非小细胞肺癌端粒酶活性与端粒酶RNA、端粒酶催化亚单位的相关性及其意义

目的 探讨非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC)端粒酶活性（telomerase activity,TA)、端粒酶RNA（telomerase RNA,hTR）端粒酶催化亚单位（telomerase catalytic subunit,hTRT/hEST2)编码基因的表达,彼此间相关性及其预后意义。方法 TRAP－PCR（telomerase repeat amplification protocol PCR)检测TA,RT－PCR检测hTR,原位杂交检测hTRT/hEST2mRNA表达。结果 非小细胞肺癌TA、hTR和hTRT/hEST2 mRNA阳性率分别为68．4％（26／38）、55．2％（32／58）和74．1％（43／58）,TA与hTRT/hEST2阳性相关（r=0.84,P=0.01),与hTR无相关性（r=0.16,P=0.23）。低分化以及有淋巴结或远处转移者TA及hTRT/hEST2阳性率增高;TA及hTRT/hEST2阳性组中位生存期（10．4个月,7．5个月）低于阴性组（13．5个月,14．7个月;P＝0．074,P＝0．01）,hTR阳性组中位生存期（12．9个月）略高于阴性组（11．5个月,P＝0．23）,仅hTRT/hEST2阳性与阴性组生存期差异有显著性;多因素Cox回归分析hTRT/hEST2对生存期有影响。结论 非小细胞肺癌TA、hEST2阳性与阴性组生存期差异有显著性;多因素Cox回归分析hTRT/hEST2对生存期有影响。结论 非小细胞肺癌TA、hTR和hTRT/hEST2表达高于癌旁正常组织;hTRT/hEST2够能反应TA活性,二者为NSCLC恶性表型增高的标志;hTRT/hEST2具有独立的预后意义。     

端粒酶催化亚单位和c-myc在骨肉瘤中的表达

目的:探讨端粒酶催化亚单位和c-myc在骨肉瘤发生中的作用。方法:应用免疫组织化学方法检测60例骨肉瘤、12例骨软骨瘤中端粒酶催化亚单位和c-myc的表达,采用显微图像分析系统进行平均灰度值测定。结果:骨肉瘤中端粒酶催化亚单位和c-myc蛋白的平均灰度值均低于骨软骨瘤中两者的平均灰度值,且有统计学意义(P<0.01)。骨肉瘤中端粒酶催化亚单位与c-myc蛋白平均灰度值间无相关性(P>0.05)。结论:端粒酶催化亚单位、c-myc蛋白分别与骨肉瘤的发生有关。     

人端粒酶催化亚单位及其相关蛋白在骨肿瘤中的表达

目的：研究骨肿瘤中端粒酶相关基因中,人端粒酶催化亚单位（human elomerase catalytic subunit,hTERT)和人端粒酶相关蛋白（human telomerase associated protein,TP1)两个重要成分的表达及对评估肿瘤良、恶性的意义。方法：提取50例手术切除骨肿瘤组织、2种人成骨内瘤细胞系Saos－2、OS732和原代培养人成骨细胞的总RNA。用一步RT－PCR方法检测hTERT和TP1mRNA的表达。结果：所有骨肿瘤标本及细胞系均检测到TP1的表达。hTERT在17例良性骨肿瘤、33例骨肉瘤、2种人成骨肉瘤细胞系和人成骨细胞的表达率分别为64．7％、57．6％、0％和0％。良、恶性肌肿瘤间hTERT表达的差异不具有显著性（P＞0．05）,不同分化程度骨肉瘤间hTERT表达的差异也不具有显著性（P＞0．05）。结论：一步RT－PCR是检测端粒酶亚单位的有效方法。hTERT和TP1表达水平的上调在骨肿瘤恶性进展中可能不起主要作用,在骨肿瘤发展和维持中可能有替代性（ALT）机制导致细胞永生化。     

