恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的在大肠杆菌中表达恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)与谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,测定重组蛋白的免疫活性。方法采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫(海南株)GDH基因,双酶切后克隆入pGEX-4T-1载体中进行诱导表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,并用琼脂双向扩散法检测效价,ELISA、Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果获到了重组表达的抗原蛋白,表达产物能与鼠抗恶性疟原虫血清发生特异反应,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,免疫琼脂扩散法检测抗体滴度为1∶16。结论恶性疟原虫GDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性的鉴定

目的 在大肠杆菌中表达间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白,对重组蛋白进行纯化并测定其免疫活性.方法 将构建的LDH/pGEX-4T-1重组菌BL21接种于LB培养基中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白的表达,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清,ELISA检测血清效价,Western-blotting鉴定其免疫活性.结果 重组质粒在大肠杆菌中表达PvLDH与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在,经复性、纯化后免疫小鼠,能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,ELISA法测效价为1:51200,Western-blotting结果显示该血清能特异性与间日疟和恶性疟患者全血发生反应,而不能与正常人起交叉反应.结论 PvLDH在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性.     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

OBJECTIVE: To prepare a monoclonal antibodies (mAbs) against glutamate dehydrogenase (GDH) of Plasmodium falciparum (FCC1/HN strain) and establish colloidal gold-immunochromatographic assay (GICA) for diagnosis of Plasmodium falciparum malaria. METHODS: Recombinant GDH was used to immunize Balb/C mice and the mAbs against GDH were prepared using hybridoma technique followed by identification of IgG isotype and its affinity. Protein-G affinity chromatography was employed to purify the antibodies, which were labeled with colloidal gold for establishment of GICA for Plasmodium falciparum detection. RESULTS: Six mAbs were obtained and identified as IgG1(kappa) of IgG isotypes with affinity constants (Kaff) ranging from 1 x 10(-8) to 2.8 x 10(-10). GICA had a sensitivity of 86.66%; and specificity of 96.43%; for Plasmodium falciparum detection compared with routine microscopic examination. CONCLUSION: The established GICA is rapid and accurate for Plasmodium falciparum detection with such potential utility as for instant diagnosis of Plasmodium falciparum malaria.     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的 建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法 将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH／pGEX—4T—1转化到宿主菌BL21，该GDH／GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达，经SDS—PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂／去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8mol／L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性，并通过浊度分析、非还原SDS—PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH／GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果 经SDS—PAGE分析表明，GDH／GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25％左右；浊度分析表明：稀释复性法优于其它两种方法，同时20mmol／L，Tris—HCI、1mmoH，EDTA、pH8．5及GSSG／GSH=1：10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件，其复性回收率可达90％以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论 通过稀释复性，二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH／GST融合蛋白。     

抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶单克隆抗体的研制与胶体金免疫层析方法的建立

目的 制备抗恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)的单克隆抗体(McAb),将其标记胶体金,建立一种诊断恶性疟的胶体金免疫层析方法。方法 用基因重组的GDH蛋白免疫Balb/C小鼠,采用杂交瘤细胞技术制备McAb,测定其免疫球蛋白亚类及其亲和力。用protein-G亲和层析纯化抗体并用胶体金标记,建立胶体金免疫层析方法,选择最佳反应模式对疟疾血样进行检测。结果 筛选出6株能稳定分泌抗GDH单克隆抗体的杂交瘤细胞株,单抗亚类均为IgG₁,亲和常数(κ)介于1×10^-8~2.82×10^-10。以镜检法为参照,建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟的敏感性为86.66%,特异性为96.43%。结论 建立的胶体金免疫层析方法检测恶性疟快速、简便、可靠,有望开发成为恶性疟快速诊断试剂盒。     

重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶的纯化及免疫活性测定

目的:研究恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)重组蛋白纯化和复性的最佳条件。方法:重组质粒PGEX-4T-1-LDH在E.coli BL21中表达，表达产物用酶裂解法洗涤、变性、复性、Q-Sepharose High Performance离子交换层析方法纯化。结果:获得具有生物活性的蛋白，其纯度达到95％。结论:此方法操作简便，纯化效果好。     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶活性的初步检测

以３－乙酰吡啶（ＡＰＡＤ）作为辅酶而设计的数量酶比色法检测恶性疟原虫乳胶脱氢酶活性。结果显示：ＰＬＤＨ的ＯＤ值随恶性疟原虫率的提高而明显升高,特别是当原虫率达１％以上时,ＰＬＤＨ的ＯＤ值更显著,但在低原虫率（０．４％以下）时,阳性血样与阴性血样ＯＤ值有时错位或不能区别。同时显示,同样的原虫率血样裂殖体（Ｓ）和大滋养体（Ｔ）期比环状体（Ｒ）期ＰＬＤＨ的ＯＤ值明显升高。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。     

用乳酸脱氢酶为靶分子的免疫层析技术检测恶性疟原虫

目的建立一种免疫胶体金层析(GICA)法用于恶性疟原虫的检测。方法采用杂交瘤技术制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDHpf)单抗，利用筛选出来的单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，以镜检和PCR法为对照，用GICA条检测门诊“四热”病人血样，评价其敏感性和特异性，并对其稳定性进行了初步研究。结果筛选出4株抗LDHpf单抗．间接ELISA表明4株单抗仅与恶性疟原虫发生反应，而与间日疟原虫、红细胞蛋白、刚地弓形虫和日本血吸虫不发生交叉反应。Western—blot结果显示4株单抗能识别恶性疟原虫相对分子质量约为33000处的虫源蛋白。以镜检法和PCR法为标准，CICA条检测恶性疟原虫的敏感性分别为88.37％和86．67％．DICA与镜检法的符合率均为91．55％。结论GICA检测恶性疟原虫简易快速、灵敏度高，无需特殊仪器设备，有望成为一种恶性疟原虫快速免疫诊断试剂盒。     

用长距PCR法构建恶性疟原虫cDNA表达文库

目的 构建恶性疟原虫cDNA表达库。方法用Trizol试剂盒提取总RNA，以经修饰的SMART寡聚核昔酸引物－CDSⅢ引物直接用总RNA选择性地反转录成单链cDNA，再用长距PCR(LD)方法选择性地扩增出双链cDNA，经蛋白酶K消化和酶切后，用玻璃奶试剂盒回收200bp以上DNA片断，经与载体λTeiplEX2连接和蛋白抽提物体外包装，构建成cDNA库并对库进行了初步的鉴定。结果 构建了高滴度，高重组率的恶性疟原虫cDNA表达库。结论 所构建的疟原虫cDNA库适合进一步筛选抗疟原虫药物结合蛋白基因。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

【目的】构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒 ,并检测在大肠杆菌BL2 1/DE3中的表达情况。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因 (Pf332 )片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定。用DNAstar软件对FCC1/HN株与 3D7株Pf332的P332 R1、P332 R2片段进行同源性比较。由IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达重组蛋白。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,大小分别为 489、42 9和 393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pGEX P332 R0、pGEX P332 R1、pGEX P332 R2重组质粒。序列分析结果显示 ,与 3D7株相比 ,FCC1/HN株P332 R1、P332 R2片段编码多肽分别缺少 2、4个相应的重复单元。在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达出 3个重组蛋白 ,相对分子质量分别为 46、44和 42。【结论】扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并在大肠杆菌BL2 1/DE3中成功表达。FCC1/HN株与 3D7株的P332 R1、P332 R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。