呼吸道合胞病毒跨膜蛋白研究进展

呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)属副粘病毒科肺病毒属,是引起小儿病毒性肺炎最常见的病原,其跨膜蛋白包括融合性F蛋白、吸附性G蛋白和小疏水SH蛋白,它们在病毒的吸附、穿入中具有重要作用,F和G蛋白还是刺激机体免疫应答的主要抗原,因此在疫苗研制中具有重要意义.     

细胞因子在RSV感染中的作用与机制研究进展

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是属于副粘病毒科的一种单股、负链RNA病毒,是引起婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病原体。近年的研究表明,细胞因子和趋化性细胞因子在RSV感染性疾病的发病机制以及机体的免疫应答中具有重要作用,Th1-和Th2-型细胞因子模式决定机体抗RSV感染免疫应答类型,细胞因子表达谱影响疾病发病机制和慢性程度。因此,了解RSV感染中细胞因子表达的调节机制,有助于采取预防措施控制RSV疾病的发生和发展。本文论述了细胞因子和趋化性细胞因子在抗RSV感染应答中的作用,以及细胞因子信号抑制(suppressor of cyto-kine signaling,SOCS)蛋白在调节这些免疫应答中的潜在作用。     

呼吸道合胞病毒F蛋白研究进展

人呼吸道合胞病毒（RSV）融合蛋白（F蛋白）为病毒表面结构蛋白,可以刺激机体产生保护性抗体和细胞免疫反应。因此对F蛋白的深入研究将有助于了解病毒感染的机理,从而为研究RSV的免疫机理、研制特定部位的亚单位或多肽疫苗提供帮助。     

细胞因子IL-27和CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组蛋白疫苗免疫效果的影响

目的研究细胞因子佐剂IL-27单独或与CpG2216佐剂联合使用对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗免疫效果的影响。方法将编码IL-27的质粒(以下简称IL-27)单独或与CpG2216佐剂作为联合佐剂与G1F/M2共免疫Balb/c小鼠3次,每次免疫10 d后取血,分离血清,用间接ELISA法测定3次免疫后的血清IgG抗体效价以及末次IgG1、IgG2a抗体效价。第3次免疫后2周处死小鼠,取脾细胞,用LDH法检测CTL活性、ELISPOT法检测分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞水平、流式细胞仪检测CD4~+、CD8~+的效应记忆和中央记忆T细胞。结果 ELISA结果表明:除PBS组外,各组均诱导了高水平的IgG抗体无显著性差异(P0.05),IgG2a、IgG1分别为Th1和Th2型抗体,IL-27+G1F/M2组、IL-27+CpG2216+G1F/M2组IgG2a和IgG1的比值明显高于其他组,说明IL-27作为佐剂对G1F/M2所诱导的体液免疫应答无增强作用但可以调节免疫应答的类型,使免疫应答更平衡;CTL杀伤实验显示:IL-27~+CpG2216+G1F/M2组的CTL杀伤活性显著高于其他各组(P0.05);ELISPOT结果显示:IL-27~+CpG2216+G1F/M2组中分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于其他组分泌IFN-γ的淋巴细胞数量,且各组分泌IFN-γ的淋巴细胞数量显著高于同组分泌IL-4的淋巴细胞数量(P0.05),即均诱导了Th1型优势应答;流式细胞仪检测结果说明IL-27+G1F/M2组和IL-27~+CpG2216+G1F/M2组均能诱导产生大量的CD44~+CD62L~+双阳性细胞。结论细胞因子佐剂IL-27和CpG2216佐剂联合使用可以增强吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答而且IL-27对Th1型优势应答具有调节作用。     