化学合成siRNA对宫颈癌细胞SiHa中E6基因表达的抑制作用

背景与目的宫颈癌的发生发展与人乳头瘤病毒(human papilloma virus)HPV16 E6、E7癌基因密切相关,人们曾采用核酶或E6、E7反义寡核苷酸抑制其表达,然而,上述两种方法存在费时、费力、抑制效率不高和维持时间短的问题.本研究拟探讨化学合成siRNA对HPV16阳性SiHa细胞E6基因表达的抑制作用以及对靶细胞的影响.方法化学合成3条靶向HPV16 E6基因的siRNA,用脂质体法转染SiHa细胞,同时设立脂质体对照.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测siRNA作用后E6 mRNA水平的变化;应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、流式细胞技术(FCM)、免疫组化以及透射电镜技术(TEM)分别对细胞增殖活性、细胞周期、p53蛋白水平以及细胞超微结构的改变进行检测分析.结果3条siRNA均能有效抑制E6 mRNA的转录表达,以siRNA1作用效果最为明显.MTT检测结果显示20、50和80 nmol/L终浓度转染后细胞增殖活性均有所下降,其中以50 nmol/L转染时增殖活性下降最明显.流式细胞术检测结果显示转染后G0/G1期细胞数占生长周期细胞数的比例增多,即表现为G1期阻滞,S期细胞的比例降低;免疫组化法检测对照组细胞P53蛋白灰度平均值为0.43±0.03,转染72 h后细胞p53蛋白灰度平均值为0.75±0.06,差异有显著性(P〈0.05);转染72 h后透射电镜下可见细胞细胞质浓缩,胞质中出现空泡.结论化学合成siRNA可有效沉默SiHa细胞E6基因的转录表达,进而导致细胞生物学行为的改变.     

榄香烯乳对白血病细胞作用的研究

以体外培养的白血病细胞株Ｋ５６２、Ｌ１２１０为靶细胞，观察了榄香烯乳对白血病细胞扔作用，结果显示榄香烯乳对白血病细胞具有明显抑制作用，并可降低ＤＩ和ＰＩ，对正常外周血单个核细胞的影响较小。     

榄香烯乳对白血病细胞作用的研究

以体外培养的白血病细胞株Ｋ５６２、Ｌ１２１０为靶细胞，观察了榄香烯乳对白血病细胞的作用，结果显示榄香烯乳对白血病细胞具有明显抑制作用，并可降低ＤＩ和ＰＩ，对正常外周血单个核细胞的影响较小。     

消癌平联合榄香烯抑制HeLa细胞增殖和对Bcl-2表达的影响

目的:探讨中药消癌平和榄香烯注射液抑制宫颈癌细胞HeLa增殖作用及其作用机制.方法:取对数生长期的HeLa细胞接种于96孔培养板(细胞数为3×104/孔,100μl/孔),加入不同浓度的消癌平、榄香烯注射液及其混合液,收集不同处理组作用72h的HeLa细胞,通过细胞增殖抑制试验测定吸收度A值.结果:消癌平和榄香烯25～400μg/ml作用72h对HeLa细胞体外增殖有显著的抑制作用,呈剂量依赖性.消癌平及榄香烯各100μg/ml联合作用72h对HeLa细胞体外增殖有显著的抑制作用,呈剂量依赖性,且明显高于榄香烯或消癌平单药作用.消癌平和榄香烯在抑制肿瘤细胞增殖时均伴随有Bel-2蛋白水平表达的下调.结论:中药消癌平和榄香烯注射液联合应用抑制HeLa增殖作用优于单药,其机理可能与Bel-2基因下调有关.     

榄香烯对胶质瘤细胞U251的作用机制

目的从细胞水平和分子水平探讨榄香烯对胶质瘤细胞的作用机制。方法取胶质细胞瘤的U251细胞株做体外培养,四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测榄香烯对人神经胶质瘤细胞U251的增生抑制作用,流式细胞术（FCM）检测细胞周期、细胞内钙离子（IECa^2＋）含量、Fas、bcl-2、增生细胞核抗原（PCNA）蛋白表达及细胞凋亡。结果榄香烯能有效抑制胶质瘤细胞U251的恶性增生,MTT法检测榄香烯处理不同时间（24、48、72h）的半数生长抑制剂量（IC50）,24、48、72h其IC50分别为40．60、38．14、34．35μg／ml。经榄香烯作用后,细胞周期可阻滞在S期和G2／M期。用异硫氰酸胍荧光素（Annexin V FITC）染色检测发现细胞凋亡率明显增加。榄香烯还可下调PCNA、Fas蛋白的表达,上调细胞内Ca^2＋（IECa^2＋）含量,对bcl-2蛋白表达无显著影响。结论榄香烯有显著的抗胶质瘤细胞增生作用,并能通过下调PCNA蛋白的表达,上调细胞内Ca^2＋含量,诱导细胞凋亡,对Fas表达也有影响,可能与bcl-2基因表达无关。     

