国际组织相容性讨论.     

不同DNA提取方法及Taq酶浓度对人白细胞抗原-B27基因分型结果的影响

目的探讨两种DNA提取方法（加热法、盐酸胍法）及不同浓度Taq酶对人白细胞抗原（HLA）-B27基因分型结果的影响。方法经柠檬酸右旋糖液抗凝的全血7人份，对比用加热法和盐酸胍法提取的DNA进行HLA—B27基因分型效果的差别；选取上述阴、阳性标本各1份，以Taq酶作浓度梯度试验，用浓度分别为每50微升0．3、0．6、1．2、2．4、4．8、7．2U6个梯度进行对比试验，摸索出HLA-B27基因分型试验中所需的最佳Taq酶浓度。结果用盐酸胍法所提取的DNA在HLA—B27基因分型实验中能达到很好的效果，而加热法的内对照不清晰。Taq酶浓度在0．3U／50μL时条带不清晰，在7．2U／50μL时阴性标本易产生非特异性条带。结论盐酸胍法提取DNA优于加热法。不同实验室应根据自身条件确定最佳反应条件及Taq酶浓度。     

组织分型技术及其实际应用

近二十年来,随着移植免疫学的发展,人们对组织相容性抗原与器官及组织移植的关系的重要性已有深刻的认识,人类红细胞的 ABO 抗原系统和 HLA(Human Leuco-cyte A)抗原系统已被确认为两大主要的组织相容性抗原。用组织分型技术来鉴定人类HLA 抗原已被广泛应用,并有了很大发展。随着免疫学的进展,组织分型技术的应用早