RSV CTL表位与G蛋白片段的融合表达对G蛋白片段诱导的免疫应答的调节作用

目的：观察呼吸道合胞病毒（RSV）的CTL表位F/M2与G蛋白抗原活性片段G1融合表达后，对G1诱导的免疫应答的调节作用。方法：将重组表达质粒pET-DsbA-G1和pET-DsbA-G1F/M2分别转化E.coli BL21（DE3），诱导表达融合蛋白DsbA-G1和DsbA-G1F/M2，亲和层析纯化。取上述蛋白，腹腔注射免疫BALB/c小鼠，定期采集血清和脾细胞，用MTT法测定CTL杀伤活性，ELISA测定IgG及其亚类IgG1和IgG2a抗体滴度，空斑抑制实验检测血清中和抗体。结果：经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白；DsbA-G1F/M2诱导了显著的RSV特异性CTL杀伤活性，而无CTL表位的DsbA-G1则不能诱导产生CTL反应；DsbA-G1F/M2和DsbA-G1均刺激产生了强烈的IgG抗体应答，但DsbA-G1所产生的IgG亚类仅为IgG1，而DsbA-G1F/M2同时诱导了高滴度的IgG1和IgG2a，显著下调了IgG1与IgG2a的比例；二者均诱导了高滴度的中和抗体，但与DsbA-G1相比，DsbA-G1F/M2所诱导的中和抗体滴度有所减弱。结论：CTL表位F/M2与G蛋白片段G1的融合表达产物DsbA-G1F/M2，能够同时诱导细胞免疫和体液免疫应答，CTL的激活下调了IgG1与IgG2a的比例，使得免疫应答更平衡，有利于改善该候选疫苗的安全性。     

HSPs对呼吸道合胞病毒重组蛋白抗原免疫应答的调节作用

目的考察热休克蛋白HSP70对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白抗原G1F/M2免疫应答的调节作用。方法构建并表达了Javelin-G1F/M2重组蛋白,在G1F/M2的N端引入Javelin序列,通过该序列可以实现重组蛋白与HSP70蛋白高亲和力结合。以HSP70:Javelin-G1F/M2复合物等免疫Balb/c小鼠,用乳酸脱氢酶释放法测定CTL活性,ELISA法测定IgG及其亚型IgG1和IgG2a抗体滴度,空斑抑制实验测定血清中和抗体。结果经表达和纯化获得了纯度达90%以上的融合蛋白;皮下免疫HSP70:Javelin-G1F/M2复合物可诱导高滴度的IgG抗体和强的CTL应答,其抗体滴度和CTL应答强度均优于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫。HSP70:Javelin-G1F/M2复合物在诱导中和抗体方面与Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫基本相当。HSP70:Javelin-G1F/M2复合物可以诱导更强的IgG2a应答,IgG的亚型IgG1/IgG2a的比值明显低于Javelin-G1F/M2加铝佐剂腹腔免疫组和单独Javelin-G1F/M2皮下免疫组。结论 HSP70可能通过增强CTL应答进一步纠正Th2型优势应答,使得Th1/Th2应答更加平衡。     

呼吸道合胞病毒样颗粒疫苗制备及免疫效果研究

目的利用昆虫表达系统表达以流感病毒基质蛋白M1为骨架制备的嵌合呼吸道合胞病毒(RSV)融合蛋白F和表面糖蛋白G蛋白的呼吸道合胞病毒样颗粒(RSV-F/G VLPs)疫苗候选株,并滴鼻免疫Balb/c小鼠,评价其免疫原性与免疫保护性。方法通过基因重组技术制备以流感基质蛋白M1为骨架,并嵌合RSV F/G蛋白的RSV-F/G VLPs,经超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化VLP,滴鼻免疫Balb/c小鼠,检测血清抗体IgG、IgG1、IgG2a,黏膜sIgA效价以及细胞因子IL-4、INF-γ等,评价候选疫苗的免疫原性;二免后2周RSV A2株攻毒,通过检测小鼠体质量变化,肺病毒载量及肺病理切片来评价候选疫苗的免疫保护性。结果成功制备了RSV-F VLPs、RSV-G VLPs疫苗抗原,动物实验结果证实,候选疫苗株RSV-F/G VLPs可刺激机体产生特异性Th1型细胞免疫及黏膜免疫;攻毒实验结果表明候选疫苗株RSV-F/G VLPs针对RSV A2株的攻击可以产生一定的保护效果。结论成功制备了RSV-F VLPs、RSV-G VLPs候选疫苗抗原,并通过动物实验证明RSV-F/G VLPs具有良好的免疫原性和免疫保护性,为发展新型RSV疫苗提供实验依据。     