人端粒酶催化亚单位和c-myc蛋白在胃癌及癌前病变中的表达及意义

目的:探讨人端粒酶催化亚单位(human telomerase catalytic subunit,hTERT) 和c-myc蛋白在胃癌和胃癌前病变中的表达及意义.方法: 应用免疫组织化学技术检测71例慢性胃炎和胃癌中hTERT和c-myc蛋白的表达,其中慢性胃炎伴萎缩者18例,伴肠化生者16例,伴中、重度不典型增生者16例,胃癌21例.结果: hTERT 和 c-myc蛋白的表达率在胃癌组织中均高于不典型增生、肠化生和萎缩性胃炎组织(P<0.05);在不典型增生组织中均显著高于肠化生、萎缩性胃炎组织(P<0.05);在肠化生组织中均显著高于萎缩性胃炎组织(P<0.05).hTERT蛋白表达率在c-myc蛋白阳性患者中显著高于c-myc蛋白阴性患者(P<0.01).结论: hTERT与c-myc蛋白在胃癌发生发展过程中,均可能发挥重要作用,对胃癌的发生、发展起促进作用,c-myc表达增加可能是胃黏膜上皮细胞端粒酶激活的重要机制之一.     

榄香烯乳对大鼠胃粘膜癌变c-myc基因表达及端粒酶活性的影响

目的：探讨榄香烯乳对大鼠胃粘膜癌变发生发展中c-myc基因表达及端粒酶活性的影响。方法：采用MNNG、10％NaCl混合液加酒精灌胃建立大鼠胃癌模型，设立正常组、模型组及榄香烯组，榄香烯组在造模过程中采用榄香烯乳干预。30周后，分别采用原位杂交、免疫组化及端粒酶微孔板杂交法检测大鼠胃粘膜c-myc基因mRNA、蛋白表达及端粒酶活性。结果：榄香烯组癌变发生率低于模型组。c-myc基因表达与端粒酶活性随着胃粘膜癌变的发展呈递增趋势，并且二者具有高度相关性。结论：下调c-myc基因表达，抑制端粒酶活性，是榄香烯乳重要的抗癌机制之一。     

Hypermethylation of the human telomerase catalytic subunit (hTERT) gene correlates with telomerase activity

DNA methylation is an epigenetic process involved in embryonic development, differentiation and aging. It is 1 of the mechanisms resulting in gene silencing in carcinogenesis, especially in tumor suppressor genes (e.g., p16, Rb). Telomerase, the DNA polymerase adding TTAGGG repeats to the chromosome end, is involved in the regulation of the replicative life span by maintaining telomere length. This enzyme is activated in germ and stem cells, repressed in normal somatic cells and reactivated in a large majority of tumor cells. The promoter region of the hTERT gene, encoding for the catalytic subunit of human telomerase, has been located in a CpG island and may therefore be regulated at least in part by DNA methylation. We analyzed the methylation status of 27 CpG sites within the hTERT promoter core region by methylation-sensitive single-strand conformation analysis (MS-SSCA) and direct sequencing using bisulfite-modified DNA in 56 human tumor cell lines, as well as tumor and normal tissues from different organs. A positive correlation was observed among hypermethylation of the hTERT promoter, hTERT mRNA expression and telomerase activity (p < 0.00001). Furthermore, this correlation was confirmed in normal tissues where hypermethylation of the hTERT promoter was found exclusively in hTERT-expressing telomerase-positive samples and was absent in telomerase-negative samples (p < 0.00002). Since tumor tissues contain also nonneoplastic stromal elements, we performed microdissection to allow confirmation that the hTERT promoter methylation truly occurred in tumor cells. Our results suggest that methylation may be involved in the regulation of hTERT gene expression. To our knowledge, this is the first gene in which methylation of its promoter sequence has been found to be positively correlated with gene expression.     

贲门癌端粒酶活性表达及与p53基因突变关系的研究

Objective: To study the relationship of the telomerase activity and the p53 gene mutation in cardiac cancer.Methods: Telomerase activity and the p53 gene mutation were detected in 46 case of cardiac cancer, peri-cancerous and 30 case of normal mucosa by TRAP-ELISA and PCR-SSCP. Results: The rate of expression of telomerase activity in cardiac cancer, peri-cancerous and normal mucosa were 82.61％ (38/46), 43.48％ (20/46) and 13.33％ (4/30) respectively. The rate of Exon5→8 of p53 gene mutation were 39.13％ (18/46), 4.35％ (2/46) and 0.00％ respectively. There was significant differ ence between group cancer and without cancer (P ＜ 0.01). Mean of (A) value of telomerase is 1.89 ± 0.41 in cancer group and were 1.49 ± 0.43, 0.54 ± 0.45 respectively in peri-canvcerous and normal mucosa, there were significant differences in cancer group and group of without cancer (P ＜ 0.05). The rate of p53 gene mutations in group of expression of telomerase activity was 44.74％ (17/38), and 12.50％ (1/8) in without expression of telomerase activity. There were significant differences between the two groups. Conclusion: The rate of expression of telomerase activity and mean of (A) value of telomerase in cardiac cancer were obviously higher than without cancer, which indicating telomerase activity was closely related with the occurrence of cardiac cancer. P53 gene mutation in cardiac cancer were higher than the tissue of without cancer, and the rate of p53 gene mutation in telomerase activity were obviously higher than the group of without cancer. This shows the p53 gene mutation can loss of function of suppressing cancer and prompt telomerase activity and cause the cardiac cancer.     