表达呼吸道合胞病毒G蛋白胞外区的重组H1N1流感病毒单剂滴鼻免疫可在小鼠诱导强免疫应答与保护

目的基于重组流感病毒载体的呼吸道合胞病毒(RSV)疫苗的构建及在小鼠体内的免疫保护效果评价。方法构建并拯救表达RSV A2型G蛋白胞外结构域(Gecto)的重组甲型流感病毒, 将其命名为PR8NAGecto/WSN。体外验证重组病毒G蛋白表达与病毒生长动力学后, 单剂滴鼻免疫BALB/c小鼠, 并评价体液免疫、黏膜免疫与细胞免疫。免疫4周后, 分别用RSV A2与RSV B9320进行攻毒, 通过小鼠体重变化、肺组织病毒滴度及病理评价免疫保护效果。结果单剂滴鼻免疫PR8NAGecto/WSN能在小鼠体内产生较强的体液免疫、黏膜免疫及细胞免疫。与对照组比较, 免疫组小鼠经RSV A2或B9320两个亚型病毒攻毒后肺病毒载量与肺组织病理均明显改善。结论单剂滴鼻免疫重组PR8NAGecto/WSN疫苗可在小鼠体内诱导较强的RSV特异免疫应答与攻毒保护。本研究为新型RSV黏膜疫苗的研发提供新的思路与实验资料。     

CpG ODN佐剂对呼吸道合胞病毒重组疫苗诱导的细胞免疫应答的作用

目的:研究CpG2216佐剂对呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白疫苗诱导的细胞免疫应答的作用。方法:重组RSV疫苗G1F/M2与CpG2216佐剂混合,或与CpG2216及常规佐剂Al(OH)3混合,鼻腔(i.n.)或腹腔注射(i.p.)免疫BALB/c小鼠三次,最后一次免疫后2周杀小鼠,取脾细胞,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测脾细胞特异性杀伤活性;用ELISPOT法检测分泌IFNγ-和IL-4的细胞;用流式细胞仪检测CD4+/CD8+效应及LDH记忆细胞。结果:与G1F/M2相比,CpG+G1F/M2鼻腔或腹腔注射免疫均诱导了显著的杀伤活性;而且G1F/M2+Al+CpG(i.p.)诱导的杀伤活性显著高于CpG+G1F/M2(i.p.)。ELISPOT结果显示:CpG+G1F/M2鼻腔免疫和腹腔注射免疫组的分泌IFNγ-和IL-4的淋巴细胞数量明显多于G1F/M2组;CpG+Al+G1F/M2(i.p.)组的细胞数显著多于CpG+G1F/M2(i.p.)组;且各组分泌IFNγ-的淋巴细胞数显著多于分泌IL-4的淋巴细胞,即均诱导了Th1型优势应答,有利于宿主抗病毒。流式细胞仪检测结果表明:CpG+G1F/M2(i.n.)仅诱导CD44+单阳性的细胞,而CpG+G1F/M2(i.p.)和CpG+Al+G1F/M2(i.p.)既诱导产生了CD44+单阳性细胞,也产生了CD44+CD62L+双阳性的记忆细胞。结论:CpG2216作为RSV重组疫苗G1F/M2的佐剂,可显著增强细胞免疫应答。     

鼠疫F1-V重组蛋白疫苗滴鼻免疫应答效果的研究

目的 以重组霍乱毒素B亚单位（rCT-B）为鼠疫F1-V重组蛋白的佐剂制备黏膜疫苗,观察小鼠诱导的黏膜免疫和系统免疫应答效果。方法以制备的鼠疫黏膜疫苗滴鼻免疫小鼠4次免疫后,采用间接ELISA检测血清特异性抗F1-V的IgG和IgA抗体及抗体亚型分类,检测鼻咽喉、肺、小肠及阴道灌洗液中特异性抗F1-V的黏膜分泌型IgA;采用流式细胞术检测鼻相关淋巴组织淋巴细胞、脾淋巴细胞、肠系膜淋巴结及小肠PP结T淋巴细胞表型的变化。结果以rCT-B为佐剂的鼠疫F1-V重组蛋白黏膜疫苗滴鼻免疫后,能够诱导血清中IgG、IgA抗体比正常对照组显著升高（P〈0．01）,同时诱导鼻咽、肺、小肠和阴道内特异性黏膜抗体升高,尤其是肺和生殖道冲冼液内抗体升高极为显著（P〈0．01）。与单纯的F1-V组相比,不同剂量比例疫苗组都能诱导较高、较快的血清IgG、IgA和黏膜sIgA,其中1：2疫苗组能诱导更强的系统免疫和黏膜免疫,但是相比之下,5：1疫苗组是最合适的免疫剂量。结论rCT-B佐剂不仅能提高鼠疫F1-V黏膜疫苗的系统全身免疫应答,还能促进诱导呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜sIgA抗体,增强局部免疫应答,提示rCT-B佐剂能显著提高鼠疫感染的免疫应答作用,这为下一步疫苗的免疫保护评价奠定了基础。