端粒酶催化亚基hTERT在肿瘤治疗中的研究进展

人端粒酶催化亚基hTERT基因转录的从头激活是端粒酶活化的限速步骤，受到多种癌基因和抑癌基因产物的精密调控。构建hTERT启动子调控抗肿瘤基因的逆转录病毒载体，使抗肿瘤基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞内定向表达，有望用于肿瘤基因治疗。本文首先简单介绍了hTERT蛋白的结构和表达调控机制，然后对其在肿瘤发生发展中的生物治疗的功能作一简要综述。     

Repression of the telomerase catalytic subunit by a gene on human chromosome 3 that induces cellular senescence

The cellular senescence program is controlled by multiple genetic pathways, one of which involves the regulation of telomerase and telomere shortening. The introduction of a normal human chromosome 3 into the human renal cell carcinoma cell line RCC23 caused repression of telomerase activity, progressive shortening of telomeres, and restoration of the cellular senescence program. We attributed the repression of telomerase activity to the marked downregulation of the gene encoding the catalytic subunit of telomerase (hEST2/hTRT) but not another protein component (TP1/TLP1) or the RNA component of telomerase. These results suggest that a senescence-inducing gene on chromosome 3 controls hEST2/hTRT gene expression either directly or indirectly and support the notion that hEST2/hTRT is the major determinant of telomerase enzymatic activity in human cells. Mol. Carcinog. 22:65–72, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc. This article is a US Government work and, as such, is in the public domain in the United States of America.     

HPV E6,p53与宫颈癌的关系及其在基因治疗中的应用

目前宫颈癌的发病率仍居全世界妇女常见恶性肿瘤的第二位.高危型人乳头瘤病毒（high-risk Human Papillomavirus,HR-HPV）感染是宫颈癌及其癌前病变最主要的诱因之一.抑癌基因p53能够有效地抑制细胞增殖和促进细胞凋亡,人类近半数的肿瘤都与p53基因的突变和失活有关,HPV E6蛋白降解p53蛋白,是宫颈癌发生的前提.选择性杀伤p53功能缺失的肿瘤细胞,同时保护正常细胞,发展HPV疫苗及联合用药是临床肿瘤免疫学家进行宫颈癌基因治疗的目标.     

端粒酶逆转录酶、P53、PCNA在非小细胞肺癌的表达及意义

目的　探讨端粒酶逆转录酶、P5 3、PCNA在非小细胞肺癌组织及癌旁正常组织中的表达及其关系。方法　取自手术切除及肺穿刺经病理证实为肺癌组织标本 6 0例 ,采用免疫组化法检测人端粒酶逆录酶、P5 3、PCNA的表达 ,并取癌旁肺组织 10例作对照。结果　肺癌组织中端粒酶逆转录酶、P5 3、阳性率分别为78 3% ( 4 7/6 0 )和 5 3 3% ( 32 /6 0 ) ,PCNA的指数为 5 8 6 3± 10 6 1。癌旁组织依次为 0 % ( 0 /10 ) ,10 % ( 1/10 )和30 3± 7 3,(P <0 0 1) ;在鳞癌中的表达依次为 72 7% ,5 1 5 % ,5 7 78± 10 6 8;在腺癌中的表达依次为88 2 % ,5 2 9% ,5 9 18± 11 4 7;在腺鳞癌中依次为 80 % ,6 0 % ,6 1 2± 10 6 7,(P >0 0 5 )。临床分期的关系为 :Ⅰ期依次为 71% ,35 5 % ,5 5 74± 10 71;Ⅱ期为 87 5 % ,70 8% ,5 9 79± 9 14 ;Ⅲ期为 80 4 % ,80 1% ,71 6±7 31 (P <0 0 1)。在淋巴结转移阳性病例中表达为 89 7% ,6 0 9% ,6 1 72± 9 74 ;在淋巴结转移阴性病例中为 6 7 7% ,38 7% ,5 5 74± 10 71,(P =0 0 2 8) ;病理分化较高组织中的表达为 70 4 % ,2 9 6 % ,5 5 6 3± 9 72 ,分化中等的为 84 2 % ,6 8 4 % ,5 8 2 6± 10 2 6 ,分化较低的组织中为 85 7% ,78 6 % ,6 4 93± 10 7